Desarrollo de un método para cuantificar vitaminas hidrosolubles de productos biotecnológicos por electroforesis capilar.

Transcripción

1 Desarrollo de un método para cuantificar vitaminas hidrosolubles de productos biotecnológicos por electroforesis capilar. SIP Introducción.-Una de las grandes dificultades en el desarrollo de las técnicas analíticas para detectar varias vitaminas simultáneamente es contar con métodos específicos, principalmente si estos métodos a utilizar se emplean para estudios de estabilidad y formulaciones. La farmacopea de los Estados Unidos en su edición 23 por primera vez, reporta técnicas oficiales para determinar vitaminas en suplementos nutricionales, la técnica reportada es por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). La electroforesis capilar es una técnica analítica de gran importancia, con gran auge en el mercado internacional utilizada en diversas áreas de investigación para la separación y cuantificación de moléculas pequeñas incluyendo iones metálicos, biomoléculas como aminoácidos, proteínas, péptidos, carbohidratos y macromoléculas como fragmentos de ADN. La electroforesis capilar comparada con otras técnicas analíticas ofrece ventajas por su alta resolución, bajo consumo de disolventes orgánicos y tiempos cortos de análisis. La electroforesis capilar es una técnica de separación basada en la velocidad de migración de las distintas especies cargadas bajo la acción de un campo eléctrico. Esta separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundida de un diámetro µm. El equipo consta además de una fuente de voltaje, un sistema de detección UV (algunos tienen arreglo de diodos) y un sistema de análisis que procesa los datos (Karat 32 Software y Hardware Gold) En el área farmacéutica esta técnica se puede utilizar en cada uno de los pasos de producción de los medicamentos: en la caracterización y control de las materias primas, cuantificación de los principios activos a lo largo del proceso de producción y en el producto final. Además durante el desarrollo y pruebas de nuevos medicamentos, en el monitoreo terapéutico de los principios activos y sus metabolitos (1) En la actualidad, la técnica ha sido aceptada en algunos métodos oficiales de análisis. Sin embargo, la utilización de la electroforesis capilar como técnica de análisis en rutina para resolver problemas analíticos es menor, esto se debe a la inercia de continuar utilizando técnicas analíticas ya establecidas. En esta propuesta de estudio se pretende mostrar la capacidad de la técnica para resolver problemas en las áreas de la salud y de investigación (análisis y cuantificación de vitaminas hidrosolubles). Muchas moléculas importantes en biología, poseen grupos ionizables y pueden tenerse en disolución en forma de especies con carga eléctrica, tanto como cationes (+) o como aniones (-). Los cationes se trasladan hacia el cátodo (-) y los aniones hacia el ánodo (+) a velocidades que dependen del equilibrio entre la fuerza impulsora del campo eléctrico sobre los iones cargados de la muestra y las fuerzas de retardo entre las moléculas que migran y el medio circundante, que son principalmente fuerzas de fricción electrostáticas. En la electroforesis capilar la separación se lleva a cabo cuando las moléculas que tienen cargas similares poseen distintas relaciones carga/masa, debido a diferencias de 1

2 peso molecular, estas diferencias producen una migración diferencial, cuando los iones en disolución se someten a un campo eléctrico. El material de la muestra debe estar disuelto o suspendido en algún disolvente miscible con agua (e.g. búfer) para que tenga efecto el fenómeno electroforético. La corriente se mantiene por todo el circuito ya que los electrodos, están sumergidos en viales que contienen búfer. En la Electroforesis Capilar Micelar, se añaden al búfer cantidades de surfactante o tensoactivo que exceden de la concentración micelar crítica a fin de obtener las respectivas micelas. Hasta ahora la mayoría de las aplicaciones los surfactantes que han sido más utilizados son dodecil-sulfato de sodio (DSS), bromuro de cetiltrimetilamonio (BCTA) y bromuro de dodeciltrimetilamonio (BDTA)(3). Objetivo. Desarrollar un método analítico para la determinación de las vitaminas hidrosolubles B1, B2, B6, B12 y C, por electroforesis capilar micelar, para aplicarlo en la determinación de formas farmacéuticas. Metodología. Las determinaciones se realizaron en un equipo de electroforesis capilar Beckman Culter P/ACE MDQ, con un detector UV, un capilar de sílice fundida de 60 cm de longitud y un diámetro interno de 75µm. Entre los reactivos utilizados se encuentran agua grado HPLC, las vitaminas: Tiamina hydrochloride (B1), Riboflavina (B2), Piridoxina (B6), Cianocabalamina (B12), Acido ascórbico (C), Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) y el Ácido Bórico las cuales fueron adquiridos del laboratorio Sigma Aldrich. Todos lo reactivos fueron de un alto grado de pureza. El buffer de boratos 30 mm fue filtrado con membranas millipore de 0.45µm Antes de cada corrida el capilar fue lavado con H 2 O, NaOH 0.1N y buffer de boratos, durante 5 min cada uno. Las muestras fueron inyectadas a 0.5 psi por 10s, el voltaje de separación aplicado fue de 28Kv. El buffer de corrida fue de boratos 30 mm con SDS 30 mm y un ph 8.8. Los estándares de cada vitamina fueron preparados a una concentración 0.1 mg/ml con H 2 O grado HPLC y posteriormente fueron filtrados. El análisis se realizó por triplicado. VALIDACIÓN DEL METODO Los parámetros analíticos que se validaron fueron linealidad, limites de detección y de cuantificación, precisión, exactitud y selectividad. Linealidad.- Para establecer el rango de linealidad del método se elaboró una curva de calibración mediante con soluciones estandar de cada vitamina con las concentraciones 0.1, 0.05, 0.025, , , , mg/ml. El análisis se realizó por triplicado. Las áreas obtenidas para cada concentración se procesaron estadísticamente, se determino el coeficiente de correlación y se aplicaron las pruebas de linealidad y proporcionalidad. Exactitud.- Se evaluó utilizando inyectable comerciales de multivitaminicos. 2

3 Precisión.- Este parámetro se determino mediante los ensayos de repetibilidad y reproducibilidad. Para evaluar la repetibilidad del método se prepararon tres soluciones de cada concentración las cuales se corrieron tres veces. Para evaluar la reproducibilidad se trabajo con una solución de cada concentración, cada una de las cuales se corrió tres veces y durante cinco días. Limites de detección y de cuantificación.- Se realizó posteriormente a la determinación del parámetro de linealidad, donde se aplicó una calibración lineal del tipo y = bx + a. Se utilizo para determinar dichos parámetros la medición de 3 soluciones de referencia de las vitaminas en estudio, tomando como patrón la concentración de 50% y dos concentraciones por debajo de esta 20 y 5%. El análisis se realizo por triplicado para cada concentración. Resultados y discusión.- Los resultados obtenidos se evaluaron estadísticamente calculando la media y la DER de las concentraciones; además se calculó la recta de regresión tomando como Y la respuesta y como X las concentraciones. Se definió la ecuación y se determinó la respuesta a concentración cero por extrapolación al origen de la recta calculada para cada una de las vitaminas estudiadas. Se realizaron los espectros individuales de los estándares de las vitaminas hidrosolubles, para la elección de la longitud de onda de trabajo que permita detectarlas. Evaluando los mismos se optó por la longitud de onda de 254 nm, donde todas las vitaminas a estudiar presentan buena absorción (Fig. 1). Según las propiedades de las moléculas y los datos obtenidos de la bibliografía se trabajo con un buffer con ph alcalino. Se preparo una mezcla con las 5 vitaminas hidrosolubles con una concentración final de cada una de 0.05mg/ml. Se realizaron corridas electroforéticas siempre con el mismo voltaje (28 kv), con un buffer de boratos 30mM y SDS 30 mm a un ph 8.8. Al trabajar con este buffer en los electroferogramas se observaron 5 picos bien resueltos. Como resultado del análisis de la linealidad del método analítico se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.99, en todas las vitaminas analizadas (Fig 6). Para la repetibilidad se realizaron 3 determinaciones de cada vitamina. Se obtuvo una buena separación de las diferentes vitaminas probadas con el método utilizado. Los resultados de análisis de tiempos de retención para cada vitamina se muestran en la figura 1. Los límites de detección obtenidos fueron de µg/ml en todas las vitaminas estudiadas. Regresiones de las vitaminas hidrosolubles Para determinar cada una de las vitaminas con la metodología ya referida se prosiguió a correr las diluciones de la muestra estándar (c = 0.1 mg/ml) de las cuales la mínima concentración detectada fue la dilución 5 (c = mg /ml = ug/ml) para las vitaminas B1, B2, B6, B12 y la dilución 6 (c = ) para la vitamina C. Una vez preparadas las diluciones se corrieron de la menor concentración a la mayor por triplicado (en algunas tablas solo se presentan los datos duplicados por cuestión de espacio y presentación) y se registraron los tiempos de detección, retención y el área de la curva detectada, los resultados son mostrados en las tablas 1, 2, 3, 4 y 5 para cada vitamina. 3

4 Posteriormente se grafico el área promedio (unidades de absorbancia AU ) de cada curva detectada para cada vitamina en el eje y la concentración de la dilución de esa curva en el eje x. De los datos graficados se realizo la regresión lineal para cada curva y se observo que el coefiiente de correlación fuera mayor a 0.98 como esta marcado en la FARMACOPEA. A continuación se muestran los resultados: Vitamina B1 Tiamina Tabla 1. Resultados obtenidos para las diluciones de tiamina B1 Dilución Concentración [mg/ml] (AU) (min) (AU) (min) D D D D D D ( = tiempo de detección, AU = Unidades de absorbancia) valor promedio de 6.14 min y = x R 2 = AU Concentracion Grafica 1. Análisis de linealidad para los datos de tiamina vitaminab1 4

5 Vitamina B2 Tabla 2. Resultados obtenidos para las diluciones de riboflavina B2 Dilución Concentración (AU) (AU) [mg/ml] D D D D D D AU y = 21E+06x R = Concentracion mg/ml Grafica 2. Análisis de linealidad de Riboflavina B2 5

6 Vitamina B6 Piridoxina Dilución Concentración mg/ml D D D D D D Area y = x R 2 = [mg/ml] Grafica 3. Análisis de linealidad de Piridoxina B6 6

7 Vitamina B12 Dilución Concentración [mg/ml] (AU) (AU) D D D D D D y = x R 2 = AU Concentración [mg/ml] 7

8 Vitamina C Dilución Concentración [mg/ml] D D D D D D D y = x R 2 = AU Concentracion Grafica 5. Análisis de linealidad de acido ascórbico Se realizaron los espectros individuales de los estándares de las vitaminas hidrosolubles, para la elección de la longitud de onda de trabajo que permita detectarlas. Evaluando los mismos se optó por la longitud de onda de 254 nm, donde todas las vitaminas a 8

9 estudiar presentan buena absorción (Graf. 6). Según las propiedades de las moléculas y los datos obtenidos de la bibliografía se trabajo con un buffer con ph alcalino. Se preparo una mezcla con las 5 vitaminas hidrosolubles con una concentración final de cada una de 0.05mg/ml. Se realizaron corridas electroforéticas siempre con el mismo voltaje (28 kv), con un buffer de boratos 30mM y SDS 30 mm a un ph 8.8. Al trabajar con este buffer en los electroferogramas se observaron 5 picos bien resueltos. Como resultado del análisis de la linealidad del método analítico se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.99, en todas las vitaminas analizadas (Fig 6). Para la repetibilidad se realizaron 3 determinaciones de cada vitamina. Se obtuvo una buena separación de las diferentes vitaminas probadas con el método utilizado. Los resultados de análisis de tiempos de retención para cada vitamina se muestran en la figura 6. Los límites de detección obtenidos fueron de µg/ml en todas las vitaminas estudiadas. Conclusiones y perspectivas. Los resultados de esta investigación indican que fue posible separar las vitaminas hidrosolubles B1, B2, B6, B12 y C, por electroforesis capilar micelar en las condiciones probadas, con una buena resolución, en tiempos cortos. Los resultados del análisis de linealidad del método para cada una de las vitaminas, cumplieron con los criterios de aceptación establecidos, hubo una relación lineal entre las concentraciones de las vitaminas estudiadas y las áreas obtenidas para cada una. Para la repetibilidad, 3 determinaciones de cada vitamina fueron realizadas para asegurar que el método es preciso y reproducible. La electroforesis capilar micelar como método analítico cumple con los parámetros de límite de detección y cuantificación, ya que nos permite detectar y cuantificar concentraciones bajas de las vitaminas estudiadas. La electroforesis capilar es un método analítico adecuado para la determinación de vitaminas hidrosolubles, ya que se obtuvieron picos finos, bien definidos y con buena resolución entre ellos. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, la técnica analítica propuesta para la determinación y cuantificación de las vitaminas hidrosolubles B1, B2, B6, B12 y C, por electroforesis capilar, es válida para obtener resultados satisfactorios de las vitaminas estudiadas, así se demuestra en los parámetros de linealidad, precisión, límites de detección, cuantificación y especificidad. Como método analítico es adecuado. Estos datos serán utilizados para determinar vitaminas hidrosolubles en formulaciones farmacéuticas. 9

10 UV - 254nm 02Vit mezcla 0.05mg-ml 09/04/ :10:11 PM Migration Time Area V C Ácido ascórbico. 4.4min V B2 Riboflavina. 4.1 min V B1 Tiamina. 5.4 min AU AU VB6 Piridoxina min VB12 Cianocobalamina 4.3min Minutes Graf. 6. Mezcla de vitaminas hidrosolubles y tiempos de retención de la tiamina (B1), riboflavina (B2), piridoxina (B6), cianocobalamina (B12) y ácido ascórbico (C). 10

11 Referencias. 1. Rivera, A.L., Vargas M., El uso de la electroforesis capilar en la industria farmacéutica, Parte II, Revista Mexicana de la Asociación Farmacéutica, Vol 34, pp Castillo, Lopez Fundamentos sobre electroforesis capilar UNAM. México 3. Heiger, High performance Capillary Electrophoresis.. 3ra Edición. Hewlett Packard Company, Francia. 4. Skoog, West. Holler, Crouch Cromatografía de gas- liquido de alta resolución Química Analítica, 4 ta Edición, Mc Graw - Hill, España. 5. Díaz, Fariñas Validación de un método analítico para la determinación de 3 vitaminas hidrosolubles en un suplemento vitaminico. Rev Cubana Farm 2000;34(2): Fernández, Egginger, Wainer, Lloyd. Separation of testosterone metabolites in microsomal incubates using a new capillary electrophoresis assay. Journal of Cromatography B, 667 (1996) Fotsing, Fillet, Bechet, Hubert, Crommen determination of six water-solubles vitamins in a pharmaceutical formulation capillary elecrophoresis. 11