19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 242 422 1 Int. Cl. 7 : C12N / A61K 3/14 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 99948706.9 86 Fecha de presentación : 22.07.1999 87 Número de publicación de la solicitud: 10878 87 Fecha de publicación de la solicitud: 23.0.01 4 Título: Procedimiento para la preparación de células madre hematopoyéticas de crecimiento adherente CD34 negativas, modificadas genéticamente. Prioridad: 24.07.1998 DE 198 33 476 73 Titular/es: Ralf Huss Tegernseer Strasse 78 83666 Waakirchen, DE 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 01.11.0 72 Inventor/es: Huss, Ralf 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 01.11.0 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino ES 2 242 422 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
1 2 3 4 0 6 DESCRIPCIÓN Procedimiento para la preparación de células madre hematopoyéticas de crecimiento adherente CD34 negativas, modificadas genéticamente. Descripción de la invención La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de células madre hematopoyéticas precoces modificadas genéticamente (que son negativas para la expresión de la molécula superficial CD34). Las células resultan adecuadas para la terapia génica de enfermedades mono- u oligogenéticas, respectivamente, enfermedades de formación de la sangre así como enfermedades crónicas. Con este objetivo, se crean cultivos de células madre endógenas de crecimiento adherente CD34 negativas a partir de la sangre periférica del paciente y se transfectan o infectan eficazmente, respectivamente, con constructos génicos. A largo plazo, los productos génicos de dichos genes deberían sustituir a proteínas o factores defectuosos o ausentes en el organismo del paciente, respectivamente, o permitir una terapia celular. El objetivo de la terapia génica somática o de la terapia celular, respectivamente, es la transferencia eficaz de material genético en el organismo. En la terapia génica somática, se corrigen los defectos genéticos en las células del cuerpo o se introducen en las células productos génicos terapéuticamente útiles que codifican genes. La alteración terapéutica del gen no se transmite a la descendencia. La introducción de material genético en las células diana puede realizarse ex vivo así como in vivo. Ex vivo significa que las células diana se cultivan fuera del cuerpo y se reintroducen a continuación en el paciente tras la introducción del material genético. Sin embargo, la eficacia de la terapia génica somática se ve afectada por la vida limitada de las células transfectadas. Por lo tanto, las células que tienen un lapso de tiempo particularmente largo resultan particularmente adecuadas como células diana para la terapia génica somática, tales como las células madre hematopoyéticas. Hasta ahora, las células madre hematopoyéticas destinadas a trasplantes se obtuvieron a partir de la médula ósea del donante o tras etapas de enriquecimiento en la sangre periférica. El aislamiento de células del cuerpo del paciente o de un pariente próximo se denomina alotrasplante de médula ósea. A continuación, la mezcla frecuentemente no seleccionada de células madre y de otras células de médula ósea se reintroduce en el paciente. Por último, las células madre hematopoyéticas contenidas en dicha mezcla migran desde la sangre a la médula ósea formadora de sangre para producir todas las células del sistema formador de sangre en la cantidad necesaria. Este tipo de trasplante está asociado con frecuencia a complicaciones graves. Incluso las diferencias de tejido más pequeñas entre el donante y el receptor pueden producir complicaciones muy peligrosas para el paciente. Este riesgo debe ser ponderado frente a la enfermedad real, p. ej. leucemia. Las incompatibilidades donante-aceptor (enfermedad injerto contra huésped) son producidas normalmente por células que contaminan la preparación de las células madre existentes. Particularmente, éstas son células del sistema inmunitario del donante. Para excluir esta contaminación de la médula ósea o del trasplante de células madre, respectivamente, se han desarrollado procedimientos para enriquecer la población de células madre hematopoyéticas. Esta célula que se denomina también célula madre hematopoyética pluripotente ha sido definida hasta ahora mediante la expresión o no expresión de determinadas moléculas superficiales. Esta célula madre hematopoyética pluripotente es capaz de producir las líneas celulares hematopoyéticas humanas, por ejemplo linfocitos B, linfocitos T, leucocitos, plaquetas o eritrocitos, mediante células precursoras adicionales. Actualmente, la determinación de una célula hematopoyética como célula madre hematopoyética pluripotente está definida por la expresión de la molécula denominada CD34 y simultáneamente por la no expresión de otras moléculas superficiales, tal como CD. La molécula CD34 es un proteoglucano cargado muy negativamente de la familia de las mucinas con un peso molecular de aproximadamente a 1 kd. Cellpro Inc. Company, Seattle, USA, ha desarrollado un procedimiento para la purificación de células CD34 positivas mediante una cromatografía de afinidad (patentes US nº 21 927, nº 262 334, nº 2 86, nº 22 33, EP 2677 B y EP 2280 B). Simultáneamente, las células CD34 negativas forman la fuente para las células madre mesenquimatosas. Actualmente, para la terapia génica somática mediante células madre hematopoyéticas se aíslan células CD34 positivas de la sangre periférica del paciente tras la estimulación de dichas células con factores de crecimiento, p. ej. G-CSF (Neupogen-R) y se reintroducen tras la manipulación genética en el paciente para reconstituir la médula ósea letalmente irradiada y tratada con quimioterapia. Hasta el momento, las células madre hematopoyéticas modificadas de esta manera se han empleado en particular para los síndromes de inmunodeficiencia específica, tales como la insuficiencia de adenosina desaminasa, el síndrome del SCID o la infección por VIH, para enfermedades metabólicas, tal como Morbus Gaucher, en trastornos de la formación sanguínea, p. ej. formas específicas de talasemia y en enfermedades malignas, tal como la leucemia. Sin embargo debido a razones éticas y sociales, este procedimiento está restringido a la autodonación o a la donación de células madre de la sangre por parte de parientes próximos, ya que para la acumulación de las células madre en la sangre periférica ha de administrarse un factor de crecimiento al donante o paciente, respectivamente. Hasta el momento, no ha sido posible predecir el efecto a largo plazo de dicho factor de crecimiento en un posible aumento de un clon de leucemia o una posible transformación de una célula madre de sangre sana. Además, la terapia génica somática mediante células madre hematopoyéticas origina determinadas dificultades técnicas. Solamente una pequeña parte de las células madre hematopoyéticas transfectadas con genes terapéuticos o constructos génicos recibe la modificación genética o no se producirá ningún producto génico. Por lo tanto, la eficacia 2
de dicho procedimiento es muy baja actualmente; véase Huss, R. Infusionsthera. Transfusionsmed. 23 (1996) 147-1. 1 2 3 4 0 6 Existe la necesidad de proporcionar medios y procedimientos mejorados que puedan utilizarse en la terapia génica. El objetivo se alcanza mediante el objeto mencionado en las reivindicaciones 1 a 8. De este modo, el objeto de la presente invención consiste en procedimientos para la preparación de células madre hematopoyéticas de crecimiento adherentes, CD34 negativas modificadas genéticamente. En una forma de realización preferida la duración de la vida o la capacidad para dividirse, respectivamente, se prolonga por inmortalización transitoria. La invención se describe con mayor detalle a partir de las Figuras 1 y 2 y la descripción siguiente. Descripción detallada de la invención La observación inicial de la existencia de células madre hematopoyéticas CD34 negativas precoces se basa en el aislamiento y la clonación de una línea celular correspondiente procedente de cultivos de estroma de médula ósea canina primaria constituidos por células CD34 negativas que son similares a fibroblastos y en particular son capaces de producir factores de crecimiento hematopoyéticos. Hasta ahora, la preparación de factores de crecimiento hematopoyéticos ha sido ya descrita para las líneas celulares del estroma (véase el documento DE 432270 C1). A partir de dicho cultivo primario, se han creado poblaciones monoclonales (unidades formadoras de colonias = CFU) en un ensayo de colonias patrón. Algunos de dichos clones fueron capaces de diferenciar las células precursoras hematopoyéticas más maduras (Huss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (199) 748-72). La diferenciación así como la proliferación de dichas células depende de diferentes factores de crecimiento. De este modo, el factor de células madre (ligando c- kit; SCF) induce la diferenciación de células con crecimiento adherente CD34 negativas a células CD34 positivas que no crecen más de forma adherente, mientras que la interleucina 6 (IL-6) principalmente favorece la proliferación y el crecimiento adherente (Huss et al., Blood 8 (199) 2414-2421). A partir de células CD34 positivas de la sangre periférica, se puede crear una población de crecimiento adherente CD34 negativa que es similar a los fibroblastos. Se ha descubierto que en el procedimiento de diferenciación desde el crecimiento CD34 negativo, adherente hasta el crecimiento CD34 positivo, el crecimiento adherente ya no fue reversible. Mediante la adición de IL-6 se ha creado una población celular adherente pero inicialmente no homogénea a partir de las células mononucleares periféricas de donantes voluntarios sanos. Con este objetivo se cargaron dos veces ml de sangre heparinizada en un gradiente de Ficoll, se aisló la fracción celular mononuclear según procedimientos normalizados y se añadió a un medio que contenía IL-6 en matraces de cultivo celular en una incubadora a 37ºC y % de CO 2. Tras unos pocos días se produjo una capa de células que crecen de forma adherente. Este cultivo primario estaba constituido inicialmente por células similares a fibroblastos, así como macrófagos, células endoteliales y células de grasa ocasionales, detectadas por medio de fenotipado inmune. Sin embargo, la cantidad de células contaminantes disminuyó completamente durante los primeros días y semanas (Huss et al., Infusionsthera. Transfusionsmed. 24 (1997) 4-9), hasta que se formó una población de células casi homogénea. Sin embargo, en este momento no es posible clonar dicha población, ya que no ha sido inmortalizada. No obstante, dichas células pueden mantenerse en cultivo celular o congelarse en nitrógeno líquido de la manera habitual. Modificando las condiciones en el cultivo celular, las células CD34 negativas que crecen de forma adherente pueden también diferenciarse en células madre mesenquimatosas y producir de este modo una célula precursora para huesos, cartílagos y otros tejidos. Transferencia génica Las células CD34 negativas de crecimiento adherente similares a fibroblastos se aislaron de las células mononucleares purificadas de la sangre periférica según el procedimiento anterior. Inicialmente existía una gran contaminación con otras células que sin embargo desapareció completamente en el transcurso del tiempo de modo que el 0% de las células adherentes presentes eran células adherentes CD34 negativas. Para una transducción óptima se investigaron diferentes procedimientos para la transferencia génica de proteína de fluorescencia verde (GFP). La proteína de fluorescencia verde es un constructo génico que en las células transfectadas o infectadas, respectivamente, irradia luz verde en el ultravioleta y permite de este modo la detección de una célula transfectada o infectada respectivamente, con GFP de una manera sencilla. Los resultados con cultivos in vitro así como con experimentos in vivo en ratones SCID [los ratones SCID presentan una insuficiencia inmunitaria celular que permite a los ratones servir como modelo in vivo para modelos de alotrasplante y xenotrasplante] han demostrado que la expresión de GFP en las células diana emplea varias semanas en las que la fluorescencia de las células transfectadas con GFP en ratones SCID es claramente visible pero más débil que en el procedimiento de cultivo de células planas. La investigación de diferentes procedimientos de transfección o infección, respectivamente para la proteína GFP proporcionó diferentes resultados: 3
El método de CaCl 2 para la transfección produjo una tensión celular fuerte que condujo a la muerte de una gran parte de las células que deben transfectarse. En cambio, la eficacia de la transferencia génica mediante Lipofectamina o la infección con sobrenadante vírico, respectivamente, fue muy elevada. Aunque la eficacia de la transfección con lipofectamina después de una aplicación fue aproximadamente del al 0%, la eficacia de la infección con sobrenadante vírico después de a 14 días y de 3 a 4 pasos fue del 88 al 94%. Igualmente, se añadió sobrenadante que contenía nuevos virus a las células diana cada 3 a 4 días. TABLA GFP positivo,% repetición células muertas, % 1 Transfección con CaCl 2 68 ± 17 no ± 21 Transfección con lipofectamina 47 ± 6 no < Infección con sobrenadante vírico 91 ± si <1% Eficacia 2 3 4 La ventaja obvia del sistema de la invención es la gran eficacia de transfección o infección de esta población de células homogénea cuya mayor parte no es todavía monoclonal sino con frecuencia oligoclonal. Aunque los procedimientos similares, a pesar de los intensos esfuerzos, presentan una eficacia de infección comprendida entre aproximadamente y % de células precursoras hematopoyéticas, casi todas las células de la población de células madre precoces de la presente invención están infectadas con el gen deseado. Los experimentos con ratones SCID han demostrado que la expresión del gen también tiene lugar in vivo en todas las líneas de hematopoyesis. Esto no sólo es válido para los constructos retrovíricos, sino también para la aplicación de virus asociados a adenovirus (AAV) o constructos derivados del virus de Epstein-Barr (EBV). Homogeneidad Debido a su sencillo aislamiento de la sangre periférica y a su gran eficacia, las poblaciones celulares casi homogéneas de crecimiento adherente similares a fibroblastos son excelentemente aplicables en los campos de la terapia génica y de la terapia celular. Los experimentos han demostrado que dichas células madre hematopoyéticas precoces pueden no sólo presentar reconstitución a largo plazo sino que también pueden producir una tolerancia mediante su colonización en el timo. Esto permite una aplicación no solamente en el sistema autólogo o singeneico sino también en el campo de los alotrasplantes. Opciones terapéuticas 0 6 Todos los genes que representan un producto génico que es defectuoso o ausente en el paciente se pueden volver a introducir en el paciente con sus propias células genéticamente modificadas mediante la infección de células hematopoyéticas autólogas con un constructo para el gen ausente o defectuoso (véase la Figura 1). Los candidatos son en particular genes implicados en algunas enfermedades metabólicas (p. ej. M. Gaucher, PNH, diabetes mellitus), en síndromes de inmunodeficiencia (insuficiencia de ADA, SCID, CGD, LAD, SIDA), hemoglobinopatías (p. ej. anemia depranocítica y talasemia) y enfermedades malignas (p. ej. MDR, constructos con cadena complementaria, ribozimas de cabeza de martillo en el caso de mutaciones identificadas) [véase también la Tabla 1, página 8: Somatic Gene Therapy; P.L. Chang (ed.) CRC Press Inc., Boca Raton, USA]. Después de la transferencia del gen deseado a las células madre hematopoyéticas precoces autólogas del paciente, las células aisladas del paciente pueden congelarse en nitrógeno líquido para utilizarlas por primera vez o de nuevo, según se requiera. Esto es posible ya que dichas células proliferan muy extensamente. Una forma de realización adicional se refiere a la introducción de un gen suicida, por ejemplo timidina cinasa, para eliminar opcionalmente dichas células infectadas completa o parcialmente con ganciclovir. Mediante éste, las células se pueden mantener bajo control de crecimiento continuado in vivo, p. ej. si la actividad de una enzima sobrepasa el nivel de suero deseado o se cura la enfermedad tumoral. 4
Las células madre parcialmente inmortalizadas de manera transitoria (pasajera) pueden también utilizarse para la terapia celular o para la preparación de cartílago endógeno o de sustancia ósea, respectivamente (véase la Figura 2). En esta forma de realización no existe tampoco la necesidad de someter al paciente a una terapia mieloextirpadora, ya que la hematopoyesis del paciente no necesita estar completamente reconstituida sino que solamente una parte de las células madre hematopoyéticas se sustituye por células madre genéticamente modificadas. Los ejemplos siguientes ilustran la invención. Ejemplo 1 Aislamiento de células 1 2 Se extrajeron del paciente o del donante voluntario, aproximadamente ml de sangre heparinizada o de sangre con citrato, respectivamente y se estratificaron sobre un gradiente de Ficoll Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) (véase también Huss et al., Infusionsthera. Transfusionsmed. 24 (1997) 4-9). Después de un periodo de entre 1 y min de centrifugación a 0 g sin parar, el anillo de células mononucleares se elimina y se lava varias veces en PBS o solución salina isotónica. Posteriormente se incuban 6 a 1 7 células/ml en un matraz de cultivo celular (p. ej. NUNC) en medio de cultivo celular (p. ej. medio patrón de McCoy con suero de ternero fetal al 12,% y suero equino al 12,%) en una incubadora a 37ºC y % de CO 2 en presencia de ng/ml de interleucina-6 recombinante (rhu IL-6; RB Systems GmbH, Wiesbaden). Los cultivos se controlaron diariamente y se hizo el recuento semanalmente. 3 4 0 Después de un periodo de entre y 14 días aparece una población celular homogénea de células de crecimiento adherente similares a fibroblastos que son casi completamente CD34 negativas según el análisis por FACScan o por histoquímica inmunitaria, respectivamente. No obstante, algunas células diferenciadas expresan temporalmente el antígeno de CD34, ya que estas células no están sincronizadas. Ejemplo 2 Infección retrovírica/ilustrada mediante la infección con constructos de EBV Dicha población celular homogénea descrita anteriormente se incuba ahora con sobrenadante retrovírico de la línea celular PG-13 (una línea celular de empaquetamiento que empaqueta el vector retrovírico tras la transfección de las células PG-13 en una envoltura del virus de leucemia de mono gibón. La transfección de la línea celular de empaquetamiento se realiza mezclando 2, µg de ADN del plásmido con 1 µl de Superfect (Qiagen) e incubando en 0 µl de medio exento de suero a temperatura ambiente durante min. A continuación, esta mezcla se incuba con las células PG-13 a 37ºC durante horas seguida de la adición de un nuevo medio que contiene suero) también durante un periodo de a 14 días durante cuyo tiempo el medio que contiene el virus debería cambiarse durante 3 a cuatro veces. Después de este periodo se investiga la expresión génica en las células diana (la GFP mediante microscopía de fluorescencia) y se determina la eficacia. Las células positivas pueden ahora volver a introducirse en el paciente o congelarse para una utilización posterior. En estas infecciones retrovíricas la MOI (multiplicidad de infección = cuántas partículas de virus son necesarias para la infección de una célula) es aproximadamente. Las células pueden también inmortalizarse transitoriamente para conseguir un aumento de las células madre. Ejemplo 3 Infección de las células diana aisladas del paciente con luciferasa que expresa el virus AAV recombinante Las células diana aisladas del paciente podrían infectarse de manera muy eficaz también con luciferasa que expresa el virus AAV recombinante. Se incubaron células diana del paciente con LUC-rAAV a 37ºC durante 3 horas y a continuación se mantuvieron en medio exento de suero durante otras 72 horas. Posteriormente, se midieron tanto la actividad como la luminiscencia de la luciferasa. En este sistema la MOI es aproximadamente 00. 6
Ejemplo 4 Ejemplo 1 del paciente 1 2 3 En la Figura 1 se ilustra esquemáticamente el procedimiento. Se extrae sangre de la vena del brazo de un paciente A que presenta la insuficiencia genética X y se aislan células mononucleares periféricas de éste mediante centrifugación en gradiente. Estas células mononucleares se incuban en cultivo celular con interleucina-6, hasta que se haya creado una capa de células adherentes. En el cultivo primario la contaminación con células madre no hematopoyéticas es todavía muy elevada. Después de un periodo de entre 2 y 4 semanas se cultivan las células madre hematopoyéticas exclusivamente CD34 negativas que ahora pueden expandirse. Existen ahora constructos infectados con virus retrovíricos o virus AAV que han sido transfectados con el constructo génico deseado anteriormente. Después de unos pocos días puede detectarse la presencia del gen X y la expresión del producto génico X (p. ej. glucocerebrosidasa o insulina) en las células madre hematopoyéticas del paciente A. A continuación, el paciente A recibe sus células madre hematopoyéticas precoces modificadas genéticamente mediante infusión mientras que una parte de dichas células se almacena en nitrógeno líquido para su utilización posterior. Las células madre de la sangre del paciente que están provistas de una nueva información genética proveen al paciente A con producto génico X que es importante para él. En el caso de la diabetes mellitus es suficiente proporcionar solamente un porcentaje muy bajo de células madre endógenas con el nuevo material genético para conseguir una disminución de la concentración de azúcar en sangre y de este modo la demanda necesaria de insulina. En los pacientes de diabetes esto retrasaría o incluso evitaría las correspondientes enfermedades graves a largo plazo. Ejemplo Ejemplo 2 de paciente El paciente B padece una anomalía en el cartílago grave en la articulación de la rodilla. Se extraen células madres periféricas del paciente (p. ej. mediante aféresis) y se inmortalizan de manera transitoria (pasajera) (p. ej. mediante antígeno SV con muchos linfocitos T en un sistema cre/lox con EBNA1). Estas células se diferencian a continuación en células precursoras de cartílago/hueso en un cultivo celular y se trasplantan al punto defectuoso. 4 0 6 6
REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la preparación de células madre hematopoyéticas de crecimiento adherente, CD34 negativas modificadas genéticamente que comprende las etapas siguientes: (i) incubar células mononucleares periféricas aisladas con interleucina-6, en la que se genera una población de células homogéneas a partir de células similares a fibroblastos en crecimiento que son casi completamente CD34 negativas; (ii) transfectar la población de células homogéneas con un gen terapéutico; y (iii) aislar células madre hematopoyéticas de crecimiento adherente, CD34 negativas, transfectadas positivamente. 1 2 3 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células están inmortalizadas para obtener una expansión de las células madre. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen terapéutico codifica para la insulina, el factor VIII, la adenina desaminasa, el factor de resistencia a multifármacos (MDR) o un factor de inmortalización. 4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células mononucleares se originan a partir de sangre heparinizada o de sangre con citrato de pacientes.. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la transfección en la etapa (ii) se realiza por el método de CaCl 2 o con lipofectamina. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (ii) se realiza mediante un constructo retrovírico o un constructo de EBV o un constructo asociado al adenovirus. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la transfección se realiza con un sobrenadante retrovírico de la línea celular PG-13. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la interleucina-6 utilizada es interleucina- 6 recombinante. 4 0 6 7
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