Genotipado en la salud humana. Informe de Vigilancia Tecnológica

Genotipado en la salud humana Informe de Vigilancia Tecnológica

Genotipado en la salud humana Diagnóstico predictivo Farmacogenómica Desarrollo de nuevos fármacos Informe de Vigilancia Tecnológica

GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología (CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional de la Innovación MADRID+D. Genoma España y la Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), agradecen la colaboración ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial para la realización de este informe, en especial a: Dr. Ángel Carracedo Álvarez (Universidad de Santiago de Compostela) Dr. Jaume Bertranpetit Busquets (Universitat Pompeu Fabra) Dr. Javier Benítez Ortiz (CNIO) Dr. Juan Carlos Tercero López (PharmaMar) Dr. avier Estivill Palleja (Centre de Regulació Genòmica) La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Genotipado en la salud humana. Informe de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM. Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo. Copyright:Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica/Fundación General de la Universidad Autónoma de Madrid. Autores: Marta López (CIBT) Paloma Mallorquín (CIBT) Miguel Vega (Genoma España) Edición: Silvia Enríquez (Genoma España) Referencia: GEN-ES05003 Fecha: Abril 2005 Depósito Legal: M-18733-2005 ISBN: 84-609-4800-5 Diseño y realización: Spainfo, S.A. 4

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Índice de contenido RESUMEN EJECUTIVO 7 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL INFORME 8 2. INTRODUCCIÓN AL GENOTIPADO 9 3. VARIACIÓN GÉNICA: SNPS 10 4. APLICACIONES DEL GENOTIPADO DE SNPs DE ALTO RENDIMIENTO 14 4.1. Diagnóstico predictivo 17 4.2. Farmacogenética y farmacogenómica 18 4.2.1. Ensayos de predicción de efectos secundarios o toxicidad 22 4.2.2. Ensayos de eficacia mediante farmacogenómica 25 4.2.3. Identificación de nuevos pacientes 27 4.3. Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos 29 5. ESTRATEGIAS DE IDENTIFICACIÓN DE SNPs 34 6. TÉCNICAS DE GENOTIPADO DE SNPs 37 6.1. Amplificación de SNPs 37 6.2. Discriminación alélica 38 6.2.1. Hibridación específica de alelo 39 6.2.2. Minisecuenciación o extensión de sondas (SBE) 39 6.2.3. Ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo (OLA) 39 6.2.4. Rotura invasiva específica de alelo (Invader ) 39 6.2.5. Otros métodos de discriminación alélica 39 6.3. Formatos de reacción 41 6.3.1. Reacciones homogéneas 41 6.3.2. Reacciones en un soporte sólido 43 6.4. Mecanismos de detección 45 6.5. Otras tecnologías de genotipado 46 6.5.1. Pirosecuenciación 46 6.5.2. Miniaturización 46 7. PLATAFORMAS COMERCIALES DE GENOTIPADO DE SNPs DE ALTO RENDIMIENTO 48 5

8. BARRERAS EN LA IMPLANTACIÓN DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADO DE ALTO RENDIMIENTO 51 8.1. Coste final de implantación de la tecnología 52 8.2. Limitaciones tecnológicas en el genotipado de alto rendimiento de SNPs 53 8.3. Aspectos de mercado relativos al genotipado de SNPs 54 8.4. Aspectos reguladores 54 9. OPORTUNIDADES DE MERCADO DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADO DE ALTO RENDIMIENTO (INCENTIVOS) 56 9.1. Déficit de innovaciones de producto 56 9.2. Disminución del tiempo necesario para desarrollar un nuevo fármaco 56 9.3. Combinación de fármacos/tests de diagnóstico 56 10. TENDENCIAS FUTURAS DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADO 58 11. CENTRO NACIONAL DE GENOTIPADO (CEGEN) 62 12. CONCLUSIONES 65 ANEOS Anexo I. Proyectos españoles en genotipado de SNPs y farmacogenómica 68 Anexo II. Marco regulador en farmacogenómica 80 Anexo III. Fichas de empresas relacionadas con el genotipado de SNPs 82 REFERENCIAS 93 GLOSARIO 95 6

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Resumen ejecutivo El genoma del ser humano es un 99,9% idéntico entre individuos, la diferencia del 0,1% se compone de más de 2 millones de variaciones denominadas polimorfismos, la mayoría SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), que consisten en cambios puntuales en los nucleotidos o unidades estructurales que componen el ADN. Estos cambios puntuales tienen una enorme relevancia ya que son responsables, entre otros, de la respuesta concreta de un paciente a un tratamiento o la aparición de una enfermedad. Una vez que el Proyecto Genoma Humano ha alcanzado su objetivo, la secuenciación de nuestro genoma, la segunda fase consiste en el denominado proyecto HapMap, cuyo objetivo es identificar estos polimorfismos y asociarlos a enfermedades prevalentes. Correlacionando esas variantes con la incidencia de enfermedades, se podrá dar un salto adelante en la identificación de genes de susceptibilidad a numerosas enfermedades (diagnóstico predictivo), y respuesta al tratamiento con distintos fármacos (farmacogenómica). Por otro lado, el desarrollo de nuevos fármacos se beneficiaría del uso de técnicas de genotipado durante las fases clínicas, en las cuales sería posible identificar pacientes con mayor probabilidad de éxito frente a un fármaco, y con riesgo de sufrir efectos secundarios debidos al tratamiento. Hasta hace relativamente poco tiempo el estudio de los SNPs era considerado una utopía por su alto coste y la falta de una tecnología apropiada. Actualmente existen numerosas plataformas en el mercado que permiten el genotipado de SNPs a gran escala con un coste cercano al 1 céntimo de por SNP, capaces de obtener datos de millón y medio de estos SNP diariamente. Las principales barreras relativas a la implantación de tecnologías de genotipado de alto rendimiento consisten en el coste de los estudios de genotipado, la segmentación del mercado, y la escasa regulación por parte de las agencias del medicamento. No obstante, la agencia europea (EMEA) y la americana ya están trabajando en el desarrollo de protocolos que permiten introducir el genotipado de los pacientes sometidos a ensayos clínicos y terapias. 7

1. Introducción y objetivos del informe El objetivo del presente informe pretende realizar un análisis de las aplicaciones de las tecnologías de genotipado en salud humana, haciendo especial hincapié en las ventajas que presentan frente a las técnicas moleculares clásicas. Por otro lado, se describen las principales tecnologías de genotipado de SNPs de alto rendimiento, destacando aquellas técnicas que se emplean de forma habitual en las plataformas comerciales disponibles en la actualidad. La segunda parte del informe recoge un análisis acerca de las principales barreras relativas a la implantación de tecnologías de genotipado, así como las oportunidades de mercado, tendencias y estrategias futuras más relevantes. 8

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA 2. Introducción al genotipado El genoma consiste en el conjunto de genes que especifican todos los caracteres que pueden ser expresados en un organismo, y la genómica por tanto es la disciplina que se encarga del estudio de estos genes y su expresión. El proyecto Genoma Humano nació como un esfuerzo internacional con el objetivo de identificar los genes que configuran nuestro patrimonio genético, así como las proteínas formadas a partir de la información presente en el genoma y la función de cada una de ellas en el organismo. En 1991 surge oficialmente el Proyecto Genoma Humano con la idea de finalizar la secuenciación del genoma humano para el año 2020. Durante los primeros años se desarrollaron estrategias que permitieron ir identificando genes y su posición relativa en el genoma (mapas genéticos) para posteriormente realizar un análisis más detallado mediante la identificación de la secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN (mapas físicos). A partir de 1998, una vez ordenado el genoma o la mayoría del mismo, comenzó la segunda etapa, consistente en descifrar los 3.000 millones de bases (unidades constituyentes del ADN) que configuran el ADN. Esto fue posible gracias al desarrollo técnico experimentado en esos años, principalmente de la mano de las nuevas tecnologías moleculares tales como la secuenciación y la informática 1. La conclusión del Proyecto Genoma Humano en abril del 2003 puso de manifiesto la necesidad de afrontar nuevos desafíos. Entre estos desafíos el más inmediato consistía en elaborar un mapa de variaciones genéticas humanas comunes dirigidas a acelerar la búsqueda de genes que contribuyen al cáncer, diabetes, enfermedad del corazón, esquizofrenia y muchas otras condiciones comunes. Las estrategias empleadas en la elaboración de estos mapas son fundamentalmente tres: las técnicas proteómicas, técnicas de genotipado y análisis de los perfiles de transcripción. Mientras que las primeras son herramientas que se emplean en el estudio del conjunto de proteínas que se pueden obtener a partir del genoma, las terceras consisten en el análisis de los procesos que activan en un determinado momento los genes. En cuanto a las técnicas de genotipado, estas se centran en el estudio de la diversidad genética mediante el análisis de las variaciones existentes en el genoma entre individuos y poblaciones. El propósito del presente informe reside en evaluar las técnicas de genotipado actualmente disponibles, así como las barreras y oportunidades que se avecinan para la industria farmacéutica. ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN GÉNICA Proteómica Genotipado Análisis de la expresión génica > 100.000 proteínas > 10 millones de variaciones en el genoma < 25.000 genes Fig. 1. Estrategias de análisis de la variación génica mediante técnicas genómicas y proteómicas. Fuente: elaboración propia. 1 Benítez Ortiz, J. (2002). El genoma humano: aplicaciones en la práctica pediátrica. Vox Paediatrica, 10, 1 (7-12). 9

3. Variación génica: SNPs El genoma de un individuo se organiza en cromosomas, los cuales contienen genes o unidades de herencia, formados a su vez por secuencias de ADN, molécula que contiene y transmite la información genética. El ADN está compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de sí mismas para formar una doble hélice. Cada cadena está formada por millones de bloques químicos llamados bases. El ADN solamente contiene cuatro bases diferentes designadas por las letras A, T, G y C, cuyo orden secuencial determina el mensaje para un gen concreto. Menos del 0,1% del genoma humano es variable entre los distintos individuos. Las formas más frecuentes de variación del ADN se denominan SNPs o Polimorfismos 2 de una sola base, que consisten en sustituciones de una base por otra. Cada una de las formas variantes de un gen o de un marcador particular como pueden ser los SNPs, se denominan alelos. Por tanto, diferentes alelos de un gen producen variaciones en las características hereditarias. Individuo A A T T C A G C G Individuo B A T T C A C C G Fig. 2. Polimorfismo genético: SNP. Fuente: Pharmacogenomics. A Strategic Market Outlook and Business Analisis. Front Strategic Consulting, INC. 2003. Los SNPs están presentes en el genoma humano con una frecuencia de uno por cada 1.000 pares de bases. Son, por tanto, diferentes de las mutaciones, que aparecen con menor frecuencia y en la mayoría de los casos se encuentran asociadas a enfermedades hereditarias. El interés inicial de los SNPs consistía en la utilidad de éstos para determinar la susceptibilidad de padecer una determinada enfermedad. Por ejemplo, en el gen Apo E, se han mapeado cuatro millones de bases buscando marcadores de susceptibilidad en pacientes que padecieran la enfermedad de Alzheimer. De esta forma, se han podido localizar aquellos SNPs asociados con la aparición de la enfermedad, y que por tanto podrían utilizarse como indicadores de susceptibilidad o como métodos de confirmación del diagnóstico una vez que se producen los primeros síntomas 3. condiciones ambientales pueden afectar a la función génica. Aproximadamente el 80% de los SNPs reside en regiones no codificantes, es decir, regiones no relacionadas con secuencias que contienen la información esencial para la expresión de un gen. Sin embargo, el 20% restante podría estar relacionado con variaciones genéticas de algún gen de interés. Por tanto, existen miles de variaciones genéticas que contribuyen directamente a la diversidad estructural genética del ser humano. Para definir la frecuencia de estas variaciones en las distintas poblaciones se pusieron en marcha diversos proyectos de secuenciación a gran escala, como el Proyecto Genoma Humano, así como proyectos de genotipado a gran escala en los que participan numerosos países como es el caso del Proyecto HapMap 4, actualmente vigente. En principio los polimorfismos no alteran el fenotipo o características visibles de un organismo, si bien es cierto que en determinadas Uno de los frutos del proyecto Genoma Humano ha sido el descubrimiento de millones de variantes de secuencias de SNPs en el genoma 2 Polimorfismo genético: Existencia de múltiples variantes de un gen (por tanto de la proteína que codifica) que debe existir al menos en el 1% de la población. En el ADN humano aproximadamente 1 de cada 20-500 nucleótidos es polimorfo, es decir varía de un individuo a otro. 3 García Alonso, Fernando. Siglo I: desafíos científicos y sociales. Capítulo 3: Farmacología y Genética. Pág. 37-43. 4 International HapMap Project (http://www.hapmap.org/index.html.en). 10

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA humano. La mayoría de estas variantes son SNPs, lo que supone una oportunidad para estudiar la base genética de enfermedades complejas por medio de estudios de población 5. Hasta la fecha se han identificado más de 9 millones de SNPs de los que han sido validados y depositados en bases de datos públicas unos cinco millones 6. Aunque existen otros tipos de polimorfismos genéticos también presentes en abundancia en el genoma tales como repeticiones de fragmentos de secuencias no codificantes, éstos no presentan la misma utilidad que los SNPs como marcadores en mapas genéticos 7. Ventajas de los SNPs frente a otros polimorfismos genéticos: Presentes en el genoma con alta frecuencia: 1 SNP cada 1.200 pares de bases (aproximadamente 10 millones distribuidos por todo el genoma). Menos susceptibles de presentar mutaciones en la línea germinal, lo que significa que su herencia es más estable. Pueden estar presentes dentro de las zonas de regulación de los genes, por lo que podrían ser los responsables directos de las características de interés. La sustitución de una base por otra generalmente sólo permite que existan dos posibles combinaciones (A-T, C-G), lo que facilita la estimación estadística de su incidencia en la población. Estas modificaciones de una sola base en la secuencia de ADN o SNPs, pueden ocurrir en los genes que contienen la información necesaria para el funcionamiento de receptores, proteínas transportadoras o enzimas metabolizantes de fármacos, por lo que pueden dar lugar a una patología así como alteraciones en el metabolismo de medicamentos. Presencia de SNPs Receptores SNP Consecuencia de los SNPs Sin relevancia Proteínas transportadoras de fármacos A A G C C C G G Causantes de enfermedad Enzimas metabolizantes de fármacos Alteraciones en el metabolismo de fármacos Fig. 3. Presencia de SNPs en el genoma y efectos en el organismo. Fuente: Wieczorek, S. J.; Tsongalis, G. J. (2001). Pharmacogenomics: will it change the field of medicine? Clinica Chimica Acta 308, 1 8. 5 Kwok, Pui-Yan (2001). Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235-58. 6 HapMap Project Data (http://www.hapmap.org/downloads/index.html.en). Single Nucleotide Polymorphism database, dbsnp; (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp): base de datos pública de SNPs y otros polimorfismos mantenida por el National Center for Biotechnological Information (NCBI). H-Invitational Database, H-InvDB, Japón; (http://h-invitational.jp): base de datos online, de acceso libre, que recoge la mayoría de las funciones de los genes humanos. Proyecto colaborativo que participan más de 150 científicos de 40 instituciones y empresas de todo el mundo. The SNP Consortium, TSC. (http://snp.cshl.org): consorcio entre compañías farmacéuticas, bioinformáticas y centros públicos de investigación para la creación de un mapa de dominio público de SNPs existentes en genoma humano. 7 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics. Current Opinion in Chemical Biology 4:440 444. 11

Genotipado de SNPs La genética busca correlacionar la variación en la secuencia de ADN con las diferencias fenotípicas o características visibles de un individuo. Hasta la fecha, se han conseguido grandes avances a la hora de relacionar fenotipos característicos con variaciones en un solo gen. Sin embargo, la mayoría de los fenotipos, incluidas las enfermedades más comunes y las respuestas variables a los fármacos, tienen un origen complejo en el cual se ven involucrados múltiples factores genéticos (los genes y sus productos) y no genéticos (factores ambientales). Para desentrañar este grado de complejidad es necesaria una completa descripción de la variación genética en el genoma humano, así como el desarrollo de herramientas analíticas que permitan emplear esta información para comprender la base genética de las enfermedades 8. El análisis de SNPs es la forma más sencilla de determinar la existencia de polimorfismos del ADN. La mayoría de los SNPs conocidos hasta hace un par de años habían sido identificados a partir de proyectos de secuenciación como el Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, aunque las técnicas de secuenciación son muy efectivas a la hora de identificar SNPs, su elevado coste y lentitud no hacen recomendable este tipo de técnica para su uso como plataforma de genotipado a gran escala 9. Características de un ensayo de genotipado ideal: Ensayo sencillo y rápido. Bajo coste del ensayo en términos de reactivos y tiempo. Reacciones robustas. Análisis sencillos, automatizados y precisos. Ensayo flexible y escalable, capaz de desarrollar desde unos pocos cientos a millones de ensayos por día. Sin embargo, no existe un método de genotipado ideal que pueda ser de utilidad en todas las aplicaciones clínicas de los SNPs. Por este motivo, los retos a los que se enfrenta en la actualidad la comunidad científica consisten en incrementar la velocidad del proceso, reducir el coste de los ensayos y desarrollar múltiples ensayos en paralelo (multiplexado), realizando mejoras en la bioquímica, ingeniería y software analítico. La consecución de este tipo de mejoras permitirían además elaborar mapas de SNPs de alta densidad, es decir, mapas de gran precisión en los cuales la distancia entre los marcadores o SNPs sería mínima. Estos mapas de SNPs de alta densidad, secuencialmente ordenados gracias a la información proporcionada por los datos del Proyecto Genoma Humano, podrían ser empleados para identificar nuevos perfiles genéticos asociados a la eficacia de fármacos o a reacciones adversas de medicamentos. El primer experimento que avaló esta hipótesis se realizó sobre una región del genoma relacionada con la susceptibilidad de padecer la enfermedad de Alzheimer. Esta técnica se ha utilizado para identificar genes de susceptibilidad en pequeñas regiones identificadas en mapas de ligamiento para varias enfermedades tales como migraña con aura, psoriasis y la enfermedad de Crohn 10. 8 Collins, F. S. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature Vol 422, 24 April. 9 Freimuth, R. R.; et al. (2004). High-throughput genotyping methods for pharmacogenomics studies. Curr. Pharmacogenomics, 2, 21-33. 10 Roses, A. D. (2002). Genome-based pharmacogenetics and the pharmaceutical industry. Nature Reviews. Drug discovery, Vol. 1, July, 541-549. 12

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Las estrategias de genotipado aplicadas a la salud humana son actualmente posibles fundamentalmente debido a tres factores 11 : Disminución del coste en el genotipado a gran escala debido a grandes avances tecnológicos. Disponibilidad de un gran número de SNPs como potenciales marcadores moleculares. Nuevos métodos estadísticos para analizar los datos procedentes del genotipado y detectar asociaciones entre fenotipos. Otras técnicas complementarias al genotipado de SNPs aplicado a la salud humana son las técnicas proteómicas. La identificación de ARN y marcadores de proteínas para el screeening, diagnóstico, pronóstico y monitorización de enfermedades requieren del acceso a tejidos afectados por la patología. Estas muestras se someten posteriormente a estudios de análisis de la expresión génica 12 para clasificar el tipo de patología, siendo el cáncer la enfermedad más estudiada hasta el momento mediante esta estrategia. Debido a que las proteínas sufren modificaciones que no vienen determinadas en su secuencia de ADN pero que pueden resultar determinantes para el desarrollo de la enfermedad, el uso de herramientas proteómicas también es necesario en el descubrimiento de marcadores moleculares asociados a patologías. Algunas de las tecnologías proteómicas empleadas pueden ser geles bidimensionales de electroforesis, espectrometría de masas o herramientas bioinformáticas 13. Las técnicas de genotipado se detallan en el punto 6 del presente informe. 11 Hosford, D. A. (2004). Pharmacogenetics to predict drug-related adverse events. Toxicologic pathology, 32 (suppl. 1): 9-12. 12 Expresión génica: proceso por el cual todos los organismos transforman la información codificada en los ácidos nucleicos en las proteínas necesarias para su desarrollo y funcionamiento (Fuente: Glossary of Genetic Terms, NHGRI; http://www.genome.gov/sglossary.cfm). 13 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496. 13

4. Aplicaciones del genotipado de SNPs de alto rendimiento La aplicación inmediata derivada de las técnicas de genotipado de SNPs es la medicina personalizada o a la carta, que consiste en el diseño de terapias individualizadas en base al genotipo de cada individuo. La variación genética permitiría por tanto estudiar la predisposición del ser humano a desarrollar ciertas enfermedades y las diferentes respuestas que cada individuo puede mostrar frente a tratamientos con fármacos diferentes. La medicina personalizada se centra en la hipótesis de que las enfermedades son heterogéneas, desde sus causas hasta sus distintos grados de progresión tras la administración de un fármaco, y por tanto la enfermedad de cada paciente ha de ser tratada de forma individual. A medida que se perfeccionan las herramientas genómicas, el conocimiento de las bases moleculares y genéticas de las enfermedades aumenta. Los recientes descubrimientos en la patología del cáncer han demostrado la importancia que poseen los patrones de expresión génica en diversos tumores, incluyendo leucemias y cáncer de mama. Otros ejemplos los constituyen las enfermedades cardiovasculares, en las cuales el síndrome QT largo y la cardiomiopatía hipertrófica familiar han demostrado poseer una elevada heterogeneidad genética 14. USO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Desarrollo de terapias basadas en la genética Análisis genético para predecir el riesgo a sufrir la enfermedad Desarrollo y prescripción de medicamentos Basado en variaciones genéticas entre individuos Basado en diferencias genéticas entre enfermedades Fig. 4. Aplicaciones principales derivadas del uso de la información genética. Fuente: Phillips, K. A. (2004). Genetic testing and pharmacogenomics: Issues for determining the impact to healthcare delivery and costs. The American Journal of Managed Care. Vol. 10, No. 7, 425-432. Los beneficios que aportaría la medicina personalizada no sólo revertirían directamente a los pacientes y especialistas sanitarios, sino que la industria farmacéutica tendría la oportunidad de disminuir el tiempo y coste derivado del desarrollo de fármacos que no son adecuados para ciertos grupos de pacientes. Existen otra serie de factores que contribuyen en gran medida a que la medicina personalizada sea una clara apuesta de futuro en biotecnología, y que se recogen en el siguiente cuadro: 14 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology. Vol. 19, No. 12, December, 491-496. 14

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Beneficios de la medicina personalizada 15 Para la industria farmacéutica: Aumento de la eficiencia y reducción del coste de la identificación de dianas terapéuticas y nuevos fármacos. Reducción del tiempo y coste de los ensayos clínicos. Diferenciación del producto en el mercado. Para los pacientes y médicos: Mayor probabilidad de buenos resultados con un fármaco. Baja probabilidad de efectos secundarios. Estrategias preventivas. Estrategias dirigidas. Costes reducidos. Mejora en la salud. Como consecuencia de esta necesidad, ha sido necesario desarrollar una serie de tecnologías que permitan el descubrimiento de marcadores de diversa naturaleza, genéticos y proteicos fundamentalmente. Gracias a las técnicas de genotipado, los marcadores genéticos 16 son en la actualidad la principal estrategia en la medicina personalizada. El análisis clínico de mutaciones o polimorfismos relevantes puede llevarse a cabo mediante diferentes estrategias: MÉTODOS DE ANÁLISIS DE VARIACIONES EN EL GENOMA DEBIDAS A POLIMORFISMOS Método Análisis Ventajas Desventajas Farmacológico Estudios farmacocinéticos Control de la concentración del metabolito/fármaco Inviable en análisis clínicos rutinarios Estudios clínicos Control de la eficacia y toxicidad (necesario para evaluar la relevancia de los polimorfismos genéticos) No es adecuado para el análisis de pacientes individuales Bioquímico Actividad enzimática, función del receptor o transportador Control directo de la función de la proteína codificada por el gen de interés Proporcionan escasa información Genético Análisis de la secuencia Información completa de la secuencia Proceso laborioso Baja especificidad (puede detectar polimorfismos irrelevantes) (Continúa en página siguiente) 15 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology. Vol. 19, No. 12, December, 491-496. 16 Marcadores genéticos: fragmentos de ADN de tamaño variable y posición conocida, que pueden utilizarse como puntos de referencia en estudios de genómica. Los marcadores más simples son los SNPs. 15

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE VARIACIONES EN EL GENOMA DEBIDAS A POLIMORFISMOS (continuación) Método Análisis Ventajas Desventajas Genético (continuación) Análisis de la expresión génica Información potencial sobre predisposición genética Potencial control directo sobre el efecto de los fármacos Relevante sólo para genes diana y cascadas de señalización Análisis de SNPs Análisis rápido y simple en el paciente una vez identificados los SNPs responsables Información sobre predisposición genética Información sobre la respuesta a fármacos Extensos ensayos clínicos acerca de la relevancia de los SNPs Potencial baja sensibilidad (puede perder información sobre genes funcionales) Tabla 1. Métodos de análisis de variaciones en el genoma debidas a polimorfismos. Fuente: Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43 53. Las tecnologías de genotipado de SNPs de alto rendimiento forman parte de un proceso secuencial en el cual la identificación de SNPs es sólo el primer paso, dando lugar a tres aplicaciones básicas en salud humana, la farmacogenómica, el diagnóstico predictivo y el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos. Identificación de SNPs Farmacogenómica Diagnóstico predictivo Empleo de tests de diagnóstico de SNPs en pacientes Validación de SNPs Descubrimiento y desarrollo de fármacos Desarrollo de tests de diagnóstico de SNPs Genotipado de SNPs de alto rendimiento Estudios de asociación (relación entre SNPs y estados patológicos) Genotipado de SNPs de alto rendimiento en ensayos clínicos Fig. 5. Aplicaciones del genotipado de SNPs de alto rendimiento en salud humana. Fuente: Pharmacogenomics. A market & cost-benefit analysis. Front Strategic Consulting, INC. 2001. Las técnicas de genotipado se detallan en el punto 6 del presente informe. 16

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA 4.1. Diagnóstico predictivo En sus comienzos, la genética clínica se basaba en estudios familiares de enfermedades altamente recurrentes en determinadas familias. Aunque estos estudios demostraban que existían evidencias de que había factores genéticos asociados a un metabolismo variable de los fármacos, las conclusiones no podían ser aplicadas en la gran mayoría de los ensayos clínicos, ya que éstos eran llevados a cabo en individuos sin parentesco 17. El diagnóstico genético es de utilidad cuando existe una estrategia preventiva para reducir el riesgo en personas predispuestas a padecer una enfermedad o para disminuir su mortalidad a través de medidas terapéuticas precoces. Un ejemplo lo constituye el diagnóstico predictivo de algunos tipos de cánceres hereditarios a través del estudio de genes de susceptibilidad. La aplicación de este tipo de estudios en familias con historia de cáncer colorrectal no polipósico hereditario, por ejemplo, permite identificar los portadores de mutaciones de los genes de susceptibilidad implicados. De esta manera, se puede seleccionar aquellos individuos que van a beneficiarse de colonoscopias periódicas que detecten precozmente la enfermedad y mejoren su pronóstico 18. Por tanto, el diagnóstico predictivo mediante técnicas de genotipado es decisivo a la hora de realizar un diagnóstico temprano de una enfermedad crónica. Esta anticipación permitiría el tratamiento adecuado del paciente sin la necesidad de pasar por terapias fallidas antes de encontrar el medicamento apropiado, conllevando un mejor pronóstico de la enfermedad. En consecuencia, no sólo se evitaría un gran número de efectos secundarios derivados del empleo de fármacos no adecuados para la patología a tratar, sino que reduciría drásticamente el gasto en medicamentos innecesarios. Severidad clínica Inicio de la terapia Comienzo de síntomas Diagnóstico y pronóstico Comienzo de la enfermedad Predisposición Tiempo (meses - años) Fig. 6. Investigación, intervención y oportunidades de la medicina personalizada en diferentes estadíos de una enfermedad. Fuente: Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology Vol.19 No.12 December, 491-496. Aunque existen numeros ejemplos de polimorfismos de genes que se emplean para predecir la posible predisposición a sufrir una patología, la gran mayoría consisten en polimorfismos de genes concretos. Un claro ejemplo es el gen codificante de la apolipoproteína E (Apo E), cuyos polimorfismos se encuentran asociados a una distinta predisposición a padecer hipercolesterolemia. 17 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics. Current Opinion in Chemical Biology 4:440 444. 18 Benítez Ortiz, J. (2002). El genoma humano: aplicaciones en la práctica pediátrica. Vox Paediatrica, 10, 1 (7-12). 17

4.2. Farmacogenética y farmacogenómica No existe un consenso respecto a la definición de farmacogenética y farmacogenómica, ya que en ocasiones la literatura científica emplea diferentes acepciones dando lugar a confusión 19. Para los propósitos del presente informe, no se realizará una distinción entre farmacogenética y farmacogenómica, empleándose el segundo término de manera global para referirnos al análisis de información genética de un individuo o una población con el objeto de estudiar la respuesta a diversos fármacos. Farmacogenética Disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los fármacos basándose en los patrones de variabilidad genética de cada paciente. Farmacogenómica Término más amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados fármacos o personalizar medicamentos empleando herramientas genómicas. Existen grandes diferencias entre la genómica clásica y la farmacogenómica en cuanto a su aproximación a la enfermedad. Mediante las técnicas genómicas, se busca descodificar las instrucciones genéticas que permitan entender cómo estos genes participan en complejas redes biológicas. Un gen que causa una enfermedad es identificado como una variante del gen normal presente en la mayoría de la población. Tal variación puede ser tan pequeña como la sustitución de un único aminoácido que conlleva el mal funcionamiento de una proteína. Para la mayoría de las enfermedades con base genética, sin embargo, la situación es mucho más compleja, y varios defectos genéticos presentes en una población pueden contribuir a la misma enfermedad. Por tanto, el mismo agente terapéutico podría no ser efectivo como tratamiento para todos los individuos que sufran una enfermedad poligénica, que es como se denominan a las enfermedades causadas por más de un gen 20. Mientras que la genómica clásica compara individuos afectados con los no afectados, la farmacogenómica compara entre individuos afectados, identificando aquellos que responden a los fármacos y los que no responden. El último objetivo de la farmacogenómica es definir una enfermedad a nivel molecular de tal manera que las herramientas preventivas y terapéuticas de las que se disponga puedan frenar o mitigar los efectos de la enfermedad. Durante el progreso de una enfermedad crónica, la farmacogenómica impacta en el curso de la enfermedad en el momento en el que comienza la terapia mediante fármaco 21. El análisis farmacogenómico del paciente permitiría identificar aquellos fármacos y dosificaciones de los mismos para los cuales el paciente desarrolla una respuesta óptima. De la misma forma, es posible identificar los medicamentos o concentraciones de los mismos que desencadenan reacciones de toxicidad en algunos pacientes. 19 Tanto la agencia estadounidense del medicamento (FDA, http://www.fda.gov), como la Agencia Europea del Medicamento (EMEA, http://www.emea.eu.int) consideran la farmacogenética como el estudio de variaciones en la secuencia de ADN entre individuos en relación a la respuesta frente a un fármaco. La FDA define la farmacogenómica como el estudio de la variabilidad en la expresión de genes en referencia a la susceptibilidad de desarrollar una enfermedad y a la respuesta frente a un fármaco, todo ello a nivel celular, tisular, individual o en poblaciones determinadas (Draft Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions, Glossary, pag. 15 (http://www.fda.gov/cder/guidance/5900dft.pdf). La EMEA es más concreta al definir los tests farmacogenómicos como ensayos que permiten el estudio de variaciones interindividuales mediante mapas de SNPs, haplotipos, y alteraciones en la expresión génica que pueden correlacionarse con alguna función farmacológica o respuesta terapéutica (Position paper on terminology in pharmacogenetics. Committee for proprietary medicinal products (CPMP). EMEA/CPMP/3070/01, November 2002. (http://www.emea.eu.int/pdfs/human/press/pp/307001en.pdf). 20 Wallace, R. W. (1999). Pharmacogenomics: the next logical step. DDT, Vol. 4, No. 3, March. 21 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496. 18

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Severidad clínica Farmacogenómica Inicio de la terapia Comienzo de síntomas Diagnóstico y pronóstico Comienzo de la enfermedad Tiempo (meses - años) Fig. 7. Investigación, intervención y oportunidades de la medicina personalizada en diferentes estadíos de una enfermedad. Fuente: Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496. La variabilidad de la respuesta a los fármacos entre individuos puede estar motivada por un conjunto de factores, como por ejemplo la edad, raza, género, interacciones entre otros fármacos, enfermedades concomitantes, y las funciones renales y hepáticas. Al mismo tiempo, dentro de una población existe siempre una proporción de individuos que son genéticamente susceptibles a sufrir reacciones adversas derivadas del uso de determinados fármacos o bien no responden al tratamiento de manera adecuada. Hasta ahora, las medidas que se tomaban con estos pacientes consistían en el tratamiento con otros fármacos alternativos en caso de disponer de ellos, o bien el abandono de la medicación. La disponibilidad de tests que permitan la identificación de estos pacientes es una prioridad, ya que hasta la fecha sólo pueden identificarse tras su exposición al fármaco 22. Efectos inesperados: Efectos secundarios severos Respuesta inadecuada Pacientes bajo tratamiento con fármacos Fig. 8. Segmentación de la población en función de la respuesta a fármacos. Fuente: Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43 53. 22 Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43 53. 19

La farmacogenómica no sólo estudia la farmacodinámica, es decir, el mecanismo de acción de un fármaco sobre una diana, sino también la farmacocinética, que consiste en el estudio de cómo se absorben y distribuyen los fármacos en el organismo. El metabolismo de los fármacos, es decir, su absorción, biotransformación, distribución y excreción, puede variar en gran medida entre individuos, y por tanto representa un área donde la farmacogenómica juega un papel relevante. Las distintas agencias reguladoras del medicamento requieren a las compañías farmacéuticas una serie de estudios necesarios para formalizar el registro de un nuevo agente terapéutico, entre los que se encuentran los estudios farmacodinámicos y farmacocinéticos. FARMACOGENÉTICA/FARMACOGENÓMICA Dianas de fármacos Transportadores de fármacos Enzimas metabolizadoras de fármacos Farmacodinámica Farmacocinética Variabilidad de la eficacia y toxicidad del fármaco Fig. 9. Variabilidad entre pacientes en eficacia de fármacos y riesgo de toxicidad. Fuente: Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666. La farmacodinámica describe los efectos farmacológicos de un medicamento en el organismo 23. Numerosos fármacos interaccionan con dianas proteicas de manera específica, tales como enzimas y receptores. Muchas de estas dianas han demostrado tener polimorfismos que influyen en la respuesta del paciente ante un tratamiento farmacológico determinado. El conocimiento de estos polimorfismos puede emplearse para predecir la eficacia de un fármaco. La farmacocinética describe los niveles de un fármaco y sus metabolitos en los diferentes tejidos, así como su absorción, distribución, metabolismo y eliminación 24. La farmacocinética ha sido el área inicial de la investigación clínica aplicada a la farmacogenómica, y es la que permanece más activa. Una de las razones consiste en que existen pocas enzimas metabolizadoras de fármacos (drug-metabolizing enzymes, DMEs) en el mercado de fármacos actual, además de escasos polimorfismos asociados a estas enzimas. Este problema podría verse solucionado por el desarrollo de nuevos fármacos mediante la identificación de polimorfismos asociados a estas enzimas. Aplicaciones clínicas de la farmacogenómica La posibilidad de asociar los polimorfismos genéticos con la capacidad de respuesta de un paciente a un determinado medicamento ha supuesto un avance primordial para la farmacogenómica. En la actualidad, es posible conocer qué polimorfismos están asociados con la respuesta terapéutica a un medicamento concreto, como por ejemplo los polimorfismos que condicionan una mejor respuesta terapéutica a pravastatina en pacientes con hipercolesterolemia, o a formoterol en pacientes 23/24 Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666. 20

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA asmáticos 25. La mayoría de los fármacos actúan por medio de la interacción con proteínas tales como receptores, enzimas y proteínas de señalización intracelular. Estas proteínas presentan variaciones dentro de cada individuo determinadas por polimorfismos genéticos, que afectan a la sensibilidad a los fármacos. Mediante el análisis de SNPs en muestras obtenidas de pacientes enrolados en fases tempranas de ensayos clínicos, es posible predecir tanto la eficacia como la aparición de efectos adversos del medicamento en concreto. Factores a tener en cuenta en las aplicaciones clínicas de la farmacogenómica Eficacia: % de pacientes tratados con éxito. Toxicidad: % de pacientes que desarrollan efectos secundarios. Ventana terapéutica: rango de dosis en la cual un fármaco muestra la mayor eficacia y menor toxicidad. Las aplicaciones clínicas de la farmacogenómica se encuentran dirigidas al empleo de estrategias terapéuticas más efectivas en función del perfil genómico del paciente. Para ello se debe tener en cuenta lo que se denomina ventana terapéutica 26, que indica el rango de dosis adecuado para cada paciente en función de la eficacia y toxicidad del fármaco. Debido a la variabilidad genética entre invididuos, esta ventana terapéutica es muy estrecha para la mayoría de fármacos, por lo que su eficacia se encuentra limitada. El fármaco ideal presentaría una ventana tearapéutica amplia, lo que significaría la posibilidad de administrar bajas dosis del fármaco manteniendo su efectividad, y dosis elevadas del mismo sin presentar efectos tóxicos. La farmacogenómica permite extender la ventana terapéutica de los fármacos mediante la segmentación de la población en grupos con ventanas terapéuticas más amplias, y que por tanto se beneficiarían de la formulación de fármacos más efectivos y seguros. Por otro lado, las técnicas farmacogenómicas posibilitan descartar aquellos pacientes que por su perfil genético no desarrollan una respuesta adecuada, o bien son más susceptibles de desarrollar efectos sencundarios tras la administración del fármaco. Fármaco ideal Ventana terapéutica amplia A B C Mayoría de fármacos Ventana terapéutica estrecha D Dosis del fármaco E Dosis del fármaco A Farmacogenómica Ampliación de la ventana terapéutica B C D E Dosis del fármaco Fig. 10. Ajuste de la dosificación de fármacos. Fuente: adaptado de Pharmacogenomics: Dilemas and Challenges. University of Michigan. Gus Rosania, 2003; http://www-personal.umich.edu/~grosania/regulatory Issues Lecture.ppt. 25 García Alonso, Fernando. Siglo I: desafíos científicos y sociales. Capítulo 3: Farmacología y Genética. Pág. 37-43. 26 Ventana terapéutica: cociente entre la Concentración Máxima Efectiva (no tóxica) y la Concentración Mínima Efectiva. 21

La farmacogenómica puede dividirse en tres aplicaciones en función de la categoría de pacientes sometidos al tratamiento. Las dos primeras se emplearían para excluir pacientes de los ensayos clínicos, mientras que la última aumentaría el potencial de mercado del fármaco 27. APLICACIONES CLÍNICAS DE LA FARMACOGENÓMICA Ensayos de predicción de efectos secundarios o toxicidad Ensayos de eficacia mediante farmacogenómica Identificación de nuevos pacientes potenciales Estratificación de pacientes en función de la respuesta clínica Efectos secundarios raros Efectos secundarios comunes Respondedores por debajo del umbral óptimo Respondedores dentro del umbral óptimo Reformulación del fármaco A en función del genotipado de pacientes Fármaco excluido Fármaco A.1 Fármaco A.2 Fármaco A Fig. 11. Aplicaciones clínicas de la farmacogenómica en base al tipo de pacientes. Fuente: adaptado de Pharmacogenetics and Personalized Medicine, EGeen International; http://www.egeeninc.com. 4.2.1. Ensayos de predicción de efectos secundarios o toxicidad Las técnicas farmacogenómicas permiten identificar pacientes con predisposición a experimentar efectos secundarios derivados del tratamiento con determinados fármacos. Esta aplicación concreta de la farmacogenómica también se denomina toxicogenómica. La variabilidad en la respuesta terapéutica es debido en la mayoría de los casos a dificultades metabólicas causadas por variantes de enzimas conocidas. Los polimorfismos más frecuentes relacionados con la toxicidad de los fármacos se encuentran en enzimas metabolizadoras de fármacos. Durante el proceso de desarrollo de un fármaco, la farmacogenómica puede emplearse para predecir posibles Reacciones Adversas Medicamentosas (RAM) tales como hepatoxicidad, nefrotoxicidad, cardiotoxicidad o inmunosupresión. Estas reacciones son responsables de más de un 3% de las hospitalizaciones en la mayoría de los países desarrollados 28. Aunque el riesgo de producir toxicidad se puede reducir mediante la disminución de la dosis, no todos los efectos secundarios tóxicos son debidos a dosis elevadas, como la cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, rabdomiolisis y agranulocitosis. Aunque este tipo de toxicidad no es frecuente que se produzca en la población, es motivo suficiente para que un fármaco no sea aprobado por las agencias de medicamentos o bien sea retirado del mercado. Por este motivo, en la actualidad se están desarrollando técnicas de genotipado que permitan identificar pacientes susceptibles de sufrir esta clase de toxicidad. Para realizar este tipo de análisis es necesario que exista una base de datos de pacientes que hayan mostrado algún tipo de toxicidad relacionada con la administración de medicamentos 29. 27 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceutical industry. The Boston Consulting Group, Inc. 28 Hosford, D. A. (2004). Pharmacogenetics to predict drug-related adverse events. Toxicologic pathology, 32 (suppl. 1): 9-12. 29 Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666. 22

TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA Otra técnica que permite analizar el perfil toxicológico de un fármaco es el análisis de la expresión génica mediante microarrays de ADN, los cuales permiten elaborar perfiles moleculares de toxicidad. Algunas compañías que están trabajando en el desarrollo de estos tests son Affymetrix, Genelogic y Curagen 30. Actualmente el análisis genómico del perfil toxicológico es una práctica común durante la fase preclínica de desarrollo de nuevos fármacos. Los tests genéticos de toxicidad más frecuentes son aquellos que estudian la asociación entre el nuevo compuesto terapéutico y el gen HERG, asociado a la susceptibilidad de desarrollar arritmias tras la administración de determinados fármacos 31. Otro ejemplo común es el polimorfismo del gen NAT2, responsable de variaciones genéticas en el metabolismo de numerosos fármacos, presente en el 50% de la población caucásica, que posee un mayor riesgo de sufrir efectos secundarios para numerosos fármacos comercializados 32. El empleo de tests farmacogenómicos para identificar este polimorfismo permitiría recuperar algunos fármacos antes de ser abandonados tras un ensayo clínico que no ofreciera resultados positivos. Por tanto, los marcadores farmacogenómicos podrían introducirse en las distintas fases de los ensayos clínicos, así como en las etapas de estratificación y selección de pacientes. Ensayos de predicción de efectos secundarios mediante farmacogenómica Pueden salvar un fármaco candidato que en otras circunstancias habría sido abandonado. No descalifican pacientes que van a desarrollar efectos secundarios para el ensayo. Eleva el coste de los ensayos clínicos al requerir un mayor número de pacientes. No sirven para seleccionar pacientes antes de iniciar una nueva fase clínica. En la actualidad varias compañías biotecnológicas disponen de tests farmacogenómicos que permiten la identificación de polimorfismos relacionados con el metabolismo de fármacos. Los principales tests toxicogenómicos se centran en el genotipado de genes de enzimas de la familia del citocromo p450, relacionada con la toxicidad de un gran número de fármacos. En este sentido, existen cuatro tests de genotipado desarrollados por diferentes compañías, mediante los cuales es posible identificar un número variable de SNPs en distintos genes de la familia del citocromo p450. Tan solo uno de los tests de genotipado, desarrollado por Roche Diagnostics y con un precio por unidad que ronda los 400, ha sido aprobado para su uso en los 25 países de la U.E. como método de diagnóstico in vitro para identificar polimorfismos del gen del citocromo p450. El resto de tests es probable que obtengan la autorización en los próximos meses, mientras todavía no se ha autorizado ningún test toxicogenómico de diagnóstico in vitro en EE.UU. 33. Una segunda estrategia consiste en la identificación de polimorfismos de la enzima tiopurina metiltransferasa (TPMT), que ha dado lugar a un test de genotipado comercializado por la empresa Prometheus Laboratories Inc., autorizado en la U.E. para su uso como test toxicogenómico asociado al tratamiento con azatioprina (Imuran TM, fármaco frente a la artiritis reumatoide comercializado tambien por Prometheus). 30 Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx). Genelogic (http://www.genelogic.com). Curagen Corp. (http://www.curagen.com). 31 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496. 32 Garte, S.; et al. (2001). Metabolic gene polymorphism frequencies in control populations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. Dec. 10 (12), 1239-48. 33 EU Approves Roche s AmpliChip as In Vitro Device; Competitors Consider Next Moves. Pharmacogenomics Reporter, Sept. 9, 2004 (http://www.pgxreporter.com). 23