BASES MOLECULARES DE LA LIPODISTROFIA ASOCIADA A LA TERAPIA ANTIRRETROVIRAL DE ELEVADA ACTIVIDAD EN ENFERMOS DE SIDA: UNA APROXIMACIÓN GENÓMICA Investigadores principales: Dr. Pere Domingo Pedrol Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Dra. Marta Giralt Facultat de Biologia. Universitat de Barcelona Duración: 3 años MEMORIA FINAL 1. Resumen El objetivo principal del proyecto se centraba en la identificación de las principales alteraciones en la expresión adipocitaria que dan lugar al síndrome de lipodistrofia asociada a la terapia antirretroviral de elevada actividad (HAART) en pacientes infectados por VIH-1. Asimismo, se han analizado muestras procedentes de enfermos VIH no tratados (naive) para estudiar si la propia infección por VIH podía provocar alguna de las alteraciones observadas. Este objetivo principal se desglosó en: 1
Objetivo 1: determinación del efecto del tratamiento con fármacos antirretrovirales HAART y el desarrollo de lipodistrofia sobre la expresión génica de marcadores de la biología adipocitaria en biopsias de tejido adiposo de enfermos infectos VIH con tratamiento o no HAART, que mostraban o no lipodistrofia clínica evidente, y controles sanos. Objetivo 2: determinación del impacto de los diferentes fármacos antirretrovirales sobre la expresión génica de marcadores de la biología adipocitaria en cultivos primarios de células adiposas. Objetivo 3: análisis masivo de expresión génica por microarrays de DNA de la acción de los fármacos antirretrovirales en adipocitos humanos en cultivo y en biopsias de tejido adiposo de pacientes con lipodistrofia, al objeto de identificar genes diana de acción de los fármacos no previstos de entrada (como los que ya se analizan directamente en los objetivos 1 y 2). 2. Resultados Objetivo 1 1. Análisis de expresión génica en biopsias de tejido adiposo subcutáneo abdominal de enfermos VIH+ no tratados, tratados con lipodistrofia o no, comparado con controles sanos. Se han alcanzado resultados de expresión génica, tanto de RNA como de proteína, en muestras de tejido adiposo subcutáneo abdominal de individuos controles, pacientes infectados con VIH naive (no tratados) y con tratamientos HAART que ya han desarrollado o no lipodistrofia clínica. Se ha analizado un mínimo de 20 muestras por cada uno de los 4 grupos experimentales. Se han obtenido resultados correspondientes a la expresión de mrna (y algunos de proteína), entre otros, de los genes: transportador de glucosa GLUT-4, lipoproteína lipasa, proteínas desacoplantes UCP2 y UCP3, subunidades II (mitocondrial) y IV (nuclear) del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial, factores de 2
transcripción adipogénicos PPARγ, C/EBPα y antiadipogénico Pref1, coactivador PGC1α, factor de transcripción de genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales NRF-1, adipocinas leptina y adiponectina, citocina TNFα, β2-microglobulina (marcador de inflamación). Los resultados nos muestran que existe una alteración en el patrón de expresión génica en los pacientes infectados con VIH, incluso antes de que éstos empiecen el tratamiento HAART. La toxicidad de los fármacos provoca el agravamiento en la alteración de la expresión génica de genes mitocondriales. La aparición de lipodistrofia también modifica específicamente la expresión de los genes UCP3 y del factor antiadipogénico Pref1. Estos resultados han sido publicados en Antiviral Therapy (ver Publicaciones). 2. Análisis de expresión génica en biopsias de lipomas de enfermos VIH+ lipodistróficos Una parte de los pacientes VIH en tratamiento HAART que desarrollan lipodistrofia también desarrollan lipomatosis, que se caracteriza con frecuencia por depósitos dorsocervicales denominados joroba de búfalo. La etiopatogenia de estos lipomas y de la lipodistrofia nos es desconocida. No obstante, la distribución anatómica de estos lipomas es reminiscente de los de la lipomatosis simétrica múltiple, de etiopatogenia diversa (por ejemplo, por mutaciones en el trna-lys del DNA mitocondrial) y que contiene una mezcla de adipocitos con un predominio de morfología de adipocito marrón. En un primer estudio, demostramos que los lipomas dorsocervicales expresan UCP1 mrna a niveles similares a los del tejido adiposo perirrenal (control positivo), mientras que la expresión es casi indetectable en muestras de tejido adiposo subcutáneo de pacientes lipodistróficos. Por tanto, alteraciones en el linaje celular del adipocito marrón respecto al blanco están involucradas en el desarrollo de la 3
lipomatosis inducida por HAART. Estos resultados fueron publicados en AIDS (ver Publicaciones). Continuamos el estudio ampliando el número de muestras de lipoma buffalo hump a analizar (10), así como también analizando muestras de lipomas dorsocervicales de origen genético (mutaciones en el trna-lys del DNA mitocondrial) para poder establecer mapas de expresión génica comparativos entre estos lipomas. Hemos determinado que el patrón de expresión génica en los lipomas está alterado y que dicha alteración difiere en parte al comparar lipomas de pacientes VIH de los lipomas de pacientes de origen genético. En ambos tipos de lipomas se observa un aumento en la expresión de genes marcadores de proliferación y un aumento en la expresión de genes marcadores del fenotipo del adipocito marrón respecto al del adipocito blanco. Por el contrario, la disminución de los transcritos mitocondriales que se detecta en los lipomas VIH no se observa en los lipomas de origen genético. Asimismo, en los pacientes VIH lipodistróficos existen claras diferencias entre los patrones de expresión génica en el tejido adiposo subcutáneo (lipoatrófico) y el tejido adiposo de los lipomas (por ejemplo, aumento en la expresión de genes marcadores de inflamación en el subcutáneo, pero no en los lipomas). Una parte de los resultados acaba de publicarse en Molecular Genetics and Metabolism (ver Publicaciones), una parte se ha presentado en el congreso 7th International Workshop on Adverse Drug Reactions and Lipodystrophy in HIV (Antiviral Therapy 10 (Suppl.3): L19, 2005) y el resto de resultados se están acabando de procesar para su publicación. Objetivo 2 1. Análisis de expresión génica, biogénesis mitocondrial y diferenciación morfológica en cultivos primarios de adipocitos marrones tratados con fármacos HAART Los resultados obtenidos en el estudio publicado en AIDS indicaban que alteraciones en el linaje celular del adipocito marrón respecto al blanco 4
están involucradas en el desarrollo de la lipomatosis inducida por HAART. Asimismo, el modelo celular del adipocito marrón es óptimo para el estudio de la toxicidad mitocondrial y otros efectos de los fármacos antirretrovirales in vitro. Los resultados que obtuvimos indican que: - Los inhibidores de la transcriptasa reversa no análogos de nucleósidos (NRTI) poseen un efecto opuesto sobre la diferenciación del adipocito marrón: el efavirenz bloquea mientras que la nevirapina potencia la diferenciación adipocitaria, biogénesis mitocondrial y expresión del gen marcador UCP1. - Los inhibidores de la transcriptasa reversa análogos de nucleósidos (NRTI) no afectan a la diferenciación adipocitaria. La estavudina, zidovudina y didanosina provocan una depleción del DNA mitocondrial, aunque la expresión del genoma mitocondrial sólo se encuentra disminuida en las células tratadas con didanosina. La compensación de la depleción del mtdna por estavudina puede explicarse por el aumento en la expresión de los factores de transcripción mitocondrial. - La estavudina induce de forma específica la expresión génica de UCP1 por mecanismos que involucran la vía del ácido retinoico. Estos resultados han sido publicados igualmente en Antiviral Therapy (ver Publicaciones). El estudio en adipocitos humanos en cultivo primario ha mostrado que a nivel morfológico y de efectos tóxicos existen claras diferencias entre los diferentes fármacos HAART. Así, no hemos observado alteraciones en el proceso de diferenciación adipocitaria por el tratamiento con los NRTI didanosina, estavudina ni zidovudina, aunque sí hemos detectado un efecto de toxicidad mitocondrial sobre los adipocitos humanos de la didanosina. Por el contrario, el tratamiento con nevirapina muestra un efecto positivo sobre el proceso de diferenciación adipocitaria y la acumulación de lípidos en los adipocitos humanos. El tratamiento con efavirenz y con los PI nelfinavir, ritonavir, lopinavir y saquinavir muestra un efecto tóxico sobre la viabilidad celular y, a dosis más bajas, un efecto 5
inhibidor del proceso de diferenciación adipocitaria con efectos de intensidad variable según el fármaco. Se ha ensayado también la combinación ritonavir más lopinavir en las proporciones farmacológicas de la combinación clínica Caletra con claros efectos tóxicos y negativos sobre la diferenciación adipocitaria. Hemos presentado ya un resumen en el Lipodystrophy and the metabolic consequences of altered fat deposition Workshop (Nov 2006, Bethesda, EEUU) Objetivo 3: 1. Análisis por DNA-microarray de biopsias de tejido adiposo subcutáneo de controles sanos, enfermos VIH+ no tratados, enfermos VIH+ con tratamiento HAART que han desarrollado o no lipodistrofia. Se ha realizado un análisis transcriptómico por microarray de DNA de la expresión génica en biopsias de tejido adiposo subcutáneo de los cuatro grupos analizados: controles sanos, enfermos VIH+ no tratados, enfermos VIH+ con tratamiento HAART que han desarrollado o no lipodistròfia. El objetivo global de esta aproximación experimental ha sido identificar genes dianas de acción de los fármacos HAART y/o de la infección vírica (inflamación, efecto de proteínas víricas, infiltración de macrófagos, etc.), no previstos de entrada en el análisis específico. El análisis se ha realizado con la plataforma Human Genome Survey Microarray de Applied Biosystems. Dicha plataforma de DNA-microarray contiene 32.878 sondas que permiten analizar 29.098 genes, siendo en estos momentos, por tanto, la plataforma microarray que proporciona mayor cobertura genómica. Los resultados nos indican que la infección con VIH (pacientes naives al tratamiento) provoca la alteración en la expresión génica en tejido adiposo subcutáneo de parámetros relacionados con la inflamación mediada por quimiocinas y citocinas, relacionadas con macrófagos y con angiogénesis. Muchas de estas alteraciones se mantienen en los pacientes tratados, pero hay otras que cambian, como la aparición de vías 6
relacionadas con inmunidad y defensa y aumento de marcadores de macrófago, por ejemplo. En los lipodistróficos se observa, por ejemplo, la alteración específica de procesos relacionados con el metabolismo lipídico y mitocondrial. Hemos presentado ya un resumen en el Lipodystrophy and the metabolic consequences of altered fat deposition Workshop (Nov 2006, Bethesda, EEUU). 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La síndrome de la lipodistrofia asociada a VIH/HAART (prevalencia de un 60%) se caracteriza por una redistribución de la grasa corporal, dislipemias y resistencia a insulina. En la etiopatogénesis del síndrome se ha propuesto el efecto de los PI en la diferenciación adipocitaria, así como toxicidad mitocondrial por los NRTI. Datos epidemiológicos recientes indican que pacientes VIH no sometidos a tratamiento antirretroviral (naives) también pueden desarrollar lipodistrofia, sugiriendo, por tanto, que la propia infección por el virus podría contribuir a la aparición del síndrome de lipodistrofia. Nuestro trabajo aporta la primera evidencia experimental de la existencia de alteraciones en la expresión génica en el tejido adiposo subcutáneo de los pacientes infectados por VIH naive en el tratamiento. Ello demuestra que la propia infección vírica desempeña un papel clave al provocar alteraciones en el tejido adiposo que posteriormente, agravadas por el tiempo de infección y por el tratamiento, desembocan en la aparición del síndrome de lipodistrofia asociada a VIH/HAART. Asimismo, los datos que estamos obteniendo en lo que será el primer análisis transcriptómico de tejido adiposo en pacientes VIH nos llevan a proponer que la lipodistrofia asociada a VIH/HAART es debida al desarrollo de un estado inflamatorio en el tejido adiposo. Los acontecimientos iniciales en la aparición de la 7
lipodistrofia serían causados porque la propia infección por VIH provoca el desarrollo de un estado inflamatorio en el tejido adiposo a través de un incremento de la exposición local del tejido a citocinas proinflamatorias producidas por el propio tejido (por ejemplo, el incremento que detectamos en TNFα), bien sea por los adipocitos y posiblemente también por los macrófagos y células endoteliales del tejido. Posteriormente, el tratamiento con los fármacos antirretrovirales contribuye a agravar el desarrollo de la lipodistrofia que acabará manifestándose clínicamente transcurrido un cierto tiempo. Nuestros resultados muestran que los fármacos antirretrovirales provocan alteraciones en la expresión génica, toxicidad mitocondrial y apoptosis tanto en el tejido adiposo de los pacientes como también se ha confirmado in vitro con los estudios mediante los cultivos primarios de adipocitos humanos. Por último, nuestros resultados indican que la aparición de lipomas en enfermos VIH posee características moleculares específicas, diferentes a la aparición de la lipoatrofia del tejido adiposo subcutáneo y también a la aparición de lipomas de origen genético. Desde un punto de vista terapéutico, nuestros resultados pueden ayudar a explicar la ineficacia de los tratamientos con fármacos tipo tiazolidindionas, atendiendo a la dramática reducción de su diana PPARγ en tejido adiposo de los pacientes infectados por VIH. Nuestros resultados nos llevan a proponer una terapia antiinflamatoria que prevenga o revierta las alteraciones del tejido adiposo. 8
4. Publicaciones ML Rodríguez de la Concepción, JC Domingo, P Domingo, M Giralt, F Villarroya Uncoupling protein-1 gene expression implicates brown adipocytes in highly active antiretroviral therapy-associated lipomatosis. AIDS 18: 959-960 (2004) Domingo P, Vidal F, Domingo JC. The molecular basis of antiretroviral drugs toxicity: how bad can good drugs be? Curr Med Chem-Antiinfect Agents 2004; 3: 109-133. ML Rodríguez de la Concepción, P Yubero, JC Domingo, R Iglesias, P Domingo, F Villarroya, M Giralt Reverse transcriptase inhibitors alter uncoupling protein-1 and mitochondrial biogenesis in brown adipocytes. Antiviral Therapy 10 (4): 515-526 (2005) F. Villarroya, P. Domingo, M. Giralt Lipodystrophy associated with highly active anti-retroviral therapy for HIV infection: the adipocyte as a target of anti-retroviral-induced mitochondrial toxicity Trends in Pharmacological Sciences 26 (2): 88-93 (2005) 9
Domingo P, Vidal F, Domingo JC, Veloso S, Sambeat MA, Torres F, Sirvent J, Vendrell J, Matias-Guiu X, Richart C. Tumor necrosis factor alpha in fat redistribution syndromes associated with combination antiretroviral therapy: its role in subcutaneous adipocyte apoptosis. Eur J Clin Invest 2005 ; 35 : 771-780. JP Guallar, MR Vila, E López-Gallardo, A Solano, JC Domingo, J Gamez, M Pineda, JL Capablo, P Domingo, AL Andreu, J Montoya, M Giralt, F Villarroya Altered expression of master regulatory genes of adipogenesis in lipomas from patients bearing trna(lys) point mutations in mitochondrial DNA. Mol Genet Metab 89(3):283-5 (2006) M Giralt, P Domingo, JP Guallar, ML Rodríguez de la Concepción, M Alegre, JC Domingo, F Villarroya. HIV-1 infection alters gene expression in adipose tissue, contributing to HAART-associated lipodystrophy. Antiviral Therapy 11:729-740 (2006) Muñoz A, Rodríguez Vidigal F, Domingo P. Patogenia de la lipodistrofia y de las alteraciones metabólicas asociadas a la infección por VIH. Med Clin (Barc) 2006; 127: 465-474. Domingo P, Vidal F. Toxicidad a largo plazo de los análogos de nucleósidos/ nucleótidos. Enferm Infecc Microbiol Clin 2006 ; 5 : 22-29. 10
Domingo P, Vidal F. Manejo de la toxicidad asociada a análogos de nucleósidos o cómo sustituir fármacos sin incrementar la complejidad del régimen. Enferm Infecc Microbiol Clin 2006 2006; 5: 45-53. Vidal F, Domingo JC, Villarroya F, Saumoy M, Giralt M, Guallar JP, Torres F, Cihlar T, Domingo P. Assessment of the in vitro cytotoxicity and mitochondrial toxicity of tenofovir and its combinations with other antiretrovirals in human renal proximal tubule cells. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 3824-3832. Rodríguez de la Concepción, M.L.; Guallar, J.P.; Iglesias, R.; Yubero, P.; Domingo, J.C.; Domingo, P.; Villarroya, F.; Giralt, M. Involvement of the brown adipocyte in pharmacologically induced lipomatosis. 13th European Congress on Obesity, Praga International Journal of Obesity 28 (Suppl 1): S102 (2004) F Villarroya, JP Guallar, ML Rodríguez de la Concepción, JC Domingo, P Domingo, M Giralt Adipose tissue disturbances in response to HIV infection and antiretroviral treatment. From inflammation to mitochondrial toxicity. 14th European Congress on Obesity, Atenes Obesity Reviews 6 (Suppl.1): 9 (2005) 11
Guallar, J.P.; Domingo, P.; Rodríguez de la Concepción, M.L.; Alegre, M.; Domingo, J.C.; Villarroya, F.; Giralt, M. HIV-1 infection alters mitochondrial, metabolic and adipokine gene expression in subcutaneous adipose tissue. 7th International Workshop on Adverse Drug Reactions and Lipodystrophy in HIV. Dublin Antiviral Therapy 10 (Suppl.3): L19 (2005) Rodríguez de la Concepcion, ML.; Guallar, J.P.; Yubero, P.; Domingo, J.C.; Alegre, M.; Iglesias, R.; Domingo, P.; Giralt, M.; Villarroya, F. Role of disturbances of brown with respect to white adipocyte biology in HAART-associated lipodystrophy and lipomatosis. Studies in vitro and in vivo. 7th International Workshop on Adverse Drug Reactions and Lipodystrophy in HIV. Dublin Antiviral Therapy 10 (Suppl.3): L19 (2005) 12