Avances en la Síntesis Enzimática de Oligosacáridos Prebióticos Oskar Bañuelos, José M. Corral, Carmen Ronchel, José L. Adrio; Javier Velasco Biotec 2004, Oviedo
Probióticos y Prebióticos * 10% Hombre/90% bacteria * 10 14 células procariotas * > 400 especies distintas * 70.000 genes procariotas Tiene algún efecto beneficioso para la salud? * 10 13 células * 30.000 genes Se puede modular?
FLORA INTESTINAL Estómago Intestino delgado Colon 8 ph 6 4 2 Tiempo de Tránsito Flora Típica 15-20 min 2-3 horas 24-72 horas 10 2-10 3 /ml 10 4-10 8 /ml 10 11-10 12 /ml Lactobacillus Streptococcus Levaduras H. pylori Lactobacillus, Streptococcus Enterobacterias, Bifidobacterias Bacteriodes, Clostridium Lactobacillus, Streptococcus Enterobacterias, Bifidobacterias Bacteriodes, Clostridium, levaduras Peptococcus, Ruminococcus, Butyrovibrio, Fusobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Atopobium Procesos microbianos Proteolisis y sacarolisis parcial Producción de toxinas y ácidos grasos de cadena corta Proteolisis y sacarolisis Producción de toxinas y ácidos grasos de cadena corta Procesos fisiológicos Digestion, almacenamiento Absorción de minerales, azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc Absorción de agua, minerales, ácidos orgánicos Fuente: Gibson & Rastall, ASM News Mayo 2004
ALIMENTOS, DIGESTIÓN Y FLORA Alimentos ricos en proteínas Alimentos ricos en fibra Alimentos con PREBIÓTICOS Peptococcus asacaroliticos Bacteriodes, asacaroliticos, Clostridium Fusobacterium, Enterobacterias, Bacteriodes, Butyrovibrio, Enterococcus, Peptostreptococcus, Atopobium Streptococcus, Clostridium Lactobacillus, Bifidobacterias Eubacterium Toxinas Carcinógenos Gas Ácidos grasos de cadena corta Lactato Vitaminas del grupo B Fuente: Gibson & Rastall, ASM News Mayo 2004
EFECTOS BENEFICIOSOS Prebiótico: 1. No degradado en estómago ni intestino delgado. 2. Transferido al colon intacto. 3. Estimular selectivamente el crecimiento y actividad de Bifidobacterias y Lactobacillus. EFECTOS SOBRE LA MICROFLORA Aumento en los recuentos fecales de lactobacilos y bifidobacterias. Formación debiofilms en la mucosa intestinal. Reducción en el recuento de clostridios. Incremento en la resistencia a la colonización por patógenos. Bloqueo de sitios de unión de patógenos. Fuente: Cumming JH & MacFarlane, GT British J Nutr. 2002 Suppl 2: 145 151. Elaboración propia
EFECTOS BENEFICIOSOS EFECTOS DE LA FERMENTACIÓN EN EL INTESTINO Producción de ácidos grasos de cadena corta y lactato. Descenso en el ph fecal. Mejora en la absorción de calcio, hierro y magnesio. Estimulación de la proliferación de enterocitos (butirato) Aumento en la biomasa fecal Aumento en el contenido energético y de nitrógeno fecales Ligeras propiedades laxantes OTROS EFECTOS Protección frente a caries. Reducción en el contenido calórico y en IG (Índice Glicémico) Posible prevención de cáncer de cólon. Indicios de reducción de la concentración de colesterol y triglicéridos en sangre (inhibición de lipogénesis por ac. propiónico?). Fuente: Cumming JH & MacFarlane, GT British J Nutr. 2002 Suppl 2: 145 151. Elaboración propia.
OLIGOSACÁRIDOS NO DIGERIBLES (I) Achicoria Pataca INULINA Hidrólisis con inulinasas Transfructosilación con β-d-fructosidasas FRUCTO- OLIGOSACÁRIDOS Remolacha SACAROSA Síntesis de palatinosa con palatinosa sintasa Condensación intermolecular PALATINO- OLIGOSACÁRIDOS + MALTOSA Transglucosilación con CGTasa GLUCOSIL SACAROSA Transfructosilación con β-d-fructosidasas LACTOSACAROSA Suero de leche LACTOSA Transgalactosilación con β-d-galactosidasas GALACTO- OLIGOSACÁRIDOS
OLIGOSACÁRIDOS NO DIGERIBLES (II) Hidrólisis con isoamilasa o pululanasa Hidrólisis controlada con α-amilasas MALTO- OLIGOSACÁRIDOS Hidrólisis con pululanasa y α-amilasa Transglucosilación con CGTasa CICLODEXTRINAS Almidón ALMIDÓN SOLUBLE Conversión a maltosa con α-amilasa + β-amilasa Transglucosilación con α-glucosidasa ISOMALTO- OLIGOSACÁRIDOS Conversión a glucosa por hidrólisis ácida o enzimática Transglucosilación con β-glucosidasa GENTIO- OLIGOSACÁRIDOS Materiales Lignocelulósicos XILANO Hidrólisis controlada con Endo-1,4-β-xilanasas XILO- OLIGOSACÁRIDOS
FRUCTOOLIGOSÁCARIDOS Inulina Sacarosa Endoinulinasa Hidrólisis Parcial Fructosil transferasa Endoinulinasa Hidrólisis parcial Fructosil transferasa Endoinulinasa Hidrólisis parcial Fructosil transferasa
Antecedentes -Micelio de: Penicillium citrinum Aspergillus sydowii -Fructosiltransferasa de: Aureobasidium pullulans Aspergillus oryzae Aspergillus sydowi Aspergillus niger PATENTES: -Procesos -Enzimas -Genes... Screening de la colección de m.o. de Puleva Biotech Identificación y caracterización de una fructosiltransferasa de Aspergillus niger BT18 Optimización de la producción de fructosiltransferasa Producción de FOS (enzima libre e inmovilizada)
Fructosiltransferasa 0 Sacarosa H 2 0 Glucosa Fructosa G:F = 1 0 Sacarosa 0 Sacarosa Glucosa 0 0 1-Kestosa (GF 2) G:F >1 kda 200 116.3 97.4 66.2 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 M
Fructosiltransferasa Glucose Sucrose Fructo-oligosaccharides Fructose HPAEC-PAD: High performance anion exchange chromatography Pulse Amperometric Detection (Dionex)
PROPIEDADES PREBIÓTICAS Fuente de Carbono óptima para las bacterias beneficiosas Mayor especificidad Prebióticos de Segunda Generación Mayor efecto a menor dosis Menores efectos secundarios (hinchazón, flatulencia) Mejores propiedades tecnol. (resistencia bajo ph, Tª)
PROPIEDADES PREBIÓTICAS A menor DP => efecto prebiótico mas rápido Fuente: Perrin et al Can J Microbiol. 2002 Aug;48(8): 759-63 0.35 Degradación de FOS por Bifidobacterium 0.30 % Carbohidratos tot 0.25 0.20 0.15 0.10 DP3 DP4 DP5 DP6 DP7 0.05 0.00 0 5 10 15 20 25 Horas Fuente: Van der Meulen et al Appl. Environ. Microbiol. 2004 Apr;70(4) 1923
PROPIEDADES PREBIÓTICAS Crecimiento 7 6 5 Glucosa FOS 60% FOS 95% Oligofruct 95% Inulina Lactobacillus fermentum CECT5716 DO 600nm 4 3 2 Consumo de azúcares 1 8 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Tiempo (h) Conc (g/l) 6 4 Glucosa Fructosa Sacarosa GF2 GF3 GF4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Tiempo (h)
PREBIÓTICOS DE SEGUNDA GENERACIÓN" Genes M.O. PROBIÓTICO Vectores de expresión Aspergillus Saccharomyces LAB SIMBIÓTICOS Enzima Inmovilización SUBSTRATO OLIGOSACÁRIDOS ESPECÍFICOS
Conclusiones. Desarrollo de procesos de producción industrial de FRUCTOOLIGOSACÁRIDOS. Sustentación científica de los valores nutricionales de los ingredientes. Desarrollo de prebióticos de segunda generación. Utilización de biotecnología para producción de carbohidratos y fibras de nueva generación: Microbiología Industrial. Biocatálisis.
Agradecimientos Área de Biotecnología Área de Ingeniería de Procesos