TESIS DEFENDIDA POR Alicia Abadía Cardoso Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ

TESIS DEFENDIDA POR Alicia Abadía Cardoso Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ Dra. Yolanda Schramm Urrutia Codirector de Tesis Dr. Horacio Jesús de la Cueva Salcedo Codirector de Tesis Dra. Gisela Heckel Dziendzielewski Miembro del Comité Dr. Axayacatl Rocha Olivares Miembro del Comité Dr. Miguel Ángel del Río Portilla Miembro del Comité Dr. Juan Carlos Herguera García Coordinador del programa de posgrado en Ecología Marina Dr. Raúl Ramón Castro Escamilla Director de Estudios de Posgrado

17 de Abril de 2005 CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR DE ENSENADA PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA MARINA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL ELEFANTE MARINO DEL NORTE, Mirounga angustirostris, EN ISLA GUADALUPE, ISLAS SAN BENITO E ISLA DE CEDROS, MÉXICO TESIS que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS Presenta: ALICIA ABADÍA CARDOSO Ensenada, Baja California, México, Marzo de 2006

RESUMEN de la tesis de Alicia Abadía Cardoso, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de MAESTRO EN CIENCIAS en ECOLOGÍA MARINA con orientación en PROCESOS ECOLÓGICOS. Ensenada, Baja California. Marzo de 2006. VARIABILIDAD GENÉTICA DEL ELEFANTE MARINO DEL NORTE, Mirounga angustirostris, EN ISLA GUADALUPE, ISLAS SAN BENITO E ISLA DE CEDROS, MÉXICO Resumen aprobado por: Dr. Horacio Jesús de la Cueva Salcedo Codirector de Tesis Dra. Yolanda Schramm Urrutia Codirectora de Tesis Durante la primera mitad del siglo XIX el elefante marino del norte, Mirounga angustirostris, fue explotado exhaustivamente para la extracción de grasa, lo que provocó que se considerara extinto tres veces en ese siglo. En la actualidad se calcula que existen más de 127,000 individuos a lo largo de la costa oeste del hemisferio norte del continente americano. Los estudios genéticos realizados en esta especie han demostrado una variabilidad genética baja resultado de un cuello de botella. Estos estudios se han centrado en las colonias de California, Estados Unidos. Sin embargo, es en Isla Guadalupe donde quedó una pequeña colonia remanente y la recolonización fue hacia otras islas como San Benito y Cedros y hacia el norte, en Estados Unidos. M. angustirostris tiene una estrategia reproductiva muy particular, presenta una fuerte filopatria y es altamente poligínica. Debido a estas características y a su forma de dispersión, se podría esperar una variabilidad mayor en los individuos de Isla Guadalupe, Islas San Benito e Isla de Cedros en comparación a lo reportado para las colonias de California. Por lo tanto, se investigó la variabilidad genética de M. angustirrostris en las principales colonias de México, a partir de secuencias de la región control del DNA mitocondrial (mtdna). Se emplearon 204 muestras de piel de crías destetadas que fueron recolectadas en invierno de 2005. Se analizaron 148 secuencias de un segmento de 407 pares de bases (pb) de longitud, que resultaron en sólo dos haplotipos presentes en las islas estudiadas. A pesar del éxito que han tenido estos organismos para recolonizar áreas a lo largo de su distribución, el presente estudio demuestra que la diversidad genética ha disminuido y al parecer todos los animales actuales representan únicamente una porción reducida del reservorio genético existente antes del cuello de botella. Los resultados obtenidos revelan la importancia de Isla Guadalupe en la variabilidad genética de la especie, ya que presenta los valores más altos

para los índices de diversidad haplotípica (h = 46.5% ± 3.7) y nucleotídica ( n = 0.46% ± 0.29) en comparación a las otras colonias de México (h = 29.1%, n = 0.28%) y de Estados Unidos (h = 41%, n = 0.41%). El análisis del índice de fijación de Wright (F ST ) indicó la existencia de estructura poblacional entre las colonias de México (F ST = 0.046; p= 0.042). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas al comparar las colonias de México y las de Estados Unidos (F ST = 0.016, p= 0.095). La cacería intensa tuvo un efecto en la reducción de la variabilidad genética de M. angustirostris. No obstante, la evidencia indica que M. angustirostris tenía una baja variabilidad antes del cuello de botella. Por un lado, la evidencia molecular en comparaciones con otras especies (Mirounga leonina y Arctocephalus townsendi) muestra que la variabilidad de M. angustirostris antes del cuello de botella era reducida. Por otro lado, aunque el registro fósil es escaso, la historia biogeográfica del género Mirounga podría apoyar esta hipótesis. Estos resultados corroboran que un cuello de botella puede reducir la variabilidad genética de cualquier especie, pero los efectos se amplifican cuando la variabilidad previa al cuello de botella es baja per se como en el caso de M. angustirostris. Palabras clave: Mirounga angustirostris, región control, mtdna, variabilidad genética, haplotipo, cuello de botella.

ABSTRACT of the thesis presented by Alicia Abadía Cardoso as a partial requirement to obtain the MASTER OF SCIENCE degree in MARINE ECOLOGY with ECOLOGICAL PROCESSES orientation. Ensenada, Baja California, Mexico. Marzo, 2006. NORTHERN ELEPHANT SEAL, Mirounga angustirostris, GENETIC VARIATION AT GUADALUPE, SAN BENITO AND CEDROS ISLANDS, MÉXICO Mirounga angustirostris was heavily hunted for its blubber during the first half of the nineteenth century. Thus, this species was considered extinct three times during that century. Nowadays the species numbers around 127,000 individuals distributed along the west coast of the North America. Genetic studies on this species have shown a low genetic variation due to an extreme bottleneck. These studies have focused on the California, U.S.A. colonies. However, at the time of presumed extinction, a small colony remained at Guadalupe Island and the re-colonization started from there towards San Benito Islands and Cedros Island, and afterwards to the north in the U.S.A. M. angustirostris exhibits a strong phylopatric and highly polygynic reproductive strategy. Because of these and its mode of dispersal, a higher variability could be expected at Guadalupe, San Benito, and Cedros Islands when compared to that reported for the California colonies. Therefore, M. angustirostris genetic variability was studied at the main Mexican colonies with mitochondrial DNA (mtdna) control region sequences. Two hundred and four skin biopsies were collected from weaned pups during winter 2005. One hundred and forty eight sequences of a 407 base pair (bp) fragment were analyzed. Only two haplotypes were present at the studied colonies. Despite the re-colonization success of M. angustirostris along its distribution range, the present study demonstrates that genetic variation has diminished, and presumably all the extant animals represent a reduced portion out of the pre-bottleneck genetic pool. These results reveal the importance of Guadalupe Island for the species genetic variability; it showed the highest haplotype (h = 46.5% ± 3.7) and nucleotide ( n = 0.46% ± 0.29) diversity indexes compared with other Mexican (h = 29.1%, n = 0.28%) and U.S.A. (h = 41%, n = 0.41%) colonies. The Wright fixation index (F ST ) showed population structure between the Mexican colonies (F ST = 0.046; p= 0.042). Nevertheless, no significant differences were found between Mexican and U.S.A. colonies (F ST = 0.016, p= 0.095). The intense hunting reduced the M. angustirostris genetic variability; nonetheless evidence indicates that M. angustirostris had a low variability before the bottleneck. Comparisons with other species (M. leonina and Arctocephalus townsendi) show that pre-bottleneck M. angustirostris variability was small. On the other hand, even though there is a limited fossil record, Mirounga s biogeographic history could support this hypothesis. The present results confirm that the genetic variability of any species could be reduced due to a bottleneck, but this effect is amplified when the pre-bottleneck variability is low per se, as in M. angustirostris. Key words: Mirounga angustirostris, control region, mtdna, genetic variability, haplotype, bottleneck.

A Fernando y Alicia, mis padres.

La problemática de la genética de poblaciones es la descripción y explicación de la variación genética dentro y entre poblaciones. Theodosious Dobzhansky (1900-1975)

Agradecimientos A CICESE y CONACyT por el apoyo económico. Al Instituto Nacional de Ecología, al Marine Mammal Center y a Frances Gulland por el financiamiento del proyecto. A la SCPP Pescadores Nacionales de Abulón por el apoyo logístico durante el muestreo en las Islas San Benito y Cedros. A Daniel Guzmán por el apoyo durante el muestreo en Isla de Cedros. Al Grupo de Ecología y Conservación de Islas (GECI), a la SCPP de Isla Guadalupe y a la Secretaría de Marina por el apoyo durante el muestreo en Isla Guadalupe. A la Dra. Yolanda Schramm (Universidad Autónoma de Baja California) y el Dr. Horacio de la Cueva por cumplir con todo lo que se espera de un director de tesis y más, y por enseñarme lo que significa la búsqueda de la verdad. Especialmente a Yoli por la paciencia, la disponibilidad y la calidad con la que me explicó todo lo que es hacer genética, desde como usar una micropipeta, seguir una receta de cocina, hacer un gel, hasta emocionarse conmigo por los resultados obtenidos. A mis sinodales el Dr. Axayacatl Rocha, la Dra. Gisela Heckel y el Dr. Miguel Ángel del Río por aceptar ser parte del comité, por sus comentarios y correcciones para mejorar esta tesis. A mis maestros por enseñarme la importancia de la ciencia y la ecología, y ayudarme a entender que todo depende de la escala. A Rodrigo por ayudarme en el muestreo en las Islas San Benito y Cedros. A Concha, Lups y Rodrigo por su ayuda en el muestreos de Isla Guadalupe.

Al Dr. Jorge de la Rosa por dejarme ocupar un lugar en el laboratorio de Ecología Molecular de la Universidad Autónoma de Baja California. A Simona Sanvito y Filippo Galimberti por compartir conmigo su interés por los elefantes marinos y enseñarme como tomar las biopsias. A Luis Enríquez por su gran ayuda con los programas de cómputo y la interpretación de los resultados. A Antonio Trujillo por explicarme la estadística tan clara y concisamente. A Claudio Uribe por el diseño de la presentación en pps. A Rodrigo Beas por su apoyo incondicional, por su compañía, por su ayuda con la escritura de la tesis y por estar ahí siempre que lo necesité. A mis abuelos que aunque estaban lejos estuvieron siempre al pendiente de todo. A mis papás Fernando y Alicia por ayudarme y apoyarme en todo momento para alcanzar mis metas. Los quiero mucho.

CONTENIDO Página I. Introducción... 1 1. Generalidades... 1 2. Distribución... 2 3. Ciclo reproductivo... 3 4. Historia de explotación y recuperación... 5 5. Características del DNA mitocondrial... 8 6. Variabilidad genética en pinnípedos... 10 7. Variabilidad genética de Mirounga angustirostris... 13 II..Hipótesis...... 17 III. Objetivos... 17 IV. Área de estudio... 18 - Isla Guadalupe... 18 - Islas San Benito... 19 - Isla de Cedros... 20 V. Materiales y métodos... 22 1. Trabajo de campo... 22 2. Trabajo de laboratorio... 22 2.1. Extracción del DNA... 22 2.2. Amplificación... 23 3. Procesamiento de datos... 26 3.1. Alineamiento... 26 3.2. Identificación de haplotipos... 26 3.3. Diversidad haplotípica y nucleotídica... 27 3.4. Neutralidad... 28 3.5. Estructura poblacional... 29 VI. Resultados... 32 1. Identificación de haplotipos y frecuencias haplotípicas... 32 2. Diversidad genética y neutralidad... 35 3. Estructura poblacional... 36 VII. Discusión... 39 VIII. Conclusiones 52 IX. Literatura citada 54 X. Apéndice I 60

LISTA DE TABLAS Tabla Página I Variabilidad genética en especies de pinnípedos utilizando mtdna. 12 II Variabilidad genética de M. leonina y de M. angustirostris. 12 III Frecuencias haplotípicas de la región control. Las muestras del s. XIX incluyen todas las muestras colectadas en 1892 y antes. Cinco del s. XIX, una anterior al s. XVIII y 115 de los animales modernos fueron tomados de Weber et al. (2000). Los dos haplotipos de los 185 animales modernos fueron definidos a partir de 3 sitios variables (196, 214 y 224 de Hoelzel et al., 1993a) con secuencia de 300 pb. Los haplotipos de los animales del s. XIX, XVIII y previos fueron definidos por los mismos 3 sitios variables con secuencias de 116 pb. Dos de las muestras pre-s. XVIII presentaron 2 sitios variables más (225 y 235 de Hoelzel et al., 1993a). 14 IV Condiciones del termocioclador para las amplificaciones. 25 V Diseño experimental estadístico para el AMOVA. 30 VI Secuencias de los fragmentos de la región hipervariable I de la región control del mtdna de los Haplotipos A y B, en dirección 5 a 3. La segunda columna muestra la posición del primer nucleótido de cada fila. El sitio 1 equivale al 16,307 del genoma mitocondrial de la foca de puerto, Phoca vitulina (Árnason y Johnsson, 1992). En negirtas se muestran los sitios variables en las secuencias de los dos haplotipos encontrados. Nótese la presencia de una tranversión en el sitio 250. 33 VII Frecuencias haplotípicas en cada uno de los sitios de muestreo. 33 VIII Índices de diversidad genética para cada una y el total (TOTAL MX) de las colonias de México evaluadas, y para los datos reportados en Weber et al. (2000) (Islas San Miguel y San Nicolas) y Hoelzel et al. (1993a) (Isla Año Nuevo). 35 IX Resultados del AMOVA para las colonias analizadas en este estudio. 36 X Valores de F ST en comparaciones pareadas entre las 3 localidades evaluadas (cuadrante superior), y sus valores correspondientes de p (cuadrante inferior), los cuales se calcularon por medio de 16,000 permutaciones al azar. 37

Tabla LISTA DE TABLAS (continuación) Página XI Valores de F ST en comparaciones pareadas entre Isla Guadalupe e Islas San Benito y Cedros, como una sola colonia (cuadrante superior), y sus valores correspondientes de p (cuadrante inferior), los cuales se calcularon por medio de 16,000 permutaciones al azar. 37 XII Valores de F ST en comparaciones pareadas entre las 4 localidades. 38 XIII XIV Haplotipos encontrados durante la búsqueda bibliográfica de los reportes para las colonias de Estados Unidos. Se señala el nombre del haplotipo (Hap.) por orden de aparición mencionado en el texto, la fuente y la ubicación de los sitios variables en la secuencia. Los puntos indican que la base no cambia con respecto a la primera secuencia y el guión (-) corresponde a un indel (inserción o deleción). 42 Variabilidad genética a partir de la región control del mtdna entre A. townsendi y M. angustirostris antes y después del cuello de botella. 49

LISTA DE FIGURAS Figura Página 1 Distribución histórica de las colonias reproductivas de elefantes marinos del norte en Estados Unidos y México (tomado de Le Boeuf y Laws, 1994). 6 2 Principales dominios de la región control del DNA mitocondrial de mamíferos (Taberlet, 1996; citado por Avise, 2000). Existen dos regiones variables dentro de la región control, que flanquean una región más conservada. En uno de los dominios variables, se encuentran tres o dos zonas de secuencias conservadas (CBS: conserved sequence blocks). 10 3 Polígono correspondiente al área de distribución de Mirounga angustirostris durante la temporada reproductiva. Se muestran los nombres de las colonias donde se han realizado trabajos genéticos de la especie (islas Año Nuevo, San Miguel y San Nicolás) y el presente estudio (islas Guadalupe, San Benito y Cedros). 16 4 Localización de las áreas de estudio. Guadalupe (28 50 y 29 12 N y los 118 13 y 118 22 O); Islas San Benito (28 18 y 28 21 N, 115 22 y 115 32 O); Isla de Cedros (28 02 y 28 22 N y los 115 08 y 115 22 O) 21 5 A) Principales dominios de la región control del DNA mitocondrial de mamíferos (Taberlet, 1996; citado por Avise, 2000). Existen dos regiones variables dentro de la región control, que flanquean una región más conservada. En uno de los dominios variables, se encuentran tres o dos zonas de secuencias conservadas (marcado con bandas negras). Se muestran los sitios variables y las zonas donde se unen los cebadores Tro y Dxx (tomado de Schramm, 2002). B) Secuencias de los cebadores Tro y Dxx. 24 6 Mapa de la distribución de las frecuencias de los dos haplotipos (A y B) reportados por este y otros trabajos. Se presentan los datos obtenidos por Hoelzel et al. (1993a) para la colonia de M. angustirostris de Isla Año Nuevo que corresponde a la distribución más norteña y de Weber et al. (2000) correspondientes a la distribución centro (Islas San Miguel y San Nicolas). Las áreas de muestreo de este estudio representan el límite sur de distribución de la especie (Islas Guadalupe, San Benito y Cedros). 34

INTRODUCCIÓN 1. Generalidades Mirounga angustirostris (Gill, 1866), el elefante marino del norte, pertenece al Suborden Pinnipedia del Orden Carnivora (Berta y Sumich, 1999). Pinnipedia deriva del latín pinna (aleta) y pedis (pie) (Tollu, 1986). El grupo de los pinnípedos se distingue por presentar miembros anteriores y posteriores en forma de aleta y un cuerpo fusiforme que facilita su desplazamiento en agua. A diferencia de otros mamíferos marinos, los pinnípedos viven en dos ambientes: la alimentación se realiza en el mar y la reproducción en la tierra o el hielo (Riedman, 1990). Debido a su naturaleza anfibia, los pinnípedos han desarrollado una gran variedad de adaptaciones para subsistir tanto en tierra o hielo y en ambientes acuáticos. El mayor costo energético para adaptarse al océano de estos animales homeotermos-endotérmicos y que respiran aire es quizás la habilidad escasa para su movilidad en tierra y, por tanto, la vulnerabilidad ante los depredadores terrestres (King, 1983). El grupo de los pinnípedos se subdivide en tres familias: Phocidae, Otariidae y Odobenidae. Las diferencias morfológicas entre estos grupos son evidentes, como también su comportamiento y sistemas de reproducción (Berta y Sumich, 1999). Los otáridos tienen dimorfismo sexual, su estrategia reproductiva es similar entre especies, son extremadamente gregarios y el destete ocurre después de varios meses e incluso años. En el caso de los fócidos el sistema reproductivo es más variable y difícil de categorizar. Algunos fócidos son monógamos temporales y monomórficos como la foca anillada, Pusa hispida (Schreber, 1775), la foca del Baikal, P. sibirica (Gmelin, 1788) y la foca de Largha, Phoca

2 largha (Pallas, 1811). Otros fócidos son altamente poligínicos y extremadamente dimórficos (Boness y Bowen, 1996). M. angustirostris pertenece a esta última categoría. Los machos de esta especie tienen probóscide móvil, una longitud total de 4 a 5 m y un peso de 2 a 2.5 ton; las hembras son más pequeñas, miden de 2 a 3 m y pesan alrededor de 750 kg. El color en los machos es gris oscuro, pero después de las mudas y durante el crecimiento se torna café grisáceo. Las hembras tienen un color café generalmente más claro que el de los machos. En ambos sexos el pelo es corto, rígido y áspero (King, 1983). 2. Distribución Mirounga angustirostris se distribuye en islas oceánicas del Pacífico nororiental, donde se sitúan las colonias grandes y en algunas localidades a lo largo de las costas de California, Estados Unidos, donde las colonias son más pequeñas. Generalmente están en playas de arena y grava y en algunas ocasiones cohabitan con el lobo marino de California, Zalophus californianus (Riedman, 1990). En México se localizan en islas de la costa occidental de la Península de Baja California (Bartholomew, 1950): en las Islas Coronados, Isla San Martín, Isla Guadalupe, Islas San Benito, Isla de Cedros e Isla Natividad (Le Boeuf y Laws, 1994). El ciclo anual de los elefantes marinos del norte ha sido descrito por Le Boeuf y Laws (1994) para la colonia de la Isla Año Nuevo y se divide en cuatro etapas principales: la temporada reproductiva, la muda de hembras y juveniles, la muda de machos y la etapa de juveniles. La temporada reproductiva comienza a principios de diciembre con la llegada de los machos adultos a las playas de reproducción y con la disminución rápida en la cantidad de juveniles. Las hembras gestantes comienzan su arribo a mediados de diciembre y dejan

3 la isla a principios de marzo; los machos adultos regresan al mar a finales de ese mes. Al tiempo que la última hembra finaliza la lactancia, las hembras que parieron en diciembre comienzan a llegar para la etapa de muda (que dura un mes aproximadamente) a mediadosfinales de marzo junto con juveniles (de 1 a 4 años de edad) de ambos sexos. Para entonces los machos adultos y los destetados ya dejaron las playas. Junio, julio y agosto son los meses con menor cantidad de individuos en la isla. Para la muda los machos subadultos llegan a principios del verano seguidos de los machos adultos. En agosto comienzan a llegar los juveniles que, en su mayoría, son inmigrantes de islas más sureñas y no presentan muda de pelaje. Durante las primeras semanas de septiembre la mayoría de los machos adultos han dejado tierra y migrado para alimentarse abundantemente de calamares y peces. Los machos subadultos comienzan a llegar a mediados de noviembre y los primeros machos adultos a principios de diciembre (Le Boeuf y Laws, 1994). La mayoría de los animales migra después de la temporada reproductiva y de muda hacia aguas oceánicas del Pacífico noroccidental y al Golfo de Alaska (Jefferson et al., 1993). 3. Ciclo reproductivo En California, el patrón general de comportamiento reproductivo comienza con la llegada de los machos a las playas a principios de diciembre. Los machos dominantes se retan y pelean. Ayunan durante toda la temporada reproductiva (King, 1983) y pierden hasta 4 kg diarios. Este comportamiento tiene como consecuencia que los machos de jerarquías más bajas no tengan acceso a las hembras (Le Boeuf y Laws, 1994). La duración de la etapa de gestación es de nueve meses, sin embargo, existe una implantación retardada del blastocisto de aproximadamente dos meses (King, 1983), lo que

4 sincroniza el ciclo reproductivo de todas las hembras de la colonia, favorece la reproducción a intervalos regulares anuales, por lo que permite el nacimiento y destete de las crías durante la temporada del año más adecuada (Riedman, 1990). Las hembras arriban a mediados de diciembre y durante los siguientes días se integran a grupos que pueden llegar a conformarse desde 2 hasta 350 hembras llamados harenes (King, 1983). Al igual que los machos, las hembras de un harén mantienen jerarquías, las más experimentadas se encuentran cerca del macho dominante y las más jóvenes en la periferia, en donde son constantemente acosadas por machos de menor rango jerárquico y subadultos (Le Boeuf y Laws, 1994). Las hembras de elefante marino tienen una sola cría por temporada y la lactancia dura de 25 a 28 días (Le Boeuf y Laws, 1994), después de la cual las crías son destetadas abruptamente al alcanzar un peso de alrededor de 150 kg (Le Boeuf et al., 1972). El estro ocurre poco antes del destete (King, 1983). Al finalizar este tiempo las hembras regresan al mar para alimentarse intensivamente hasta abril o mayo, cuando regresan a mudar el pelaje; posteriormente vuelven al mar para no regresar a las zonas de reproducción hasta la siguiente temporada reproductiva (King, 1983). García-Aguilar (2004) observó que en la Isla San Benito del Oeste la duración de la temporada reproductiva de elefantes marinos fue 100 días y el día medio de llegada de hembras fue el 19 de enero (temporadas 2001-02 y 2002-03). Varios censos realizados en diferentes islas (San Miguel, San Nicolás, Guadalupe, San Benito y Cedros) demuestran que la proporción sexual al nacimiento es de 1:1 (Le Boeuf et al., 1972).

5 4. Historia de explotación y recuperación En 1866, Mirounga angustirostris fue reconocida como una especie taxonómicamente diferente al elefante marino del sur, M. leonina (Gill, 1866). A principios y mediados del siglo XIX, M. angustirostris fue explotada exhaustivamente para la extracción de grasa, lo que provocó que se considerara extinta tres veces en ese siglo. Desde principios de 1800 hasta 1860 existió la caza de M. angustirostris en las islas de California (Scammon, 1870), sin embargo, hay pocos registros de esta cacería (Le Boeuf y Laws, 1994). Después de varias expediciones a las áreas de reproducción de M. angustirostris (Fig. 1) entre 1840 y 1865, cientos de animales fueron sacrificados y, por primera vez, la especie se consideró extinta (Townsend, 1885). Algunos individuos fueron vistos y cazados a finales de 1870 en las Islas San Benito y Guadalupe, México; una década más tarde se descubrió un grupo de 335 animales en Bahía San Cristóbal, Baja California (Fig. 1). Este grupo fue exterminado durante los siguientes 4 años por expediciones regulares anuales, siendo ésta la segunda extinción aparente. Tres años más tarde, en 1883, se encontraron y mataron 80 elefantes en Isla Guadalupe y otros cuatro en 1884. No fue sino hasta 1892 cuando se observaron ocho elefantes en Isla Guadalupe, siete de los cuales fueron recolectados para el Museo Smithsoniano. Con esta matanza la especie se creyó extinta por tercera vez (Townsend, 1912; Anthony 1924). En 1911, en Isla Guadalupe se encontró una vez más un grupo de M. angustirostris y los coleccionistas siguieron sacrificándolos; diez individuos fueron colectados y aproximadamente 125 se dejaron en las playas (Townsend, 1912). Debido a los pocos individuos restantes y a que el gobierno mexicano decretó a la Isla Guadalupe como reserva para la protección y conservación de los elefantes marinos y los lobos finos en 1922 (D.O.F. 16 de Agosto de 1928), la caza fue disminuyendo y a partir de esta etapa el

6 número de M. angustirostris se ha incrementado extraordinariamente (Le Boeuf y Laws, 1994). La Isla Guadalupe es muy importante en la historia de la conservación, ya que fue el primer lugar en donde México decretó este tipo de reserva (Gallo-Reynoso et al., 2003). Figura 1. Distribución previa al cuello de botella de las colonias reproductivas de elefantes marinos del norte en Estados Unidos y México (tomado de Le Boeuf y Laws, 1994). En 1975, año en el que entró en vigor en México la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES), la especie se incluyó en la lista del Apéndice I, la cual comprende a las especies en mayor riesgo de

7 extinción y su comercialización está completamente prohibida. Debido a su rápida recuperación, durante las reuniones de esta convención en 1979 se cambió al Apéndice II (en menor peligro y comercio controlado) y fue hasta enero de 1992 cuando la especie fue borrada de las listas (UNEP-WCMC Species Database: CITES-Listed Species, 2006). En la actualidad M. angustirostris está protegida en los Estados Unidos bajo el Marine Mammal Protection Act de 1972 (Administration of the MMPA of 1972, 1973). En México, se encuentra en la categoría de especie amenazada dentro de la Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2001 (SEMARNAT, 2002), la cual está fundada en la Ley General de Vida Silvestre (Cámara de diputados, 2000). Adicionalmente, el Código Penal Federal, en su artículo 420, tipifica como delito ambiental e indica pena de uno a nueve años de prisión y por el equivalente de trescientos a tres mil días multa, a quien ilícitamente capture, dañe o prive de la vida a algún ejemplar de mamíferos marino, o recolecte o almacene de cualquier forma sus productos o subproductos (SEGOB, 2004). Las estimaciones de la abundancia total de la población de M. angustirostris son escasas. Los primeros censos publicados después del cuello de botella son inconsistentes en la temporada en que fueron realizados, la clase de edad de los individuos y en algunos casos hubo la omisión de avistamientos. Hanna (1925) reportó 264 individuos en Isla Guadalupe en un censo realizado en verano en 1922. Los primeros avistamientos en otras islas fueron recopilados y reportados por Bartholomew y Hubbs (1960). Se registraron los primeros individuos en las Islas San Benito en 1918, en Isla San Miguel en 1925, en Coronados y Santa Barbara en 1948, en Isla San Nicolas en 1949 e Isla Año Nuevo en 1955. Las Islas San Benito fueron reportadas como colonia reproductiva en los treintas, Isla San Miguel, Santa Barbara e Isla San Nicolas en los cincuentas y en 1961 la Isla Año Nuevo

8 (Bartholomew y Boolootian, 1960; Radford et al., 1965; Odell, 1971). Bartholomew y Hubbs (1960) estimaron 13,000 individuos en 1957 y aproximadamente 15,000 individuos tres años más tarde. Existen censos particulares para diferentes colonias, pero el censo total de M. angustirostris más reciente de Stewart et al. (1994) señala 127,000 individuos aproximadamente. 5. Características del DNA mitocondrial Son diversas las técnicas que se han aplicado al análisis de la variabilidad genética en poblaciones de pinnípedos. Estas técnicas varían en nivel de resolución, formas de evolución y exposición a presiones de selección del organismo (Hoelzel, 1997). El genoma mitocondrial en organismos pluricelulares consiste en una molécula circular de doble cadena de DNA con una longitud de 15,000-19,000 pb (Hoelzel y Dover, 1991). El mtdna codifica para 37 genes, de los cuales 24 codifican para la maquinaria de trascripción del mismo mtdna (22 RNAs de transferencia y dos RNAs ribosomales). Los 13 genes restantes codifican para subunidades de la cadena de transporte de electrones, donde los carbohidratos y las grasas se oxidan para generar dióxido de carbono, agua y ATP (Ballard y Whitlock, 2004). La replicación y la transcripción se inician en la región control donde están presentes algunas regiones que no se transcriben (Figura 2; Hoelzel y Dover, 1991). El mtdna evoluciona de 5 a 10 veces más rápido que el DNA nuclear y, gracias a esta tasa alta, el polimorfismo es más fácilmente detectable que en proteínas o en DNA nuclear. Esta molécula se hereda matrilinealmente, por tanto, representa únicamente la filogenia materna, permitiendo una comprensión directa de los patrones de dispersión maternos. Este patrón

9 de herencia uniparental hace a la molécula más sensible a fluctuaciones en el tamaño de la población (Berta y Sumich, 1999). Muchos aspectos de la estructura o la dinámica de las poblaciones pueden determinarse con estudios a partir de secuencias de segmentos de mtdna. Los límites geográficos de la distribución de una especie, las tasas de migración, subdivisiones en una población y estimaciones del tamaño efectivo pueden ser estimados por medio del análisis de mtdna. Sin embargo, uno de los usos más importantes de esta molécula es la determinación de identidad de especies o estructura de linajes en muchas especies en peligro de extinción o bajo manejo (Berta y Sumich, 1999). Los análisis de variabilidad genética del mtdna se concentran en gran medida a la región control (en mamíferos ~1000 pb), debido a que es una zona hipervariable del genoma mitocondrial (Figura 2). Es decir, la tasa de mutación es mayor en la región control (Avise, 2000) y, por lo tanto, proporciona mayor información útil para distinguir entre organismos cercanamente relacionados (Schramm, 2002). Figura 2. Principales dominios de la región control del DNA mitocondrial de mamíferos (Taberlet, 1996; citado por Avise, 2000). Existen dos regiones variables dentro de la región control, que flanquean una región más conservada. En uno de los dominios variables, se encuentran tres o dos zonas de secuencias conservadas (CBS: conserved sequence blocks).

10 6. Variabilidad genética en pinnípedos Algunos taxa de mamíferos marinos tienen a sus crías en la tierra o el hielo como es el caso de los pinnípedos y el oso polar (Ursus maritimus). Estas especies están muy vinculadas a la zona de reproducción y el hábitat adecuado es limitante. De esta forma, Los límites de distribución, la filopatria y los sistemas reproductivos parecen ser especialmente importantes en formar la estructura genética poblacional en estas especies (Hoelzel et al., 2002a). Otro factor importante para muchos de los mamíferos marinos es la historia de cacería intensa e indiscriminada para la obtención de productos como pieles y aceites, dando como resultado cuellos de botella críticos en muchas especies, reducción en la distribución y extinciones locales (Hoelzel et al., 2002a). Las actividades antropogénicas como la cacería o destrucción del hábitat usualmente resultan en reducciones sustanciales del tamaño de la población (cuello de botella poblacional) y pérdida de la variabilidad genética (cuello de botella genético). Algunas de las consecuencias de los cuellos de botella observados o inferidos son la disminución de la diversidad genética y la reducción de la heterocigocidad (Hartl y Clark, 1997; Hedrick, 2000). Las consecuencias de los cuellos de botella genéticos varían de especie a especie y son frecuentemente reflejo de factores demográficos, aunque se ha sostenido que la variación genética es esencial para la vitalidad y persistencia de una población (Caro y Laurenson, 1994; Hedrick, 1996; O Brien 1994; O Brien et al., 1987). Algunas especies fueron afectadas a tal grado que sus poblaciones han permanecido reducidas por mucho tiempo después de que la caza fuera suspendida (Hoelzel et al., 2002a). En el caso de M. angustirostris se considera que ocurrió un cuello de botella durante el siglo XIX, debido a la historia de su cacería (Hoelzel et al., 1993a).

11 Entre otáridos y fócidos podemos encontrar diferencias notables en cuanto a su historia de vida, lo que afectará la estructura de la población y, en consecuencia, las necesidades de manejo. En las especies poligínicas, el nivel de la poliginia y la dispersión de los individuos tienen una fuerte influencia en el nivel de variación genética dentro y entre poblaciones. La poliginia reduce la variabilidad genética porque el número efectivo de la población (machos adultos reproductivos) es menor. Las diferencias en el comportamiento de dispersión pueden afectar el alcance y el patrón de la subdivisión de la población (Hoelzel, 1997). Se han realizado varios estudios sobre la variabilidad genética en diversas especies de pinnípedos (Tabla I) y algunas comparaciones intragenéricas (M. angustirostris vs. M. leonina) (Tabla II). Los resultados arrojados por estos estudios genéticos han mostrado que la variabilidad molecular de la especie norteña es menor que la de otras especies y evidentemente más escasa que en la sureña.

12 Tabla I. Variabilidad genética en especies de pinnípedos utilizando mtdna. Nombre común Especie Haplotipos/ Individuos Sitios variables /Sitios totales (%) Porcentaje de diversidad nucleotídica Lobo fino de Juan Fernández Arctocephalus philippii 13/28 39/313(12.5) 3.0 Lobo fino de Guadalupe A. townsendi 7/25 18/313(5.7) 2.0 Lobo fino de la Antártica A. gazella 25/47 58/291(19.9) * Lobo fino Sudamericano A. australis 4/5 39/297(13.3) 7.8 Lobo fino de Sudáfrica A. pusillus 3/4 2/287(0.7) 0.4 Lobo fino de Nueva Zelanda A. forsteri 16/17 40/276(14.5) 5.1 Lobo fino del norte Callorhinus ursinus 4/5 17/280(5.90) 2.7 Lobo marino de Steller Eumetopias jubatus 52/224 29/238(12.2) * Lobo marino de California Zalophus californianus 11/40 29/319(9.2) * Lobo marino australiano Neophoca cinerea 1/5 0/289(-) 0.0 Lobo marino del sur Otaria bryonia 4/5 5/288(1.7) 0.8 Lobo marino de Nueva Zelanda Phocarctos hookeri 4/6 3/286(1.0) 0.4 Foca de puerto Phoca vitulina 34/277 40/453(8.8) 3.28 Foca monje de Hawaii Monachus schaunislandi 3/50 2/359(0.6) 0.7 Elefante marino del sur Mirounga leonina 26/48 26/300(8.7) * Elefante marino del norte M. angustirostris 2/40 3/300(1.0) 0.43 (Hoelzel et al., 2002a) * No hay datos disponibles Tabla II. Variabilidad genética de Mirounga leonina y de M. angustirostris. Especie mtdna Alozimas Mirounga leonina M. angustirostris Número de haplotipos 24 (28) 2 (40) H 0.034 (100) 0 (226) P 0.114 0 Microsatélites (M2b) No. alelos 9 (40) 2 (37) H 0.875 0.167 MHC (DQB) No. alelos 7 (34) 2 (63) H 0.676 0.381 (Hoelzel, 1999) H: heterocigocidad; P: proporción de loci polimórficos; MHC (DQB): Complejo principal de histocompatibilidad clase II, DQB locus; (#): número de individuos.

13 7. Variabilidad genética de Mirounga angustirostris El primer estudio sobre la variabilidad genética en M. angustirostris se publicó en 1974 por Bonnell y Selander. En ese trabajo se evaluó el nivel de polimorfismo con 21 proteínas codificadas por 24 loci y se encontró que todas las proteínas eran monomórficas. En el estudio realizado por Hoelzel et al. (1993a) se examinaron muestras de tres colonias de California, Estados Unidos y, una vez más, no se encontró variación en alozimas en 43 loci, lo que confirmó una reducción dramática de la variabilidad en comparación con otras especies. En el mismo estudio se realizó un análisis de la región control del mtdna de 40 individuos de Isla Año Nuevo, California. En el segmento de 300 pb se encontraron dos haplotipos definidos a partir de tres sitios variables (Hoelzel et al., 1993a). En cambio, se analizaron 48 muestras de M. leonina y se encontraron 23 haplotipos. Weber et al. (2000) compararon la región control de mtdna de individuos que vivieron antes y después del cuello de botella (siglo XIX), y, se confirmó la existencia de dos haplotipos (los mismos reportados por Hoelzel et al., 1993a) en 109 individuos muestreados en los noventas. En contraste, para cinco muestras de huesos datados previos al cuello de botella se reportaron cuatro haplotipos, tres de los cuales eran diferentes a los actuales. Los resultados obtenidos en ese estudio confirman el decremento en la diversidad genotípica entre las poblaciones que vivieron hace aproximadamente 1000 años y las actuales (Weber et al., 2000). Hoelzel et al. (2002b) analizaron 11 muestras de cráneos del siglo XIX, todas colectadas en Isla Guadalupe o islas cercanas, e incluyeron cinco muestras más de Weber et al. (2000). Además, evaluaron seis muestras (una tomada de Weber et al., 2000) datadas entre el siglo XV y el XVIII (antes del cuello de botella) colectadas en sitios arqueológicos de Isla San

14 Miguel. Al amplificar la región control del mtdna encontraron siete haplotipos en los 22 individuos analizados: cinco haplotipos en las muestras de los sitios arqueológicos (uno de los actuales reportados en Hoelzel et al., 1993a, y cuatro más) con cinco sitios variables, mientras que, con las muestras del siglo XIX encontraron igualmente cinco haplotipos, los dos reportados en Hoelzel et al. (1993a), dos iguales a los reportados para las muestras presiglo XVIII y uno diferente a todos (Tabla III). Estos datos demuestran que la variabilidad genética antes y, principalmente, durante el cuello de botella del siglo XIX en Isla Guadalupe y algunas colonias cercanas era considerablemente mayor a lo reportado hasta el momento, y que todas las muestras que se habían secuenciado de animales modernos provenían de la distribución media y norte de M. angustirostris, es decir, de colonias de California, Estados Unidos y lejanas a Isla Guadalupe (Fig. 3). Tabla III. Frecuencias haplotípicas de la región control. Las muestras del s. XIX incluyen todas las muestras colectadas en 1892 y antes. Cinco del s. XIX, una anterior al s. XVIII y 115 de los animales modernos fueron tomados de Weber et al. (2000). Los dos haplotipos de los 185 animales modernos fueron definidos a partir de 3 sitios variables (196, 214 y 224 de Hoelzel et al., 1993a) con secuencia de 300 pb. Los haplotipos de los animales de los ss. XIX, XVIII y previos fueron definidos por los mismos 3 sitios variables con secuencias de 116 pb. Dos de las muestras pre-s. XVIII presentaron 2 sitios variables más (225 y 235 de Hoelzel et al., 1993a). Haplotipo GTA GAA GAG AAG AAA GAAGC GAGGT Modernos 50 0 0 135 0 0 0 s. XIX 7 5 2 1 1 0 0 Pre-s. XVIII 1 2 1 0 0 1 1 (Hoelzel et al., 2002b)

15 Una comparación entre las muestras de los 109 animales modernos del sur de California en las Islas Channel (Weber et al., 2000) y 40 animales modernos de Isla Año Nuevo en California central (Hoelzel et al., 1993a) exhibe frecuencias haplotípicas de mtdna casi idénticas para los dos haplotipos encontrados, lo que sugiere que no hay una estructura genética en ese ámbito geográfico (Hoelzel et al., 2002b). Hasta la fecha no existen trabajos que evalúen la variabilidad en el mtdna en M. angustirostris para las colonias de México, por esta razón, el presente trabajo evalúa la variabilidad genética en las tres colonias más importantes de México e investiga las posibles diferencias entre los resultados obtenidos y los datos reportados para Estados Unidos.

Figura 3. Polígono correspondiente al área de distribución actual de Mirounga angustirostris durante la temporada reproductiva. Se muestran los nombres de las colonias donde se han realizado trabajos genéticos de la especie (islas Año Nuevo, San Miguel y San Nicolás) y el presente estudio (islas Guadalupe, San Benito y Cedros). 16

17 HIPÓTESIS Debido a que la población remanente después del intenso cuello de botella que experimentó la especie se encontró en Isla Guadalupe y la recolonización se dio hacia Isla de Cedros y San Benito y después hacia el norte, la variación en la región control del mtdna de Mirounga angustirostris es mayor en las colonias de Isla Guadalupe, Isla de Cedros e Islas San Benito en comparación con los trabajos reportados para Estados Unidos. OBJETIVOS - Determinar el nivel de variación en el mtdna de M. angustirostris en las islas Guadalupe, San Benito y Cedros. - Establecer si existen diferencias entre las colonias de la Isla Guadalupe, las Islas San Benito y la Isla de Cedros y con relación a lo reportado para las colonias de Estados Unidos.

18 ÁREA DE ESTUDIO Isla Guadalupe La Isla Guadalupe mide 35 km de largo por 9 de ancho y está localizada en la parte más occidental de México entre los 28 50 y 29 12 N y los 118 13 y 118 22 W (Fig. 3). Por su origen volcánico, edad de 7 millones de años y distancia de 260 km de la Península de Baja California ha desarrollado evolutivamente un alto grado de endemismos de flora y fauna terrestre y marina (alberga alrededor de 150 especies nativas y, por lo menos, 30 especies endémicas; Moran, 1999). En México existen cuatro especies de pinnípedos, dos fócidos (el elefante marino del norte, Mirounga angustirostris y la foca de puerto, Phoca vitulina richardsi) y dos otáridos (el lobo marino de California, Zalophus californianus y el lobo fino de Guadalupe, Arctocephalus townsendi). En la Isla Guadalupe habitan tres de estas especies: A. townsendi, Z. californianus y M. angustirostris. Arctocephalus townsendi sólo se reproduce en la parte este de la isla. La población de lobo marino se encuentra representada mayormente en el sur, en el Islote Zapato y un menor número de animales en el Cantil Blanco en la parte norte de la isla. Los elefantes marinos se pueden encontrar en mayores concentraciones en la parte noroeste de la Isla. La isla cuenta con cerca de 30,000 individuos en el punto máximo del período reproductivo (enero-febrero) y estos números se han mantenido estables al menos durante los últimos 30 años (Gallo-Reynoso et al., 2003).

19 Islas San Benito Las Islas San Benito se localizan a 27 km al noroeste de la Isla de Cedros (entre 28 18 y 28 21 N, 115 22 y 115 32 W), en la región central de la costa occidental de la Península de Baja California (Fig. 3). El complejo insular de San Benito tiene un área total de 6.4 km 2 y está conformado por tres islas volcánicas que reciben su nombre de acuerdo a su posición longitudinal: San Benito del Este, San Benito del Centro y San Benito del Oeste. Ninguna de las islas está habitada permanentemente, sin embargo, en la isla del Oeste existe un campamento pesquero establecido por la SCPP Pescadores Nacionales de Abulón S. C. de R. L., que entre los meses de octubre a marzo puede albergar más de 100 personas (García- Aguilar, 2004). En las Islas San Benito es posible encontrar las cuatro especies de pinnípedos presentes en México. Éstas se distribuyen diferencialmente en las tres islas: En la Isla San Benito del Este se encuentran Z. californianus y Arctocephalus townsendi. M. angustirostris se encuentra en algunas playas orientadas hacia el suroeste. La Isla San Benito del Centro está poblada por Z. californianus en las zonas rocosas de la región noreste, mientras que M. angustirostris ocupa las playas de la región nor-noroeste. En la Isla San Benito del Oeste M. angustirostris se encuentra en playas de casi todo el perímetro de la isla, excepto en la porción rocosa del oeste, lugar que ocupa Z. californianus. Aunque Phoca vitulina no forma colonias en estas islas, es posible observar grupos pequeños en las islas del Este y del Oeste. Las concentraciones abundantes de M. angustirostris ocurren durante el invierno (diciembre-febrero), mientras que Z. californianus y A. townsendi son abundantes en el verano (junio-agosto) (García-Aguilar, 2004).

20 Isla de Cedros La Isla de Cedros se localiza a 24 km al noroeste de Punta Eugenia, en la Bahía de San Sebastián Vizcaíno, Baja California, entre los 28 02 y 28 22 N y los 115 08 y 115 22 W (Fig. 3). Llamada también Humalagua Isla de la niebla, tiene forma triangular y está orientada de Sur a Norte, con una longitud de 34 km y un ancho máximo de 14 km y mínimo de 4. Esta isla es parte de una prolongación fisiográfica al noroeste de la Sierra de San Andrés y probablemente es el resultado de la inmersión y emergencia durante el Pleistoceno de una antigua cadena montañosa continua, el Complejo San Andrés-Cedros, que data del Cretácico (López-Ramos, 1985). Las colonias de M. angustirostris se encuentran distribuidas hacia la zona norte de la isla, cerca del campamento pesquero, llamado Punta Norte, establecido por de la Sociedad Cooperativa de Producción Pesquera (SCPP) Pescadores Nacionales de Abulón S. C. de R. L. En esta zona se pueden encontrar playones de cantos rodados donde se establecen los harenes de M. angustirostris y se mezclan con Zalophus californianus.

Figura 4. Localización de las áreas de estudio en el Pacífico occidental mexicano. Isla Guadalupe (28 50 y 29 12 N y los 118 13 y 118 22 W); Islas San Benito (28 18 y 28 21 N, 115 22 y 115 32 W); Isla de Cedros (28 02 y 28 22 N y los 115 08 y 115 22 W). 21

22 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Trabajo de campo 1.1. El muestreo en las Islas San Benito e Isla de Cedros se realizó del 28 de enero al 4 de febrero de 2005. Durante ese tiempo, se tomaron un total de 115 muestras de piel de crías destetadas de Mirounga angustirostris: 30 en Isla de Cedros, 50 en San Benito del Centro y 35 en San Benito del Oeste. Las muestras de tejido se tomaron de la membrana entre el primero y el segundo dedo de la aleta posterior (corte de piel de 0.1 a 0.2 g) y conservadas con etanol al 70%. Se utilizaron unas pinzas cortadoras especiales para el marcado de ganado que fueron desinfectadas con alcohol después de tomar cada biopsia. Las muestras se colocaron en tubos Eppendorf etiquetados con el número de muestra, el sexo del individuo, la isla y la playa a la que pertenecían. Se roció la herida del animal con violeta de genciana (Tanox) para reducir el riesgo de infección. 1.2. Se tomaron 89 muestras en Isla Guadalupe del 15 al 19 de febrero de 2005, siguiendo la misma metodología. 2. Trabajo de laboratorio 2.1. Extracción de DNA El protocolo utilizado para la extracción de DNA genómico se basó en el Manual y guía corta de Palsbøll (1991; no publicado). Dicho protocolo es una modificación al procedimiento habitual de la extracción fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989). La extracción de DNA se realizó a partir de un promedio de 20 mg de tejido. Cada muestra se

23 maceró por separado con navajas de afeitar comunes. Posteriormente el tejido se mantuvo en digestión durante 18 hrs a temperatura ambiente y con movimiento horizontal bajo la acción de 20 μl de proteinasa K (10 mg/ml, SIGMA o Gibco BRL) en 400 μl de solución amortiguadora (buffer) de extracción [0.1 M NaCl, 10 mm Tris-HCl ph= 8, 1 mm ácido etileno diamino tetracético (EDTA)] y 40 μl de dodecil, sulfato de sodio (SDS) al 10%. Se hicieron extracciones con 400 μl de fenol equilibrado, posteriormente 200 μl de fenol equilibrado y 200 μl de cloroformo:isopentil-alcohol (24:1) y dos extracciones más con 400 μl de cloroformo:isopentil-alcohol (24:1). El DNA se precipitó en frío en 50 μl 3.0 M NaOAC (ph 4.8) y 1 ml de etanol al 100% (-4 C). Después, se lavó en 500 μl de etanol al 70% y se secó el DNA por evaporación a 37 C. Por último, se resuspendió por una hora a 37 C en 400 μl de TE (10 mm Tris-HCl, ph= 8, 1 mm EDTA). El tamaño, calidad y concentración de los productos de las extracciones se corroboraron por medio de electroforesis (5 μl, 35 min a 80 volts) en gel de agarosa al 1%, teñidos con Bromuro de etidio (EtBr; 10 mg/ml), con amortiguador de carga Azul de bromofenol. Fueron visualizados con luz UV (onda corta: 254 nm) y comparadas con un marcador de peso molecular de 1000 pb (Invitrogen TM ). 2.2. Amplificación Se amplificó el fragmento que comprende la región hipervariable de la región control del mtdna (Fig. 5A), de 204 muestras por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizaron los cebadores para mamíferos Tro y Dxx (Fig. 5B). Estos cebadores fueron diseñados por el grupo de Ecología Molecular del Centro de Ciencia Pesquera del Suroeste (Southwest Fisheries Science Center) de La Jolla, California. La reacción en

24 cadena de la polimerasa se realizó en un termociclador Perkin Elmer 480. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μl que contenía de 15 a 20 ng de DNA genómico, 1X de solución amortiguadora para Taq DNA polimerasa (Gibco-BRL) que contiene Tris- HCl 20 mm, ph = 8.4 y KCl 50 mm. Además, MgCl 2 3 mm (Gibco-BRL) dntp (datp, dttp, dctp, dgtp) 200 μm de cada uno, cada cebador a concentración final de 0.3 μm y una unidad de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL). Las condiciones del termociclador para la amplificación se muestran en la Tabla IV. A B Tro: 5 -CCT CCC TAA GAC TCA AGG -3 Dxx: 3 -GTA GAC CAA AGA ATG AAG TCC -5 Figura 5. A) Principales dominios de la región control del DNA mitocondrial de mamíferos (Taberlet, 1996; citado por Avise, 2000). Existen dos regiones variables dentro de la región control, que flanquean una región más conservada. En uno de los dominios variables, se encuentran tres o dos zonas de secuencias conservadas (marcado con bandas negras). Se muestran los sitios variables y las zonas donde se unen los cebadores Tro y Dxx (tomado de Schramm, 2002). B) Secuencias de los cebadores Tro y Dxx.