PRÁCTICA 1: MANEJO DE MICROSCOPIO ÓPTICO, FENÓMENOS OSMÓTICOS Y PLASTOS Los objetivos de esta práctica son: aprender a utilizar y a cuidar uno de los instrumentos más utilizados en Biología aprender las normas básicas para representar en el papel las observaciones al microscopio Reconocer el efecto distintos tipos de medio (hipertónico, isotótipo, hipertónico) sobre las células vegetales. Observar los distintos tipos de plastos en células vegetales. MANEJO DE MICROSCOPIO ÓPTICO Estructura del microscopio óptico compuesto (se subrayan las lentes) Fuente de luz. La luz recorre todo el microscopio atravesando la preparación (luz transmitida) hasta llegar a los ojos. Generalmente la fuente de luz dispone de un regulador de la intensidad. Diafragma. Se abre y cierra como la pupila del ojo, dejando pasar más o menos luz. Condensador. Está constituido por lentes convergentes que concentran los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz sobre la preparación. Platina. Sobre ella se sitúa la preparación. Los tornillos de la platina permiten desplazar horizontalmente la preparación para poder explorar distintas zonas. Objetivo. Lente (o lentes) que produce dentro del microscopio una imagen ampliada del objeto. Normalmente cada microscopio posee 3 ó 4 objetivos montados en el revólver (4X, 10X, 45X, 100X). Se enfoca acercando o alejando la preparación del objetivo, con ayuda de los tornillos macro- y micrométrico. Nota: Para que el objetivo 100X funcione correctamente es necesario interponer aceite de inmersión entre la preparación y el objetivo. Ocular. Lente (o lentes) que produce dentro del ojo una imagen todavía más ampliada. Los juegos de oculares (10X, 15X) son intercambiables. Material a observar En un microscopio óptico se observan objetos de muy escaso espesor o secciones muy delgadas obtenidas con cuchillas o microtomos, para permitir el paso de la luz a su través. El objeto a observar o muestra, por lo general previamente teñido, se coloca sobre un vidrio delgado rectangular llamado portaobjetos (o porta ), y la muestra se cubre con otra lámina de vidrio mucho más delgada llamada cubreobjetos (o cubre ). El conjunto se denomina preparación. Manejo del microscopio óptico compuesto Siempre que se utilice un microscopio deben seguirse secuencialmente estos ocho pasos: 1. Con el tornillo macrométrico se aleja lo más posible el revólver de la platina (llevando el revólver hasta su posición más elevada o, según el modelo de microscopio, bajando la platina). 2. Se coloca la preparación en la platina. El material a observar debe quedar en la región central iluminada. El cubreobjetos deberá mirar hacia arriba. 3. Se gira el revólver hasta colocar el objetivo de menor número de aumentos. 4. Mirando por un lado, se acerca el objetivo a la platina, utilizando el tornillo macrométrico, hasta que esté muy próximo a la preparación. 1
5. Mirando por el ocular, se aleja lentamente el objetivo de la platina, utilizando el tornillo macrométrico, hasta encontrar la imagen. Para observar la preparación con mayor nitidez, se ajusta el enfoque final con el tornillo micrométrico, girándolo según convenga. 6. Para mejorar el contraste se utilizan el regulador de intensidad de luz y el diafragma. Siempre que haya luz suficiente, se procura que el diafragma esté lo más cerrado posible. 7. Si se quiere observar algún detalle a mayor aumento, se selecciona la parte de la preparación que se desea observar y se sitúa en el centro del campo de visión. Se aleja el objetivo de la platina (igual que antes) y se gira el revólver hasta colocar el objetivo siguiente en su posición adecuada (se oirá un clic característico cuando el objetivo ocupe la posición correcta para observar). 8. Se repiten los pasos 4 a 7. En algunos microscopios el cambio de objetivo se puede hacer directamente, sin necesidad de levantar el objetivo o bajar la platina. El enfoque correcto se consigue en estos casos con el tornillo micrométrico. MUY IMPORTANTE!: Finalizada la práctica, se levanta el revólver, se retira la preparación de la platina, se deja interpuesto el objetivo de menor número de aumentos, se vuelve a bajar el revólver y se guarda el microscopio dentro de su funda de plástico o caja. Si hay dos tipos de oculares, se dejan puestos los más cortos. Propiedades de un microscopio Aumento (A) Es la proporción entre el tamaño de la imagen observada con el microscopio y el tamaño real del objeto. Tanto los objetivos como los oculares tienen visiblemente grabados por fuera sus aumentos. A = (A objetivo ) (A ocular ) Límite de resolución (LR) Es la distancia mínima que debe existir entre dos objetos o puntos para que puedan distinguirse con nitidez (cuanto menor, mejor) LR = 0,61λ / N.A. λ: longitud de onda de la luz incidente (cuanto menor, mejor) N.A.: apertura numérica del objetivo (cuanto mayor, mejor). Su valor, que suele estar grabado en el objetivo, se calcula así: N.A. = N sen (θ/2) N: índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo (cuanto mayor, mejor). Para el aire N=1, para el aceite N=1,52 θ: ángulo del cono de luz que, procedente del objeto, entra en el objetivo (cuanto mayor, mejor). 2
Contraste Es el resultado de la transmisión diferencial de luz a través de la muestra objeto y del medio. Normalmente, un objeto se percibe con un microscopio gracias a que a su través se transmite menos luz que a través del medio. Para mejorar el contraste se puede: Teñir la muestra. La tinción de un objeto con colorantes aumenta su contraste pues aumenta su capacidad de absorción de la luz incidente. Las tinciones pueden ser simples o diferenciales, positivas o negativas. Cerrar el diafragma. Cuanto más cerrado (siempre que haya luz suficiente) mejor contraste. Utilizar microscopios especiales, como el microscopio de contraste de fases, el de iluminación en campo oscuro o el de fluorescencia. LA CÉLULA VEGETAL: PLASTOS Los plastos son orgánulos celulares eucarióticos propios de plantas y algas. Su función principal es la producción y almacenamiento de importantes compuestos químicos. Juegan un papel importante en la fotosíntesis, la síntesis de lípidos y aminoácidos, determinan el color de frutas, flores, etc. Cada plasto está limitado por una envoltura formada por dos membranas y se multiplican por bipartición.. Los proplastos crecen junto con las células meristemáticas, y según el tipo de célula hacia el que conduzca la diferenciación, derivará un tipo u otro de plasto. Los principales tipos de plastos son: cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos. Aunque morfológica y funcionalmente los distintos tipos son muy diferentes, unos se convierten en otros con bastante facilidad en función de las condiciones ambientales y las necesidades de la célula. En la oscuridad los proplastos pueden transformarse en etioplastos, que por el efecto de la luz, pueden a su vez transformarse en plastos fotosintéticamente activos. En la reproducción sexual de los organismos, los plastos se transmiten mediante los gametos, en muchos casos a través del gameto femenino. El ADN plastidial es un filamento doble y circular que se replica por una ADN-plastidial-polimerasa específica y también existe una ARN-plastidial-polimerasa específica para la transcripción. Una parte de las proteínas del plasto se sintetizan a partir del ADN plastidial y otra parte del ADN nuclear. Los ribosomas de los plastos son más pequeños que los del citoplasma, con un coeficiente de sedimentación de 70s, al igual que los de los procariotas. Tipos de plastos según su contenido: Plastos pigmentados Cloroplastos: plastos pigmentados que realizan la fotosíntesis. Contienen invaginaciones de membrana, los tilacoides, donde se encuentran organizados los pigmentos (clorofilas) y demás moléculas que convierten la energía luminosa en energía química. Cromoplastos: Sintetizan y almacenan pigmentos. Su presencia en las plantas determina el color rojo, anaranjado o amarillo de algunas frutas, hortalizas y flores. El color de los cromoplastos se debe a la presencia de ciertos pigmentos; como los carotenos, de color rojo y las xantofilas, de color amarillo. Por ejemplo, el tomate y las zanahoria contienen muchos pigmentos carotinoides. La diferenciación de un cromoplasto no es un fenómeno irreversible, en la parte superior de las raíces de zanahoria, expuestas a la luz, los cromoplastos pueden diferenciarse en cloroplastos perdiendo los pigmentos y desarrollando tilacoides. 3
Plastos no pigmentados o Leucoplastos Amiloplastos: almacenan almidón. Habituales en los meristemos, en los tejidos de almacenamiento como cotiledones, endospermo, tubérculos y células de la caliptra asociadas con el geotropismo (estatolito). El almidón se forma en los cloroplastos durante la fotosíntesis. Después es hidrolizado, movilizado a través del floema y finalmente se resintetiza como almidón de reserva en los amiloplastos de las células de los órganos de reserva de la planta. Oleoplastos: almacenan lípidos. Proteinoplastos: almacenan proteínas LA CÉLULA VEGETAL: FENÓMENOS OSMÓTICOS Osmosis es un proceso de difusión pasiva que supone el movimiento neto del agua, principal disolvente en los sistemas biológicos, a través de una membrana semipermeable desde la solución de menor concentración de soluto a la más concentrada. La presión osmótica entre dos soluciones con distinta concentración de soluto separadas por una membrana semipermeable se define como la presión que se requiere para impedir el flujo de agua desde la solución de menor a la de mayor concentración. La membrana plasmática se puede considerar una membrana semipermeable. Cuando una célula se coloca en un medio que tiene exactamente la misma concentración de solutos que en la solución celular, no se produce movimiento neto de moléculas de agua a través de la membrana plasmática. Se dice que el medio es isotónico. El medio es hipertónico o hiperosmótico cuando posee una concentración de solutos mayor que el interior de la célula. En este caso célula tiende a perder agua por ósmosis. Un medio hipotónico o hipoosmótico es aquel que contiene una concentración de solutos menor que la célula, de manera que una célula colocada en el tiende a adquirir agua. Las células vegetales, las algas y los hongos (eucariotas), asi como las bacterias (procariotas) tienen paredes celulares rígidas. Estas paredes permiten que las células toleren medios externos con una concentración de solutos muy baja sin sufrir lisis. En un medio hipotónico el agua entra en el interior de las células vegetales, llenando su vacuola central, aumentando la presión de turgencia contra las paredes celulares rígidas. Así se alcanza un estado de equilibrio en el que la resistencia de la pared celular impide el incremento de tamaño celular, y por lo tanto el movimiento neto de agua hacia el interior de la célula. La presión de turgencia en las células vegetales es un factor de sostén importante para el cuerpo de las plantas no leñosas. Las células vegetales en un medio hipertónico pierden agua, su contenido se encoge y la membrana plasmática se separa de la pared celular, en un proceso conocido como plasmolisis. Este proceso tiene lugar en las plantas cuando el suelo o el agua que las rodea contiene alta concentración de sales o fertilizantes. Esto explica que la lechuga pierda turgencia con un aderezo salado. El objetivo de esta parte de la práctica es observar al microscopio óptico el comportamiento de células vegetales en distintos medios (hipertónico, hipotónico e isotónico), debido al fenómeno de la ósmosis. 4
EJERCICIOS: P1-01. Indica en el esquema del microscopio óptico el nombre de todas las partes: A. B. C. D. E. F. G. H. I. 5
En todas las representaciones que se hagan utilizando el microscopio o la lupa se debe indicar el nombre de lo que se representa y los aumentos del objetivo y del ocular. P01-02. Coloca en un portaobjetos una hoja de la angiosperma acuática Elodea canadensis. Deposita una gota de solución de cloruro sódico al 0,2 %, y coloca encima el cubreobjetos. Observa al microscopio con 400 aumentos y dibuja varias células mostrando la morfología celular y la posición relativa de: pared celular, membrana plasmática, cloroplastos y vacuola. De qué tipo de medio se trata?: 6
P01-03. Deposita sobre la misma preparación anterior una gota de solución de NaCl al 2%, y coloca encima el cubreobjetos. Observa al microscopio con 400 aumentos y dibuja varias células mostrando la morfología celular y la posición relativa de: pared celular, membrana plasmática, cloroplastos y vacuola. De qué tipo de medio se trata?: P01-04. Deposita sobre la misma preparación anterior una gota de solución de NaCl al 0.9%, y coloca encima el cubreobjetos. Observa al microscopio con 400 aumentos y dibuja varias células mostrando la morfología celular y la posición relativa de: pared celular, membrana plasmática, cloroplastos y vacuola. De qué tipo de medio se trata?: 7
P01-05. Coloca en un portaobjetos una pequeña muestra de los distintos vegetales raspando con la punta de la lanceta. Deposita una gota de agua, o en el caso de patata o plátano una gota de lugol al 50% con agua, y coloca encima el cubreobjetos. Observa al microscopio con 400 aumentos y dibuja. PATATA (Solanum tuberosum) o PLÁTANO (Musa sp). Tipo de plastos: AGUACATE (Persea americana) Tipo de plastos: TOMATE (Lycopersicon esculentum). Tipo de plastos: 8