HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab

S HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab Para comenzar la prueba, se agregan muestras de suero o plasma al diluyente en los pocillos de la fila A de la Bandeja de desarrollo. Luego el peine se inserta en los pocillos de la fila A.. Los anticuerpos anti-vih, si están presentes en la muestras, se unirán específicamente a los antígenos recombínanos en el primer y/o segundo punto en los dientes del peine (Figura1). Simultáneamente, si el antígeno p24 está presente en las muestras este sera capturado por los anticuerpos anti-p24 en el tercer punto. Los componentes no unidos son eliminados con un lavado en la fila B. En la fila C, los analitos capturados en los dientes reaccionarán con los antígenos VIH-1 y VIH-2, y los anticuerpos anti VIH- 1 p24, respectivamente, lmarcados con biotina. En la fila D, un conjugado secundario Estreptavidina-Fosfatasa Alkaline reaccionará con residuos de biotina en el complejo formado y con el control interno en el punto superior de los dientes. En la siguiente fila (E), los componentes no unidos son removidos mediante un lavado. En la fila F, la fosfatasa Alkalina unida reacciona con componentes cromogénicos. Los resultados son visibles como puntos de color azul grisáceo en la superficie de los dientes del peine. Anticuerpo VIH & Ag de captura p24 ; 30 min. / TA Anti-VIH-1 p24 VIH Ag VIH-1 p24 Anti-VIH Ac Unión del anti-p24 biotinilado & Ag VIH biotini\lado; 30 min. / TA Código: 60433002 Formato: 3 x 12 pruebas Para Diagnóstico in Vitro únicamente Propósito de uso La prueba ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es un EIA para la determinación cualitativa y diferencial de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) y detección simultánea de antígeno p24 del VIH-1 en suero o plasma humano. Treinta y seis pruebas pueden ser realizadas con un kit. Introducción El virus de Inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirido (SIDA). Los dos subtipos, VIH-1 y VIH-2, pueden ser distinguidos. Las principales vías de transmisión del VIH son el contacto sexual, contaminación con sangre o productos sanguíneos, y transmisión madre a recién nacido. Las principales células infectadas por el VIH son los linfocitos T4 que juegan un papel importante en el sistema de defensa inmunológica del organismo. El progresivo descenso del nivel de T4 durante el desarrollo de la enfermedad conduce a infecciones oportunistas con consecuencias fatales. El virus del VIH consta de una molécula de RNA genómico protegida por una cápside y una envoltura. La envoltura del VIH es el principal blanco de la respuesta de los anticuerpos humorales. El diagnóstico serológico de la infección de VIH se basa en la detección específica de anticuerpos contra proteínas de la envoltura del VIH. Sin embargo, recientemente, se han introducido pruebas de cuarta generación, donde dos ensayos prueba para anticuerpos y detección viral GAG p24 fueron combinados. La detección simultánea de dos marcadores reduce el período de seroconversión de 7 a 10 días y así permite la detección temprana de la infección de VIH. Principio de la Prueba La prueba ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es un ensayo, inmunoenzimático directo de fase sólida (EIA). La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ( dientes ). Cada diente está sensibilizado en cuatro puntos: El primer punto (inferior) - VIH-1 antígeno recombinante de envoltura. El segundo punto VIH-2 antígeno recombinante de envoltura El tercer punto Anticuerpo monoclonal anti VIH-1 p24 El punto superior albúmina de suero bovino biotinilada (Control Interno) La bandeja de desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos, cada fila contiene una solución reactiva lista para usar en cada etapa del ensayo. La prueba es realizada en etapas, pasando el peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa. Anti-p24 Biotinilado Ag VIH Biotinylado Avidina - FA Sustrato cromogénico Figura 1. Principio de la Prueba Unión de Avidina FA; 10 min. / TA Reacción enzimática de color 10 min. / TA El kit incluye un Control Positivo (Contiene anticuerpos anti VIH-1 y VIH-2, antígeno p-24 VIH-1 ) y un Control Negativo para se incluido cada vez que se realice la prueba. Al término de la prueba, el diente usado con el Control Positivo debe mostrar tres puntos azul grisáceo además del punto superior, el cual es el único punto visible sobre el diente del control Negativo.. El punto superior debe también aparecer en los demás dientes, para confirmar que el kit funciona adecuadamente y que la prueba fue realizada correctamente. Contenido del Kit Peines El kit contiene 3 peines plásticos. Cada peine tiene 12dientes, un diente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizado en cuatro areas reactivas: Primer punto (bajo) - Proteína recombinante VIH-1 (glicoproteína gp 41 del env ) Segundo punto Proteína recombinante VIH-2 (glicoproteína gp36 del env) Tercer punto Anticuerpo monoclonal anti proteína p24 del VIH-1 Punto superior Albúmina de suero bovino biotinilada (Control Interno) 60433002/S6/OR 1

ImmunoComb II 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 Control Interno Ag p24vih-1 p24 Ac VIH-2 Ac VIH-1 Figura 2. Peine Los peines son suministrados en empaques de aluminio que contienen una bolsa desecante. Bandejas de Desarrollo El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, cubiertas con papel de aluminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. La bandeja de Desarrollo consta de 6 filas (A F) de 12 pocillos cada una. El contenido de cada fila es el siguiente: Fila A Diluyente de la muestra Fila B Solución de lavado Fila C Biotina marcada con con antígenos de envoltura-vih-1 y VIH-2 y anticuerpos anti p 24 VIH-1 Fila D Fosfatasa Alcalina m,arcada Estreptavidina Fila E Fila F Solución de lavado Solución de Substrato cromogénico que contiene 5-bromo-4-cloro- 3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT) Almacene el kit en su caja original de 2-8 o C. No congele el kit. Después de abrir el kit por primera vez los componentes deben ser almacenados de 2-8 o C. El funcionamiento del kit después de ser abierto por primera vez es estable hasta la fecha de expiración del kit, cuando es almacenado de 2 a 8 o C. Después del primer uso, el peine y la bandeja no deben ser usados por más de tres veces. Manejo de las Muestras Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días a temperatura de 2 8 C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por más de 7 días, congélelas a 20 C o a temperaturas más bajas. Después de descongelar las muestras de suero, centrifuguélas. Use el sobrenadante para la prueba. Evite congelar y descongelar repetidamente. Anticoagulantes tales como heparina, EDTA y citrato de sodio no afectan los resultados de la prueba. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario Pipetas de precisión con puntas desechables y capacidad de 50 µl Tijeras Cronómetro de Laboratorio o reloj Preparación de la Prueba Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente (22-26 C). Preparación de la Bandeja de Desarrollo 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37 C por 20 minutos; o déjela a temperatura ambiente (22-26 C) por 3 horas. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente, para ser desechado como biocontaminante al concluir la prueba. 3. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo. Figura 3. Bandeja de Desarrollo Control Positivo 1 frasco (tapa roja) de 0.5 ml de plasma humano diluido positivo para anticuerpos anti VIH-1, anti-vih-2 y antígeno recombinante p24, inactivado por la adición de ß-propiolactona y tratamiento con calor. Control Negativo 1 frasco (tapa verde) de 0.5 ml de plasma humano diluido inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti VIH. Perforador para perforar el papel de aluminio que cubre los pocillos de la Bandeja de desarrollo. Seguridad y Precauciones Maneje el Control Positivo como si fuera potencialmente infeccioso, aunque haya sido inactivado. Todos los otros materiales de origen humano usados en la preparación de los controles fueron probados y no se encontraron reactivos al antígeno de superficie de la hepatitis B, así como a anticuerpos del virus de la hepatitis C y del VIH. Ya que ningún método de prueba puede garantizar por completo la ausencia de contaminación viral,todas las soluciones de referencia y todas las muestras humanas deben ser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas. Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo con suero o plasma humano. No pipetee con la boca. Deseche todas las muestras, peines usados*, Bandejas de Desarrollo, y otros materiales usados con el kit como desechos biocontaminantes. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No use el kit después de la fecha de expiración. Almacenamiento y Estabilidad del kit El kit es transportado de 2-8 o C. Durante el transporte el kit puede permanecer a 30 o C por cortos períodos de tiempo y no excediendo un total de 48 horas. Los controles internos indican que el kit no se ha dañado durante el transporte. Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo; rómpala usando la punta desechable de la pipeta o el perforador, sólo cuando las instrucciones de la prueba así lo indiquen. Preparación del peine Precaución: Para asegurar el funcionamiento apropiado de la prueba, no toque los dientes del peine. 1. Abra el empaque de aluminio por el borde perforado. Retire el peine. 2. Es posible utilizar todo el peine y la Bandeja de Desarrollo o una parte. Para utilizar parte del peine: a. Determine cuántos dientes va a necesitar para analizar las muestras y controles. Se necesita un diente para cada prueba. Cada diente tiene impreso el número de código del kit, "33", para permitir la identificación de los dientes sueltos. b. Doble y rompa verticalmente el peine, o córtelo con tijeras (ver figura 4) para separar el número requerido de dientes (No. De pruebas incluyendo 2 controles). c. Vuelva a meter la porción no utilizada del peine en el empaque de aluminio (con la bolsa desecante). Cierre bien el empaque, con un clip por ejemplo, para mantenerlo seco. Almacene el peine en la caja original del kit de 2 8 C para uso posterior. ImmunoComb II 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 33 Figure 4. Fraccionamiento del peine * A menos que sea archivado para consulta posterior 60433002/S6/OR 2

Instrucciones de la Prueba Reacción Antígeno Anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo) 1. Pipetee 50 µl de la muestra. Perfore con la punta de la pipeta o el perforador la cubierta de aluminio de un pocillo en la fila A de la Bandeja de Desarrollo y vierta la muestra en el fondo del pocillo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. 2. Repita el paso 1 para las demás muestras, incluyendo un control positivo y un control negativo suministrados con el kit. Use un nuevo pocillo en la fila A y cambie la punta de la pipeta para cada muestra o control. 3. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia usted) en los pocillos de la fila A que contienen las muestras y los controles. Mezcle: Retire e inserte el peine en los pocillos varias veces. b. Deje el peine en la fila A durante exactamente 30 minutos. Active el cronómetro. Mezcle dos veces más durante la incubación. Hacia el final de los 30 minutos, perfore el papel aluminio en la fila B usando el perforador. No abra más pocillos de los necesarios. c. Al cumplirse los 30 minutos, saque el peine de la fila A. Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes apoyándolos sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente. Primer Lavado (Fila B) 4. Inserte el Peine en los pocillos de la fila B. Agite: Inserte y retire vigorosamente el Peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces agitando en el transcurso de 2 minutos; mientras tanto perfore el papel aluminio de la fila C. Después de 2 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido como en el paso 3c. Unión del Conjugado Biotinilado (Fila C) 5. Inserte el Peine en los pocillos de la fila C. Mezcle el peine varias veces. Programe el cronómetro para 30 minutos. Mezcle como en el paso 3b. Perfore el papel aluminio de la fila D. Después de 30 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido. Unión del Conjugado Fosfatasa Alcalina-estreptavidina (Fila D) 6. Inserte el Peine en los pocillos de la fila D. Programe el cronómetro para 10 minutos. Mezcle como en el paso 3b. Mientras tanto perfore el papel aluminio de la fila E. Después de 10 minutos, retire el peine y absorba el líquido adherido. Resultados de la Prueba Validación Para confirmar el funcionamiento correcto de la prueba y demostrar que los resultados son válidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (Ver Figura 5): 1. El Control Positivo debe producir cuatro puntos en el diente del Peine. 2. El Control Negativo debe producir un punto superior (Control Interno) y no otros puntos. 3. Cada muestra analizada debe producir un punto superior (Control Interno). Esto también confirmará que la prueba fue realizada correctamente. Si cualquiera de estas tres condiciones no se cumplen, los resultados son inválidos, y las muestras y controles deben ser reexaminados. Control Positivo Control Negativo Figura 5. Validación de la Prueba Resultados Inválidos Interpretación de los Resultados 1. La presencia exclusive del punto superior (Control Interno) indica que la muestra no reacciona a los anticuerpos contra VIH-1 o VIH-2 y para el antígeno VIH p24 (Figura 6a). 2. Un punto bajo circular, de color uniforme indica la presencia de anticuerpos anti VIH-1 (Figura 6b). 3. Un segundo punto circular, de color uniforme indica la presencia de anticuerpos anti VIH-2 (Figura 6c). Algunas veces, concentraciones altas de anticuerpos anti VIH- 2 se ha encontrado que producen un punto secundario adicional al al punto principal obtenido con el antígeno homologo. En este caso (Figura 6d), los resultados deben ser considerados como infección por VIH-2 o coinfección para VIH-1/ VIH-2. 4. Un tercer punto circular, de color uniforme indica la presencia de antígeno p24 del VIH-1 (Figura 6e). El punto de antígeno p24 puede aparecer con el primer punto para anticuerpos del VIH-1 (Figura 6f), con el segundo, punto anticuerpo VIH-2 (Figura 6g) o con ambos puntos (Figura 6h) Tercer Lavado (Row E) 7. Inserte el Peine en los pocillos de la fila E. Agite repetidamente durente 2 minutos. Mientras tanto perfore el papel de aluminio de la fila F. Después de 2 minutos, retire el Peine y absorba el líquido adherido. a) Ausencia de Ac y Ag de VIH b) Presencia de Ac anti- VIH -1 c) Presencia de Ac anti- VIH -2 d) Presencia de anti- VIH -2 ó coinfección de VIH -1/ VIH -2 Reacción de Color (Fila F) 8. Inserte el Peine en los pocillos de la fila F. Mezcle como en el paso 3a. Programe el cronómetro para 10 minutos. Mezcle como en el paso 3b. Después de 10 minutos, retire el Peine. Detención de la Reacción (Fila E) 9. Inserte el Peine nuevamente en la fila E. Después de 1 minuto, retire el peine y déjelo secar al aire. Almacenamiento de Partes No Usadas del Kit Bandeja de Desarrollo Si no usó todos los pocillos de la Bandeja de Desarrollo puede almacenarla para ser usada posteriormente: Selle los pocillos usados con cinta adhesiva a fin de que nada se derrame fuera de los pocillos, incluso en caso de que la Bandeja de Desarrollo sea volcada. Otros Materiales del Kit Vuelva a colocar las Bandeja (s) de Desarrollo, Peines(s), perforador, controles, e instrucciones en la caja original del kit y almacene a temperatura de 2 8 C. e) Presencia de Ag VIH p24 f) Presencia de Ac anti- VIH -1 Figura 6. Resultados de la Prueba g) Presencia de Ac anti- VIH -2 h) Presencia de anti-vih-2 ó coinfección de VIH-1/VIH-2 Importante: La presencia de anticuerpos anti VIH-1 o VIH-2 y antígeno p24 del VIH-1 en la muestra analizada debe ser confirmada por una prueba confirmatoria. Cualquier coloración débil en los dientes debe ser sospechosa de representar una reacción positiva y debe ser reanalizada. Documentación de los Resultados Debido a que el color que aparece en el peine es estable, los peines pueden ser archivados para consulta posterior. 60433002/S6/OR 3

Limitaciones El kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab es una prueba de tamizaje. La reactividad a los anticuerpos anti VIH-1/VIH-2 no debe ser considerada como un diagnóstico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o de la coinfección por VIH. Una No reactividad con esta prueba no debe ser considerada como una evidencia concluyente de que el paciente no se ha expuesto ni se ha infectado con VIH. Características del Ensayo* Las características de desempeño del kit ImmunoComb HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab han sido determinadas en cuatro sitios de evaluación probando muestras de pacientes con infección para VIH-1 y VIH-2, infección aguda o primaria para VIH (PHI), paneles comerciales de seroconversión, y de no infectados para VIH, donantes sanos y pacientes con otras enfermedades. Los resultados se resumen en las Tablas 1-2 Tabla 1: Sensibilidad Sitios del Estudio Clínico Orgenics, Rambam Medical Center, Gonesse Medical Center, France Instituto de Medicina Tropical Belgium VIH- 1 Ac VIH-2 Ac Muestras Positivas analizadas Sensibilidad (%) VIH p24 Ag (PHI) Sensibilidad General (%) 552 100 100 100 100 127 100 ND 100 100 163 100 100 100 100 204 100 100 100 100 Total 1046 100 100 100 100 Bibliografía Constantine NT. 2001. HIV antibody testing,. In P.T. Cohen, M.A. Sande, and P.A. Volberding (ed.), InSite HIV Knowledge Base Chapter, UCSF Center for HIV Information, September 2001. Courouce AM and the Retrovirus Workgroup at the S.F.T.S. 1999. Combined screening tests for anti-hiv antibodies and p24 antigen. La gazetta de la Transfusion, 155:4-18. Grant AD, De Cock KM. 2001. HIV infection and AIDS in the developing world. British Med. Journal, 322: 1475-1478. Janssen RS et al. 1998. New testing strategy to detect early HIV-1 infection for use in incidence estimates and for clinical and prevention purposes. JAMA 280:42-48. Schacer TW, Hugu JP, Shea T, et al. 1998. Biological and virological characteristics of primary HIV infection. Ann. Intern. Med. 128: 613-620. UNAIDS/WHO. 2002. Joint UN programme on HIV/AIDS (UNAIDS) Report on the Global HIV/AIDS epidemic, p. 1-226. Geneva. Weber B, Fall EH, Berger A, Doerr HW. 1998. Reduction of diagnostic window by new fourth-generation human immunodeficiency virus screening assays. J Clin. Microbiol. 36(8)2235-2239. Leyenda de los símbolos ImmunoComb Card Plate Control Negativo Control Positivo Perforator Consulte las instrucciones de Uso Precaución, consulte la documentación acompañante VIH-1 grupos y subtipos. 103 muestras VIH-1 de varios subtipos (A a J ) y CRFs, y grupo O fueron analizadas. Todas las muestras fueron detectadas por la prueba. Muestras con infección primaria para VIH y paneles de seroconversión. Se tomaron 27 paneles comerciales, 25 paneles clínicos con seroconversión y 20 muestras con infección primaria, de individuos en estados tempranos de la infección y se analizaron. En la mayoría de los paneles, el kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab detectó la infección temprana, por lo menos, una sangría (2 a 16 días) frente a los kits de referencia de tercera generación. Tabla 2: Especificidad Sitio del Estudio Clínico Muestras VIH-1 VIH p24 Ag VIH-2 Ac Negativas Ac (PHI) Analizadas Especificidad (%) Orgenics 99.8 1373 99.8 100 Rambam Medical Center, 111 100 100 99.1 Gonesse Medical 100 298 99.0 100 Center, France Instituto de Medicina Tropical, 200 98.0 100 99.5 Belgium Total 1982 99.5 100 99.8 La especificidad total es de 99.3% IVD Σ n REF LOT Dispositivo para Diagnóstico in Vitro Límites de temperatura Material suficiente para n pruebas Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea Número de catálogo Código de lote Fecha de caducidad Número de serie * Datos detallados disponible Version: 60433002/S6/OR (09/2008) 60433002/S6/OR 4

Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba Preincubación de la Bandeja de Desarrollo 3 hrs. a temperature ambiente, o 20 min. a 37 C 1 2 3 4 Tomar las muestras y Sacar el peine del empaque controles Agregar muestras y controles en la fila A. Mezclar 5 6 7 8 Insertar el Peine y mezclar en la Fila A. Incubar Perforación de la fila B Absorber líquido adherido a los dientes Insertar peine y agitar en la fila B. Incubar Después de mezclar/agitar e incubar en las filas C, D y E... 9 10 Reacción de color en la fila F Resultados Resumen del procedimiento de la Prueba Las instrucciones abreviadas a continuación son para personas experimentados en el uso del kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 TriSpot Ag-Ab. (Para instrucciones detalladas favor de referirse al texto completo) 1. Ponga todos los reactivos, bandejas de desarrollo, peines y muestras a temperature ambiente y realice la prueba a temperature ambiente (22-26 C). 2. Vierta 50 µl de cada muestra y control en pocillos separados de la fila A de la Bandeja de Desarrolo y mezcle. 3. Inserte el Peine en la fila Ay continue según se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Paso Fila Proceda como se indica Reacción Antigeno-anticuerpo A Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba. Unión de Biotina Conjugada C Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Unión de Fosf. Alkalina- Estrepavidina D Agite; incube 10 minutos; absorba. Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba. Reacción de Color F Mezcle; incube 10 minutos. Detención de la reacción E Incube 1 minuto; seque al aire. 1 2 Manera de romper el Peine 60433002/S6/OR 5