VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de Microbióloga Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. Noviembre de 2008

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA APROBADO Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga Directora

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA APROBADO Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga Directora Rosario del Pilar Ortiz, Bacterióloga Jurado Lorena Valencia, Microbióloga Jurado

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA APROBADO Ingrid Schuler, Ph. D Decana Académica Janeth Arias Palacios M.Sc, M.Ed. Directora de carrera

Le doy gracias a Dios por permitirme lograr este triunfo, a mis padres por el esfuerzo y apoyo que me han brindado, ya que sin su ayuda no lo hubiera podido lograr, a mis hermanos que de una u otra forma me han brindado su confianza y apoyo para seguir adelante, al Gordo por brindarme su amor y apoyo incondicional, a toda mi familia y en especial a mi mamá, que ha sido la persona que ha estado conmigo en todo este proceso brindándome lo mejor de sí y con muchas ganas de que yo comience una nueva etapa en mi vida como es la de ser Profesional.

AGRADECIMIENTOS Al Laboratorio de salud Publica del Huila, por permitirme llevar a cabo este trabajo en sus instalaciones, A la Doctora Gloria María Rivera Díaz, por brindarme su apoyo y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo, al Dr. Gerardo Navas del Instituto Nacional de Salud, por su valiosa colaboración y al personal del área ambientes del Laboratorio por su colaboración. vii

TABLA DE CONTENIDO RESUMEN... xiii 1. INTRODUCCIÓN... 14 2. MARCO TEORICO... 16 2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN... 16 2.1.1. Validación... 17 2.1.2. Validación primaria... 17 2.1.3. Validación secundaria... 18 2.1.4. Tipos de validación... 19 2.1.4.1. Validación prospectiva... 19 2.1.4.2. Validación retrospectiva... 19 2.1.4.3. Validación concurrente... 20 2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación... 20 2.1.5.1. Limite de detección... 20 2.1.5.2. Limite de cuantificación... 21 2.1.5.3. Exactitud... 21 2.1.5.4. Especificidad... 21 2.1.5.5. Selectividad... 22 2.1.5.6. Precisión... 22 2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO... 23 2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme... 23 2.2.1.1. Coliformes Totales... 23 2.2.1.2. Coliformes fecales... 24 2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS... 25 2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras)... 25 2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves... 27 2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba... 27 2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas... 28 viii

2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras... 28 2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA... 29 2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana... 29 2.4.2. Características del filtro de membrana... 29 2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana... 30 2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana... 30 3. JUSTIFICACIÓN... 33 4. OBJETIVOS... 35 4.1. OBJETIVO GENERAL... 35 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 35 5. MATERIALES Y MÉTODOS... 36 5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN... 36 5.2. MATERIALES... 36 5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS... 38 5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND... 39 5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO... 39 5.5.1. Control de esterilidad... 39 5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia... 40 5.6. CONTROL DE AMBIENTES... 41 5.7. CONTROL DE EQUIPOS... 41 5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO... 42 5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland... 42 5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad... 44 5.8.3. Validación del método de filtración por membrana... 47 5.8.3.1. Descripción de soluciones y muestras... 48 5.8.4. Elaboración de cartas R/ para el control de calidad analítica interna del laboratorio... 49 5.8.5. Evaluación de la validación... 49 5.9. INFORME DE RESULTADOS... 50 ix

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS... 51 6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA. 51 6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO... 53 6.2.1. Control de esterilidad... 53 6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia... 54 6.3. CONTROL DE EQUIPOS... 55 6.4. CONTROL DE AMBIENTES... 56 6.5. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA... 57 6.5.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland... 58 6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad... 61 6.5.3. Validación del método de filtración por membrana... 63 6.5.3.1. Determinación de la precisión... 67 6.5.3.2. Determinación de la exactitud... 69 6.5.4. Cartas de control R... 74 7. CONCLUSIONES... 76 8. RECOMENDACIONES... 77 9. BIBLIOGRAFÍA... 78 9.1. RECURSOS ELECTRONICOS... 80 10. ANEXOS... 81 x

LISTA DE TABLAS TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras... 57 TABLA 2 Comparación de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensión de E. coli... 59 TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensión de E. coli... 60 Tabla 4 Calculo de la media, desviación estándar y coeficiente de variación de las concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/ml... 62 TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo.... 64 TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-fc.... 65 TABLA 7 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes totales... 68 Tabla 8 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes fecales... 68 Tabla 9 Recuperación M1 + A1, coliformes totales... 70 TABLA 10 Recuperación M1 + A1, coliformes fecales... 71 TABLA 11 Recuperación M2 + A2, coliformes totales... 72 TABLA 12 Recuperación M2 + A2, coliformes fecales... 73 xi

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland..... 43 FIGURA 2. Esquema para preparar la concentración de 5 bacterias/ml... 46 FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey... 51 FIGURA 4 Identificación bioquímica de E. coli... 52 FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre... 52 FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-fc... 55 FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-fc... 55 FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-fc.... 61 FIGURA 9 Recuento de los estándares de 5, 20 y 70 bacterias /100 ml de E. coli... 63 FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-fc.... 67 FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales... 74 FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales... 75 xii

RESUMEN Con el fin de contribuir con los procesos de Mejoramiento de la Calidad del Laboratorio de Salud Publica del Huila y con el objetivo de iniciar un proceso de acreditacion, se realizó una validación secundaria de tipo concurrente del método de filtración por membrana para la detección de coliformes totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano. Al inicio del proceso de validación se reviso el historial de mantenimiento y calibración de los equipos para garantizar los procedimientos y resultados obtenidos. Antes de iniciar la etapa de validación se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, para comprobar que efectivamente se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/ml. Así mismo, se realizo un ensayo preliminar de repetibilidad con el fin de obtener un dominio del método. Para la validación se siguió un diseño experimental establecido por el Instituto Nacional de Salud, en donde la cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseño experimental fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras más adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El estudio se procesó durante seis días, en donde cada lote era un día. La precisión del método fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada solución, las cuales debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5% de la concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor mínimo de interés que en este caso fue 8 y la exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de Escherichia coli en las dos muestras naturales. Al finalizar el estudio de validación se comprobó que mediante la validación realizada se cumplieron con los dos parámetros evaluados, la precisión y la exactitud.

1. INTRODUCCIÓN El recurso hídrico para el consumo humano debe ser entregado a las comunidades, con excelente calidad, la cual inicia desde la misma generación, protección de fuentes y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio domiciliario. A pesar de ello Las enfermedades derivadas de la ingestión de agua son muy frecuentes en los países en desarrollo y dentro de estos hay zonas de mayor o menor compromiso epidemiológico. El acceso de los colombianos al agua potable deja mucho que desear en el país a pesar de las cifras globales que demuestran que el 56% de la población rural, el 97% de la urbana, para un total general del 86% tienen agua potable. Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y químicas que tienen origen en la transmisión de estos agentes por el agua adquieren una especial connotación sanitaria cuando las poblaciones ribereñas con inadecuado suministro del agua potable o aquellas comunidades que a través de muchos años han carecido del recurso hídrico necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado. En este sentido, los laboratorios de salud pública tienen la obligación de proteger las comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnología y la metodología que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen los ciudadanos. Cada laboratorio debe utilizar métodos y procedimientos apropiados para todas las calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Estos incluyen muestreo, transporte, almacenamiento y preparación de los elementos a ser calibrados o ensayados. 14

Los laboratorios deben realizar controles internos los cuales garantizan que van generar resultados altamente confiables, mediante el seguimiento de procedimientos altamente calificados, los cuales van a depender del programa que se haya implementado en el laboratorio donde generaran idoneidad y confiablidad de los resultados emitidos. Estos programas de control interno incluyen evaluación continua de los principales materiales y objetos que se utilizan en los diferentes análisis, tales como, control de los medios de cultivo a utilizar, personal idóneo, equipos, estandarización y documentación de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del procedimiento y asegurar que este se está efectuando en forma correcta cada vez que se ejecute, lo cual se lograra con la realización de la validación de los métodos utilizados por el laboratorio para sus respectivos análisis. La validación de una técnica es el proceso por el cual se establece mediante estudios de requerimientos la aplicación analítica propuesta, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Con ella se determinan las posibles variaciones que se presentan entre diferentes números de ensayos y de esta manera disminuir las posibilidades de error dentro del método, generando un alto grado de confianza en los resultados finales arrojados por el método validado. Basada en etas premisas el presente trabajo de grado tiene como finalidad Validar el Método de Filtración por Membrana para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano, con el fin de asegurar que el laboratorio va a tener un alto grado de confiabilidad en sus resultados emitidos. 15

2. MARCO TEORICO Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a través de las excretas de seres humanos y animales, en particular de las heces. El uso de esta agua para beber o preparar alimentos, el contacto de ella durante el baño o el lavado de ropa, e incluso la inhalación de vapor o aerosoles, pueden producir la infección. La carga bacteriana incide directamente en la potabilidad del agua y en las características y las condiciones que la hacen apta para el consumo humano. En muchas regiones, esta calidad de agua se consume sin ningún tipo de control de calidad ni tratamiento. Las enfermedades relacionadas con la insalubridad del agua y la falta de saneamiento son una de las causas de morbimortalidad. El número total anual de defunciones producidas por diarreas y enteritis es aproximadamente de 12.000 casos al año y la morbilidad por las mismas causas es de 300.000 casos al año. La población más afectada en Colombia por estos factores es la población rural y marginal dispersa de la zona pacifica, la costa atlántica y el suroriente del país, sobre todo en lugares densamente poblados. (OTALORA, 2005). Por esta razón se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico del agua, que asegure que es apta para el consumo humano y que posee las condiciones de calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental. 2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN Para conseguir la idoneidad en un resultado analítico es imprescindible la utilización de un método confiable. Para asegurar confiabilidad, los métodos analíticos deben someterse a un procedimiento de validación ya sea de carácter prospectivo, retrospectivo o de revalidación; para comprobar, si el método es lo suficientemente confiable, y si los resultados previstos satisfacen los requisitos analíticos prefijados. 16

La validación constituye un requisito imprescindible para las buenas prácticas de laboratorio, conforme lo establecen diferentes agencias regulatorias y la determinación de la incertidumbre debe formar parte de este proceso de validación y es esencial para un control continuo de la calidad. A partir del criterio de que no existe un modelo único para validación y que los parámetros a evaluar cambian de acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones y de los requerimientos analíticos particulares; solo es recomendable el seguimiento de una guía general para la validación de métodos analíticos, en conformidad con pautas aceptadas internacionalmente. (OTALORA, 2005). 2.1.1. Validación Consiste en demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso especifico producirá de forma consistente y permanente productos que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO technical Report Series, No. 823, 1992). Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003), siendo su principal objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. La validación de métodos analíticos consiste es la obtención de pruebas documentadas que demuestran que un método analítico es lo suficientemente confiable para producir un resultado previsto dentro de intervalos definidos. (CORTES, 2006). 2.1.2. Validación primaria La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene la meta de establecer los límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones 17

numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés. Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayos especialmente diseñados. Los laboratorios que desarrollan un método en casa o una variante de una norma existente deben realizar los pasos de la validación primaria. (PADILLA, 2007) 2.1.3. Validación secundaria Demostración por experimento que un método establecido funciona de acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario. Esta validación se denomina verificación la cual es la confirmación mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos. (ISO 9000:2000). Normalmente la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria. (GTC 84, 2003). Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas, para así optimizar sus procesos, lo cual implica reducir gastos, el tiempo de desarrollo de la técnica, y generar confiabilidad en los resultados que se emiten. De igual forma, sirve para dar cumplimiento a las normas legales pertinentes o al logro de cumplimiento de normas que aunque no son de obligatorio cumplimiento contribuyen a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de confiabilidad que generan confianza dentro de sus clientes. 18

2.1.4. Tipos de validación 2.1.4.1. Validación prospectiva Se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Se debe realizar un análisis de riesgo para determinar si podrían conducir a situaciones críticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que sucedan. Posteriormente, se efectúan y se evalúan los ensayos y se hace una valoración general. Si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva validación demuestre su carácter satisfactorio. Además este tipo de validación busca prever errores o limitar el riesgo de que estos se presenten durante el proceso. (CORTES, 2002). 2.1.4.2. Validación retrospectiva Se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información histórica del proceso. Con esta recopilación de datos históricos se obtiene documentación útil para la determinación de la reproducibilidad de dicho proceso. Por esto, para la obtención de información no es necesario aplicar ensayos analíticos, o supervisión del proceso en forma explícita. (GALEANO, 2007). Los pasos involucrados en este tipo de validación requieren la preparación de un protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos analizados. Dentro de este tipo de validación es necesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos analíticos y especificaciones; es aplicada para productos que se encuentran en el mercado que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones. (PADILLA, 2007). 19

2.1.4.3. Validación concurrente La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables criticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso está en estado productivo. Sin embargo cada aproximación tiene sus características y limitaciones, y por lo tanto, antes de desarrollar una validación deberá evaluarse que tipo de validación pueda dar mejor información sobre la seguridad y la estabilidad del proceso. (GARCIA, 2001). 2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación Los parámetro de rendimiento se establecen de acuerdo a la categoría a la que pertenecen el método y siguiendo los requisitos exigidos por distintos organismos internacionales que incluyen: intervalo de trabajo, linealidad, sensibilidad, limite de detección, limite de cuantificación, exactitud, precisión, repetibilidad, reproducibilidad, robustez, incertidumbre, etc. Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de rendimiento se llevan a cabo mediante equipos que cumplen con las especificaciones, funcionan correctamente y están adecuadamente calibrados. Igualmente el operador que realiza los estudios debe ser competente en el campo de trabajo en estudio y debe contar con suficientes conocimientos respecto al trabajo, como para poder tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones realizadas a medida que progrese el estudio. (OTALORA, 2005). 2.1.5.1. Limite de detección Es la concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas especificas. 20

También se conoce como mínima concentración neta detectable o limite de determinación/limite de decisión y El mínimo contenido de analito, de existir analito presente, que se detectara y se podrá identificar. El límite de detección es un número, expresado en unidades de concentración (o cantidad) que describe el más bajo nivel de concentración (o cantidad) de una sustancia que puede determinarse como estadísticamente diferente del blanco. (OTALORA, 2005). 2.1.5.2. Limite de cuantificación Es la concentración mínima del analito que puede ser cuantificada con exactitud y precisión en una muestra, bajo condiciones analíticas especificas. 2.1.5.3. Exactitud Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximo posible al valor verdadero. A diferencia de la precisión que refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (GALEANO, 2007). 2.1.5.4. Especificidad Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente, el compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se esperan estén presentes en la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser precursores de la síntesis o subproductos de la misma, impurezas, excipientes o productos de degradación. (WHO TECHNICAL REPORT, No823, 1992). 21

2.1.5.5. Selectividad Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos los analitos de interés, o cuando diferentes microorganismos pertenecientes al mismo grupo deben ser detectados por el método. 2.1.5.6. Precisión Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote del material homogéneo. (USP 29, 2006). El parámetro estadístico que caracteriza a este estudio es la variación estándar o preferiblemente el coeficiente de variación (variación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y GONZALEZ, 1996). Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación (USP 29, 2006). Reproducibilidad: Es la medida de la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homogénea, pero analizado en diferentes laboratorios, por diferentes analista, diferentes días, diferentes instrumentos (precisión entre laboratorios). Repetibilidad: Es la medida de la precisión de un método cuando este se realiza por el mismo analista, el mismo día, los mismos reactivos, los mismos instrumentos (precisión dentro del ensayo). 22

2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO La finalidad principal de un laboratorio de agua, es producir información precisa y confiable que muestre las características cualitativas del cuerpo de agua bajo estudio. Un elemento esencial para garantizar que los resultados analíticos son precisos y confiables es el control de la calidad analítica precisa CCA, el cual consiste en la aplicación rutinaria de los procedimientos necesarios para controlar el proceso de medición. El objetivo primordial de un programa de control de calidad interno es el de asegurar que los resultados que se obtengan en el laboratorio se enmarquen dentro de los límites aceptables de desviación a partir de los valores verdaderos. Se pueden hacer duplicados de muestras naturales, de estándares, de muestras adicionadas, o de blancos y para ello se utilizan las cartas de control. Las cartas R son cuadros de control, en los cuales el ámbito promedio de las muestras duplicadas R es la línea central. El límite de control inferior es cero y el límite de control superior LCS se estima como: LCS = 3.27 x R/ Las cartas R hacen posible el control de los errores aleatorios y el límite de detección con los blancos. (OTALORA, 2005) 2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme 2.2.1.1. Coliformes Totales Los coliformes totales son un grupo de microorganismos que comprende varios géneros de la familia enterobacteriaceae. Este grupo de microorganismos se encuentra ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo, además, es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. 23

Se caracterizan por ser bacilos Gram. negativos, aerobios o anaerobios facultativos, son oxidasa negativa, no formadores de esporas y son capaces de fermentar la lactosa con producción de acido y gas a 35ºC +/- 2 C en un tiempo máximo de 48 horas. (ORDOÑEZ, 2000). El grupo de bacterias coliformes es el principal indicador de la adecuación del agua para usos domésticos, industriales o de otro tipo. La experiencia ha mostrado que la densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminación, y por tanto, de la calidad sanitaria. (AWWA-WPC, 2000). 2.2.1.2. Coliformes fecales Los coliformes fecales, también denominados coliformes termotolerantes, se caracterizan por soportar temperaturas hasta 45ºC; comprende un grupo muy reducido de microorganismos, entre los que se destaca Escherichia coli siendo el más reconocido representante de contaminación de alimentos por origen fecal, por lo tanto es el principal indicador de higiene en los alimentos. (ORDOÑEZ, 2000). Escherichia coli se caracteriza por ser una bacteria Gram. negativa, capaz de fermentar la lactosa a una temperatura entre 44ºC y 44.5ºC, es indol positivo, y tiene un origen específicamente fecal, pues está siempre presente en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentra en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal. Desde hace tiempo se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son de fácil detección y se pueden enumerar en el agua. La presencia de Escherichia coli en muestras de agua potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de tratamiento de aguas, en la integridad del sistema de distribución, y por tanto evidencia de contaminación de diferentes orígenes: suelo, superficies de agua dulce y tracto digestivo. (MILLIPORE, 2005). 24

2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS El agua cruda o el agua inadecuadamente tratada, puede contener microorganismos patógenos, es decir, que pueden causar enfermedades y aun la muerte. Las bacterias del grupo coniforme, están asociadas con los organismos patogénicos y son un buen índice del grado de seguridad bacteriológico del agua. Las bacterias coliformes viven y hacen parte de la flora del intestino humano y de otros animales, y son descargados en gran cantidad en las heces humanas y las de esos animales. Cuando aparecen bacterias coliformes en el agua, se asume que otra clase de microorganismos capaces de causar enfermedades, pueden estar presentes. De igual forma, su ausencia es un indicativo de que el agua es bacteriológicamente segura para el consumo humano. En el análisis microbiológico de las aguas crudas no se buscan directamente las bacterias o virus patógenos, sino algunas bacterias indicadoras de contaminación por heces fecales y que sin ser patógenas residen en el intestino del hombre y de los animales, las bacterias coliformes. Existen diversas técnicas de análisis microbiológico que permiten detectar la presencia de ciertos microorganismos indicadores de contaminación tales como el método de filtración por membrana, la técnica del NMP o fermentación en tubos múltiples, los cuales son utilizados como control de calidad en acueductos o industrias donde se requiere procesar un gran número de muestras. (ORTIZ, 1999) 2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras) Todo programa que se establezca para el control de calidad del agua tiene como base fundamental el muestreo, la seriedad y responsabilidad con que se lleve a cabo esta actividad. 25

Para la recolección de muestras de aguas se deben utilizar frascos de vidrio de fácil esterilización los cuales son suministrados por el laboratorio que realiza el análisis, con capacidad de 300 ml. El frasco estéril debe ser llenado hasta las tres cuartas partes de su capacidad y tapado inmediatamente. Si la muestra es agua tratada con cloro, el frasco debe contener 0.5 ml de tiosulfato de sodio al 10%. La solución de tiosulfato de sodio actúa como inhibidor del cloro para evitar la muerte de los microorganismos presentes en la muestra. (PALMA, 1999) La muestra debe llevarse lo más rápidamente posible al laboratorio (no demorar más de 4 horas). Si es necesario demorarla más tiempo se debe refrigerar desde el momento de la toma (no más de 20 horas). Condiciones generales para la recolección de muestras: Disponer de los recipientes y demás materiales apropiados según el estudio que se vaya a realizar. Cerciorarse que el frasco tenga el aditivo apropiado (Tiosulfato de sodio) Asegurarse que la composición de la muestra tomada, refleje fielmente la del total del suministro o fuente de agua, es decir, que sea representativa del sistema. Utilizar técnicas de recolección que no afecten por descuido u omisiones la calidad del agua recolectada, con respecto a su fuente original. Cuando se vaya a tomar muestra para análisis microbiológico no enjuagar el frasco con la muestra. Para análisis físico-químico el frasco no debe tener aditivos y debe enjuagarse el frasco con la misma muestra. Identificar la muestra. Consignar inmediatamente después de la toma todos los datos importantes que permitan identificar correctamente la muestra: 26

* Lugar exacto del muestreo * Fecha y hora de toma * Cloro residual (total o libre) encontrado en el momento del muestreo * Otras condiciones especiales: si la muestra viene directamente de la red de distribución, de un tanque subterráneo o elevado, pozo, etc. * Si es agua de río, quebrada, laguna, estanque, etc, o motivo de la solicitud (Intoxicación, control, etc.) * Anotar las condiciones en el momento de tomar la muestra (temperatura del ambiente, temperatura del agua, viento, lluvia, etc.). 2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves Se debe limpiar cuidadosamente el grifo o tubo. La abertura de salida y sus inmediaciones deben flamearse con llama de alcohol. Se deben escoger grifos que no tengan escapes por el vastazo, debido a que el agua que sale por allí se contamina e invalida la muestra. Se deja fluir el agua lo más intensamente posible para quitar las impurezas adheridas. Posteriormente se debe regular el chorro de agua al espesor de un lápiz. Se llena rápidamente el frasco hasta la mitad más o menos, si es para examen microbiológico evitando salpicaduras y totalmente lleno si es para análisis físico-químico. En pozos con bomba debe bombearse lenta y uniformemente durante 10 minutos antes de tomar la muestra. 2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba Preparar el frasco de la siguiente manera: 27

Fijar un alambre al cuello del frasco. Envolver el conjunto en papel de aluminio y esterilizar. Al tomar la muestra no tocar el exterior del frasco. No tomar de la parte sobrenadante del pozo. 2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas Se debe estudiar la situación de acuerdo con los recursos del laboratorio, objeto del examen, fuente de contaminación, etc., excepto en casos especiales, no tomar muestra superficialmente en sitios donde permanezca estancada ni donde se presenten turbulencias por agitación accidental. Se realiza el procedimiento de la siguiente manera: * Colocarse frente a la dirección de las corrientes de agua. * Sumergir el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 a 20 cm, realizando un semicírculo en la dirección de la corriente. Así se evita contaminar el agua por las manos del operario. Si no hay corriente de agua, crearla por el movimiento del frasco. * Evitar recoger material flotante. Este se puede tomar como muestra especial. * Evitar tomar material del fondo. 2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras Si las muestras no van a ser analizadas antes de una hora de haber sido tomadas, deben refrigerarse durante el transporte a 4ºC, y deben estar completa e inconfundiblemente identificadas. No debe de transcurrir más de 6 horas entre la toma de muestra y el análisis y máximo 2 horas en el laboratorio. Si esto no se puede cumplir, las muestras deben ser conservadas a temperatura inferior a 4ºC sin ser congeladas. 28

2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA Para la detección de coliformes totales y coliformes fecales (E. coli) es utilizado el método de filtración por membrana, el cual es un método altamente reproducible, puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. También se encuentra entre los métodos standards. A los efectos de la filtración por membrana debe replantearse la definición de coliformes: bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 horas de incubación a 35ºC +/- 2 C. La determinación de coliformes fecales por filtración puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-fc e incubando a 44,5ºC. 2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por un filtro de celulosa de 0.45 micras de tamaño de poro, para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo coniforme y las mesofílicas. El filtro es colocado en un medio de cultivo especifico para lo que se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y microorganismos mesofílicos), incubando a 35ºC +/- 2ºC durante 18 a 20 horas. (PALMA, 1999 ). 2.4.2. Características del filtro de membrana Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una completa retención de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos filtros estén libres de químicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo bacteriano, que posean una velocidad de filtración satisfactoria. (MILLIPORE, 2005). 29

2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La lectura de resultados se da en un menor tiempo (24 horas) a comparación del método NMP, además se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios adecuados. El análisis se dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la muestra o haciendo inóculos muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a analizar. (PALMA, 1999 ). 2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana Colocar el portafiltros estéril sobre la base del manifold Colocar el embudo estéril sobre el receptáculo y fijarlo con las pinzas que trae el equipo Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estéril Dejar filtrar aplicando vacio Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 30 mlde alcohol al 70% 30

Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol encendido durante 3 minutos Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar Adicionar nuevamente 100 ml de agua destilada estéril y dejar filtrar Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo Con pinzas estériles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la cuadricula hacia arriba, sobre la parte porosa del receptáculo 31

Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar Agua Tratada Agua Cruda Filtrar 100 ml de cada muestra a analizar Diluir la muestra 1/10 y filtrar Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del manifold, retirar el embudo, tomar el filtro con pinzas estériles y colocarlo sobre la superficie del medio Endo y m-fc Incubar las cajas a la temperatura adecuada: Medio Endo: 37 C +/- 2 C Medio m-fc: 44.5 C en baño maría Realizar el recuento de las colonias características: Medio Endo: colonias rojas Medio m-fc: colonias azules (Apha, 2005) 32

3. JUSTIFICACIÓN La acreditación es un proceso que contribuye a la mejora continua de la calidad de los servicios que prestan los laboratorios. La participación en los procesos de acreditación es decisión de la dirección de cada laboratorio, y por lo tanto, debe ser accesible a todos los establecimientos que estén debidamente registrados y habilitados por las autoridades nacionales del país. El propósito de la acreditación es formalizar el reconocimiento, por un ente independiente, que los laboratorios han implementado un sistema que pretende garantizar la calidad de sus servicios. Para llevar a cabo el proceso de acreditación los laboratorios deben dar cumplimiento a la norma ISO/IEC 17025 Requisitos generales para la competencia de laboratorios de prueba y calibración, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación del laboratorio. Esta norma contiene todos los requisitos que los laboratorios de ensayo y de calibración deben conocer, si desean demostrar que operan de acuerdo a un sistema de calidad, son técnicamente competentes y son capaces de generar resultados válidos técnicamente. Según la norma ISO/IEC 17025 los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio, tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes bibliográficas o desarrollados por otros laboratorios. Además, es necesario que el laboratorio valide los métodos de referencia; aunque en este caso, no es necesario que el laboratorio realice una validación completa. El laboratorio de salud pública del Huila (LSPH) está en busca de la acreditación, la cual tiene por objeto reconocer la competencia técnica y la idoneidad de organismos de certificación e inspección, con las normas y los reglamentos que le son de aplicación, a través de evaluación y auditoría de las mismas, siguiendo criterios transparentes y públicos. Debido a esto se hace necesario validar el método de filtración por membrana para la detección de Coliformes totales y Escherichia coli, en muestras de para consumo 33

humano, el cual es utilizado diariamente en el laboratorio para el análisis microbiológico aguas para consumo humano. 34

4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL Realizar la validación secundaria del método de filtración por membrana para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila. 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Evaluar la calidad de los medios de cultivo Endo y m-fc por medio de pruebas de esterilidad, selectividad y eficacia. Evaluar la precisión del método de filtración por membrana para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano. Evaluar la exactitud del método de filtración por membrana para la detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano. Realizar el análisis estadístico de los resultados obtenidos durante el estudio. 35

5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN Se realizó un estudio experimental basado en la metodología aplicada por el Instituto Nacional de Salud, donde la validación fue de tipo concurrente, ya que la información fue obtenida durante el tiempo que duro el estudio, realizando monitoreo de todo el proceso para garantizar que se estaba trabajando bajo control. El presente trabajo de grado fue realizado en el Laboratorio de Salud Publica del Huila. Para llevar a cabo la validación del método de filtración por membrana, se analizaron dos muestras de agua, que poseían las características requeridas para las cuales el método es utilizado rutinariamente, así mismo, se evaluaron los parámetros de precisión y exactitud del método. 5.2. MATERIALES Filtros de membrana (poro de 0.45um) Pinzas Micro pipeta automática 100-1000 UL Puntas azules estériles Cepas microbianas Cepa de Escherichia coli con número de referencia ATCC 25922 Cepa de Staphylococcus aureus con número de referencia ATCC 25923 36

Material de vidrio Tubos tapa rosca Frascos grandes ámbar con alcohol al 70% Frascos grandes ámbar con agua destilada estéril Frascos Schott de 250 ml Material de plástico Cajas de petri grandes Medios de cultivo Cajas de petri plásticas con medio Endo listo para su uso Cajas de petri plásticas con medio m-fc listo para su uso Agar plate Count Agar OGY Agar Mc Conkey Agar Sangre Reactivos Cloruro de bario Acido sulfúrico 37

Equipos Incubadora a 35 C +/- 2 C Baño de maría a 44.5 C Espectrofotómetro Vortex Equipo de filtración por membrana 5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS Se verificó que las cepas de referencia utilizadas para el estudio de validación, ATCC 25922 Escherichia coli y ATCC 25923 Staphylococcus aureus, estuvieran viables y con una pureza del 100%. El Laboratorio de Salud Publica cuenta con su propio cepario. Las cepas se encuentran conservadas en leche descremada a -70 C. Se tomo un vial de cada cepa y se sembró por agotamiento en medio Mc Conkey la cepa de Escherichia coli y en agar sangre la cepa de Staphylococcus aureus, las cuales fueron incubadas a 37 C durante 24 horas. Pasado el periodo de incubación se procedió a realizar coloración de Gram. e identificación bioquímica de cada cepa, utilizando API 20 E para E. coli y realizando prueba de oxidasa, catalasa y coagulasa para la S. aureus. De igual manera la cepa se identificó en forma automatizada por el equipo de Microscan, logrando un aceptabilidad de 99.9% con respecto a su identificación.. Determinada la pureza y viabilidad de cada cepa, se realizaron repiques en los respectivos medios, para el trabajo diario y así mantener las cepas en fase exponencial. 38

5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND Se preparo el tubo 0.5 de la escala de Mcfarland, utilizando 0.05 ml de cloruro de bario al 1% y 9.95 ml de ácido sulfúrico al 1% el cual contenía una pureza del 96.3% leyéndose su absorbancia a una longitud de onda de 620nm. 5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Para la detección de coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano se utilizaron los medios de cultivo Endo para Coliformes Totales y el medio m-fc para la detección de Escherichia coli. Estos medios de cultivo son medios que vienen listos para su uso, por lo tanto se verificó su esterilidad, selectividad y eficacia para así poder comprobar las especificaciones entregadas por el fabricante (Palma, 1998). Así mismo se realizo la prueba de esterilidad para los medios de cultivos preparados, agar Mc Conkey, agar Ogy, agar Plate Count y para el agar sangre el cual también viene listo para el uso, como también se realizo este control al agua destilada estéril. 5.5.1. Control de esterilidad La prueba de esterilidad de los medios de cultivo utilizados para el análisis se realizó de la siguiente manera: Se seleccionó aleatoriamente el 10% de los medios de cultivo que se utilizaron para la validación. Las cajas fueron hidratadas con agua destilada estéril. Las cajas con medio Endo se incubaron a 37 C durante 24 horas y las cajas con medio m-fc a 39

44.5 C, con el fin de verificar que estos medios no presentaran crecimiento de ningún tipo de microorganismo. (SARTORIUS, 2003). Se sirvieron en cajas de petri estériles los medios Mc Conkey, Plate Count y OGY, tomando el 10% de cada medio para su respectivo análisis. Se incubo a 37 C durante 48 horas. Se verifico que pasado el tiempo de incubación no hubiese crecimiento de ningún tipo de microorganismo (Allaert, 2002) Se comprobó la esterilidad del agua destilada estéril que se utilizó para la hidratación de los medios de cultivo, para las suspensiones y diluciones bacterianas. Se tomaron 400 ml de agua la cual fue analizada por el método de filtración por membrana, tomando 100 ml para cada replica. Se realizaron cuatro replicas de las cuales 2 fueron incubadas en medio Endo a 37 C y las otras dos fueron incubadas en medio m-fc a 44.5 C durante 24 horas. Se evaluó el crecimiento solamente de estos dos microorganismos ya que los medios son selectivos para el microorganismo en estudio (E. coli) según las especificaciones del fabricante. 5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia Para evaluar la selectividad y eficacia de los medios Endo y m-fc se utilizó una suspensión de Staphylococcus aureus y una suspensión de Escherichia coli obtenidas del cepario del Laboratorio de Salud Publica del Huila. Cada suspensión fue realizada en 10 ml de agua destilada estéril y comparada con la turbidez del tubo 0.5 del patrón de Mcfarland, las cuales fueron analizadas por el método de filtración por membrana, evaluando simultáneamente las cajas con medio Endo y las cajas con medio m-fc incubando a las respectivas temperaturas. Para comprobar la selectividad y eficacia de cada medio, se verifico visualmente que solo hubiera crecimiento de Escherichia coli y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus, ya que son medios listos para el uso. 40

El medio Endo se utiliza para la identificación de coliformes totales a 37 C durante 24 horas, usando filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 micras. Al pasar la muestra de agua a través de este filtro mediante la aplicación de vacio las bacterias las cuales son de mayor tamaño quedan retenidas en este. Los coliformes totales que fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metálico. (SARTORIUS, 2003). El medio m-fc se utiliza para la determinación de Escherichia coli y coliformes fecales, a temperatura de incubación de 44.5 C. Estos microorganismos crecen formando colonias de color azul intenso brillantes y convexas (SARTORIUS, 2003). 5.6. CONTROL DE AMBIENTES Se seleccionaron tres puntos de muestreo. Mediante la técnica de sedimentación, en cada punto se colocó una caja con agar OGY para el recuento de hongos y levaduras y una caja con agar Plate Count para el recuento de bacterias mesófilas, durante 15 minutos. Las cajas con agar Plate count fueron incubadas a 37 C +/- 2 C durante 24 horas, y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 días. Finalizado el periodo de incubación, se realizo el recuento de microorganismos. Este procedimiento fue realizado cada vez que se realizaba el estudio de validación. 5.7. CONTROL DE EQUIPOS Se reviso la documentación de mantenimiento y calibración de equipos y se llevo el registro del uso de cada uno de los equipos utilizados en el estudio de validación, mediante la utilización de formatos de registro que ya tiene establecido el Laboratorio de Salud Publica del Huila. 41

5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO La metodología para realizar la validación del método de filtración por membrana, se llevo a cabo de acuerdo al protocolo descrito por el Instituto Nacional de Salud. (Palma, 1998). Antes de llevar a cabo el proceso de validación se realizó la estandarización del tubo 0.5 del patrón de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de obtener un dominio del método. 5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland Se realizo la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland para comprobar que efectivamente se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/ml, realizando varias mediciones para obtener un rango promedio de lectura de absorbancia. (Ver figura 1). a. Lectura tubo Mcfarland Tubo 0.5 de Mcfarland Leer a 620 nm 42

b. Comparación de la suspensión de E. coli con el tubo de Mcfarland Suspensión E. coli Tubo 0.5 de Mcfarland 10 ml ADE 15 x 10 7 UFC/mL comparar Leer a 620 nm c. Diluciones de la suspension bacteriana 1/10 1/100 1/100 1/100 15 x 10 7 15 x 10 5 15 x 10 3 15x 10 3 15 Bact/mL FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland. a) Lectura tubo 0.5 de Mcfarland. b) Comparación del tubo 0.5 de Mcfarland con la suspensión de E. coli. c) Preparación de las diluciones de la concentración de 5 bacterias/ml. 43

Obtenida la concentración de 15 bacterias/ml, se realizaron cuatro replicas tomando 4 ml de esta suspensión y adicionando 1 ml a cada frasco que contenía 99 ml de agua destilada estéril, para completar un volumen final de 100 ml, la totalidad de cada frasco fue analizada por el método de filtración por membrana. Se realizaron 10 mediciones de cuatro replicas cada una, realizando una medición diaria, de las cuales dos eran para ser sembradas en medio Endo y dos en medio m-fc y se llevaron a incubar a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Después de 24 horas se realizo el recuento de las colonias características en cada medio. Este procedimiento fue realizado cada vez que se hacia una medición. (Ortiz, 2008) 5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad Se analizaron tres concentraciones diferentes de Escherichia coli, las cuales se encontraran dentro del nivel bajo, medio y alto de detección del método. Las concentraciones analizadas fueron: 5 bacterias/ml, 20 bacterias/ml y 70 bacterias/ml. En todo el proceso de validación se partió inicialmente de una concentración de 130 millones de bacterias/ml, la cual fue determinada a través de las mediciones que se realizaron en la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland. Para llegar a la concentración de 5 bacterias/ml se procedió de la siguiente manera: Se preparó una suspensión de E. coli en 40 ml de agua destilada estéril, se comparó con el tubo 0.5 de Mcfarland, se leyó en el espectrofotómetro a 620 nm y se comprobó que estuviera entre el rango de absorbencias establecido anteriormente. A partir de esta suspensión, para obtener la concentración de 5 bacterias/ml, se utilizo la fórmula: V1 X C1 = V2 X C2 en donde: V1= 10 ml 44