HOSPITAL DE CLINICAS Universidad de la República Facultad de Medicina Hospital de Clñnicas "Dr. Manuel Quintela"..._Organización : _. Panamericana.. de la Salud ~.. -~. l ') J ffl."' Ofidna Regional de la... Organización Mundial de la Salud Organización Panamericana de la Salud Organización Mundial de la Salud MANUAL BÁSICO DE CONTROL DE CALIDAD DE MICROBIOLOGÍA Departamento de Laboratorio Clínico Repartición Microbiología Hospital de Clínicas - Facultad de Medicina UDELAR Unidad de Bacteriología Servicio Nacional de Laboratorios Ministerio de Salud Pública Montevideo, Uruguay 2007 Este documento no es una publicación formal de la Organización Panamericana de la Salud; sin embargo la Organización se reserva de todos los derechos. El documento puede ser comentado, resumido, reproducido o traducido en parte o en su totalidad, pero no para la venta ni con fines comerciales. Las opiniones de cuyos autores se mencionan son de exclusiva responsabilidad de dichos autores.
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Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clinicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública MANUAL BÁSICO DE CONTROL DE CALIDAD.. EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA,. Departa-mento de La~orátorio Clínico Repartición Microbiología Hospital de Clínicas Facultad de Medicina UDELAR Montevideo, Uruguay _ Unidad de Bacteriología Servicio Nacional de Laboratorios Ministerio de Salud Pública Montevideo, Uruguay Mon_tevldeo, Uruguay 2007 1
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio d~ Salud Pública EDITORES Ora Cristina Bázet y Ora Teresa Camou Cristina Bazet Médico Microbiólogo Profesor Agregado de Microbiología Laboratorio Clínico. Facultad de Medicina, UDELAR bazet@adinet.com.uy... Julio B~anco Médico Microbiólogo Profesor Adjunto de Micropiología Laboratorio Clínico. Facultad de Medicina. UDELAR jblanco@movinet.com.uy Teresa Camou Doctor en Microbiología. Encargada de Unidad de Bacteriología, Servicio Nacional de Laboratorios Ministerio de Salud Pública tcamou@chasque.net Gabriela García Gabarrot Magister en Microbiología Encargada Área Infecciones Respiratorias. Unidad de Bacteriología Servicio Nacional de Laboratorios Ministerio de Salud Pública gargaby@adinet.com.uy Marce la Legnani Médico Microbiólogo Asistente de Microbiología Laboratorio Clínico. Facultad de Medicina mlegnani@adinet.com.uy AUTORES REVISIÓN María Cris~ina Mogdasy Médico Microbiólogo Especialista en Enfermedades Infecciosas Asesor Técnico del PPITS/SIDA Ex Profesor Adjunto de Microbiología. Facultad de Medicina, UDÉLAR cmogdasy@gmail.com Rosario Palacio. Médico lnfectólogo - Asistente de Microbiología Laboratorio Clínico. Facultad de Medicina Encargada Área de Enfermedades Trasmitidas por Aliment~s Unidad de Bacteriología Servicio Nacional de Laboratorios Ministerio de Salud Pública rpalacio@hotmail.com Gabriel Pérez Giffoni. Licenciado en Biología Encargada Área Meningitis. Unidad de Bacteriología Servicio Nacional de Laboratorios - Ministerio de Salud Pública gapg@adinet.com.uy Verónica Seija Médico Microbiólogo Profesor Adjunto de Microbiología Laborato~io Clínico. Faéultad de Medicina, UDELAR seinall@adinet.com.uy Eugenia Torres Médico Microbiólogo Profesor Adjunto de Microbiología Laboratorio Clínico. Facultad de Medicina, µdelar. marujavi@adinet.com.ux
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Este manual tiene por objetivos: INCORPORAR LA GESTIÓN DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA LOGRAR UN CORRECTO DESEMPEÑO EN LAS PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS 3
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública ÍNDICE PRÓLOGO... 5 PRIMERA PARTE Introducción a la gestión de calidad en el laboratorio de microbiología D e f... 1n1c1on,, o b' Je t' 1vos y pnnc1p1os........ 6 Ejemplos en los que se debe revisar la necesidad de solicitar un estudio bacteriológico...:... 8 Ejemplos de indicadores de calidad en la toma de muestras y la emisión de resultados...:... 8 Parámetros de control de calidad interno... ~... 9 Procedimiento para la preparación de medios... 1 O Factores que afectan la vida media de los medios de cultivo... 1 O Estándares de rendimiento de medios para Bacteriología... 11 Método de inoculación... 12 Mantenimiento de las cepas de referencia... 12 Registros documentales... 13 o.ocumentos imprescindibles... 13 SEGUNDA PARTE Recomendaciones para el correcto desempeño en las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos 1. Objetivos e introducción... ~... 14 2. Difusión en agar: Método de Kirby-Bauer..._... 15 2.1. Parámetros a controlar en la prueba de disco-difusión... ~... 16 2.1.1. Control del medio de cultivo Mueller Hinton... 17 2.1.2. Control del procedimiento de la prueba de disco-difusión... 20 2.2. Criterios para la elección de los paneles de anticrobianos... 25 2.3. Resistencias naturales... 28 2.4. Oportunidad del ensayo... 31 2.5. Resultados de falsa sensibilidad in vitro... 32 2.6 Resultados atípicos... 33 3. Determinación de la concentración inhibitoria mínima... 34 4. Conclusión... 35 5. Bibliografía ANEXO
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública PRÓLOGO En este Manual Básico de Control de Calidad en el Laboratorio de Microbiología, se marcan como objetivos la incorporación de la gestión de calidad en el Laboratorio Microbiológico y el lograr un correcto desempeño en las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Entendemos la gestión de calidad como el conjunto de actividades que determinan en una institución la política en calidad, sus objetivos, las responsabilidades y su implementación, donde calidad comprende todas las características de un producto, actividad, proceso, organización, personas o servicios que sustentan la aptitud para satisfacer necesidades establecidas e implícitas. Este Manual cumple con su objetivo y aporta un documento de referencia al conjunto de actividades que comprende la gestión de calidad, es decir a la planificación, el control, el aseguramiento y la mejoría de la calidad, y sustenta el continuo avance en el campo de la Microbiología. La organización en dos partes y el desarrollo del mismo con un enfoque académico-docente de gran ductilidad orgánica que le han dado los autores, lo transforman en un manual práctico y de uso habitual a los fines del desempeño en los Laboratorios Microbiológicos, constituyendo un manual recomendable su lectura a todos los profesionales de la salud, vinculados a la Microbiología Clínica. Prof. Dr. Walter Alallón 5
Departamento de Laboratorio CUnico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública PRIMERA PARTE INTRODUCCIÓN A LA GESTIÓN DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Definición: el aseguramiento de la calidad es un proceso sistemático y continuo para monitorear los componentes de un sistema y corregir defectos cuando la calidad de los resultados es inaceptable. 1 Objetivos: OPTIMIZAR LA CONTRIBUCIÓN DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA A LA SALUD DEL PACIENTE, EVITANDO ERRORES QUE LA VULNEREN. OBTENER INFORMACIÓN VERAZ, CONFIABLE Y REPRODUCIBLE PARA LO CUAL SE DEBERÁ TENER EN CUENTA: Definición y revisión de los procedimientos Monitoreo de la calidad de las muestras procesadas Monitoreo de la calidad de reactivos, equipos e instrumentos Implementación de la mejora continua en el desempeño del personal Control de los resultado~ antes de ser emitidos por el laboratorio Principios: Asegurar la participación activa y el compromiso de todo el personal involucrado. La comunicación abierta y sin resquemores es vital para desarrollar actitudes constructivas hacia el mejoramiento de la calidad. LO QUE NO SE REGISTRA NO EXISTE. Elaborar planillas que permitan registrar los resultados de los controles internos para poder demostrar el cumplimiento de los objetivos. Establecer indicadores de calidad a priori para monitorear las diferentes etapas del proceso diagnóstico que puedan ser evaluados en el tiempo y demuestren los resultados del proceso de mejoramiento de la calidad. Analizar los controles realizados y buscar colectivamente soluciones creativas a los problemas planteados, atendiendo a las personas que participan directamente en el trabajo e involucrando a la jefatura de la institución. Proponer metas concretas y alcanzables en un determinado plazo, para cada etapa, de acuerdo a los problemas más frecuentes y más graves en cada institución. Por ejempló: la meta puede ser "ninguna muestra de hemocultivo debe desaparecer entre el lugar de recolección y el laboratorio"..
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Figura 1. Diagrama de diagnóstico de laboratorio Toma de muestra "'+ ""- Preparación del paciente Procedimiento Preparación de la muestra Transporte dela muestra Tiempo Bioseguridad Diagnóstico valuación y diagnóstico clínico portunidad de la toma Registro Cultivo y Frotis '\.... "'- + Interpretación Emisión del resultado Identificación y antibiograma Decisión clínica Procesamiento de la muestra El aseguramiento de la calidad es un proceso continuo en el que la mejora se va incrementando lentamente. Por eso las expectativas no deben ser demasiado altas ni los esfuerzos decaer cuando los avances parecen insignificantes en relación con los objetivos planteados. No es posible elaborar una lista exhaustiva de actividades para la implementación del aseguramiento de la calidad sino que debe ser configurada de acuerdo a las necesidades y recursos de cada institución. Es más, esos procedimientos deben ser modificados a medida que se solucionen problemas y que otros nµevos surjan.. Las listas siguientes son solamente una guía para implementar y desarrollar un sistema de control de la calidad. 7
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Ejemplos en los que se deb~ revisar la necesidad de solicitar un estudio bacteriológico: Cultivos de rutina en pacientes hospitalizados por más de 3 días. Urocultivos en pacientes asintomáticos que están bajo tratamiento de antibióticos. Más de una muestra por día del mismo sitio obtenida por el mismo método (excepto hemocultivos ). Cultivos de las siguientes muestras: cavidad bucal, contenido gástrico, abscesos peri-rectales, loquios; punta de sonda vesical, vómito. Cultivos de exudado nasal para diagnóstico de rinitis en el curso de una afección respiratoria alta aguda. Tabla 1. Ejemplos de indicadores de calidad en la toma de muestras y la emisión de resultados Muestra Objetivo Indicador Análisis Hemocultivo Uso apropiado Muestras únicas o Determinar la frecuencia y las >3 muestras en 24 h razones de las muestras únicas y del exceso de hemoc~ltivos Adherencia al Más de 3% de Determinar el porcentaje de procedimiento hemocultivos contaminados por (área) aséptico contaminados servicio. Revisar procedimientos. Expectoración Recolección >1 O células epiteliales por Determinar el porcentaje de. apropiada campo. Muestra no muestras inadecuadas. Realizar representativa. una intervención docente. Uso apropiado Varias muestras de un Determinar las razones de la mismo paciente. repetición Eficiencia en Correlación entre el Revisar discrepancias y las interpretación frotis y el cultivo razones de la interpretación del frotis incorrecta del frotis Baciloscopía Uso apropiado Muestras únicas Determinar el porcentaje y las razones de las muestras únicas Coprocultivo Uso apropiado Muestras después de~ 3 Determinar el porcentaje de días de hospitalización resultados positivos (excepto Clostridium difficile) Urocultivo Recolección Nº de cultivos con ~ 3 Determinar porcentajes por apropiada bacterias diferentes área. Determinar razones (toma de muestra, transporte, etc) Uso apropiado Nº de cultivos sin orden Determinar el porcentaje por para examen de orina área y las razones de la omisión Cultivos repetidos del Determinar razones para > 2 mismo paciente urocultivos/ semana Ensayos de Calidad de los Resistencia disociada Revisar control de calidad susceptibilidad resultados en antibióticos del interno de medio de mismo grupo cultivo y discos de antibióticos Uso de los Correlación entre Documentar porcentaje de resultados tratamiento y resultados tratamientos apropiados y no apropiados con datos de la farmacia de la institución. Notificar a los clínicos Porcentajes acumulados Publicar los datos para adecuar de resistencia tratamientos empíricos. Errores en los Veracidad de Revisión al azar de Revisar discrepancias y sus informes los informes informes emitidos razones y el efecto sobre la evolución del paciente
Departamento de Laboratorio Clfnico,.Hospital de Clínicas - Servi.cio Nacional de Laboratorios, Mi~isterio de Salud _Pública Adaptado de Clinical Microbiology Procedures Handbook, ed H.lsenberg 2"d ed 2Ó04. Ch 14: Quality Assurance, Quality Control, Laboratory Records and Water Quality Tabla 2. Parámefros de control de calidad interno Parámetro Instrucciones para instrumentar el control de calidad. Toma y transporte Redacte instrucciones para toma y transporte de muestra. de muestra Establezca criterios de aceptación y rechazo. Manual de Defina los procedimientos, límites de tolerancia, preparación de reactivos; procedimientos control de calidad interno, cálculos y criterios en la emisión de resultados. Revise anualmente y conserve los anteriores por 2 años. Apruebe y documente la fecha de todos los cambios. Mantenga el manual accesible en el área de trabajo. Personal Adecue el personal al volumen y la complejidad del trabajo. Documente las actividades de educación continua y provea al personal de certificados de participación. Evalúe a cada funcionario anualmente. Registros del Elabore planillas para control de calidad.interno. control de calidad Informe todos los resultados fuera de rango al supervisor y anote las acciones correctivas en la planilla correspondiente. Inspección de los registros por el supervisor mensualmente. Conserve los registros al menos 2 años. Emisión de Defir:ia quien emite resultados. Informe solamente a personal autorizado. resultados Notifique inmediatamente los resultados "de alarma" Corrija y envíe 'nuevamente los resultados en los que se detectaron errores. Conserve los resultados emitidos por al menos 2 años. Envío de cepas a Utilice únicamente laboratorios de referencia con acreditación o permiso laboratorio para ejercer como tales. de referencia Incluya el nombre del laboratorio en el informe para el paciente Control de Participe de un control externo de desempeño adecuado a su nivel. Los desempeño resultados correctos deberían ser~ 80 %. Eventualmente desarrolle un control interno. Rendimiento de Realice una revisión periódica de los equipos para asegurar su buen equipos e funcionamiento (de acuerdo a las recomendaciones del fabricante). instrumentos Documente el mantenimiento de rutina y conserve los registros durante toda su vida útil. Placas de cultivo Si están acompañados por un certificado de calidad no es necesario repetir las. comerciales pruebas, pero deben conservarse los protocolos. Obtenga un certificado que garantice que el fabricante sigue las normas del CLSI (*). Inspeccione cada partida por placas rotas, hemólisis, congelación, espesor desparejo, demasiadas burbujas y contaminación Documente las deficiencias y comuníquelo al fabricante. Realice control~s internos de calidad hasta que el problema sea corregido. Placas de cultivo Registre la cantidad preparada, los medios de cultivo empleados, el número de."hechas en casa". lote, el método de esterilización, el ph, la fecha de preparación y el nombre-del preparador. Controle el color, la consistencia y el espesor de las placas, la humedad, hemólisis, demasiadas burbujas o agar por fuera y contaminación. Pruebe las placas con cépas de referencia de fisiología y propiedades bioquímicas conocidas. Colorantes, Rotule todo de acuerdo al contenido, concentración, requerimientos de reactivos almacenamiento, fecha de preparación, fecha de recibo o puesto en uso y y antisueros fecha de vencimiento. Agregar yolumen, origen y número de lote si ha sido preparado en el labo~atorio. Almacene de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Pruebe su rendimiento co'n cepas de referencia antes 9e usarlo. Descarte material fuera.de fecha o re~ctivos que no cumplen con los estándares. Pruebas Pruebe cada nuevo lote o paquete. Siga las recomendaciones del fabricante comerciales.. para las pruebas de calidad. No intercambie reactivos de diferentes cajas. (*)Clinical and Laboratory Standards lnstitute 9
Departamento de Laboratorio Clinico, Hospital de Clinicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de S~lud Pública Adaptado de Clinical Microbiology Procedures Handbook, ed H.lsenberg 2"d ed 2004. Ch 14: Quality As_surance, Quality Control, Laboratory Records and Water Quality Procedimiento para la preparación de medios Las placas o medios comerciales pueden estar.eximidos del control de calidad siempre que se guíen por normas internacionales (CLSI). El fabricante debe incluir en el.manual técnico, en un rótulo ú otro documento, que el medio satisface los requerimientos de CLSI y conservar esta información. Los medios que se prepararen en el laboratorio deben ser probados con cepas de referencia y procedimientos estandarizados (Tabla 3). Mantenga un registro del proveedor, número de lote, fecha de recibido y controles de calidad aceptables para cada partida. Pruebe cada nuevo lote de medio deshidratado en paralelo con un lote aprobado antes de liberarlo para su uso. Mantenga un registro de 1a cantidad preparada, el origen, el número de lote, el método de esterilización, la fecha de preparación, el ph,.la fecha de yencimiento y el nombre del preparador. Revise la esterilidad incubando una muestra del 5% para lotes de hasta 100 placas, o -1 O placas al azar para partidas mayores~ Incube por 48 horas a la temperatura a la que se va a usar y luego por otras 48 horas a temperatura ambiente. Preferent~mente utilice cepas American Type Culture Collection (ATCC) para el control de calidad interno, aunque cualquier microorganismo de la misma especie del que se obtengan los mismos resultados es aceptable. Realice el procedimiento recomendado por CLSI. Establezca normas para el uso de medios luego de la fecha de preparación. Defina el tiempo de úso de las placas.o tubos que prepara (suele ser muy diferente: máximo para agar sangre y mínimo para SS y AD_Nsa) Factores que afectan la vida media de los medios de cultivo: 1. Sobrecalentamiento de los ingredientes de base. 2. Temperatura de conservación inadecuada. No use refrigerador de frío seco o de descongelado automático 3. Altern~ncia de la temperatura de almacenamiento entre ambiente y 2-8 C. 4. Exposición del medio a la luz del sol. 5. Uso de volúmenes < 1 mi para medios en tubo, tapas flojas. 6.. Utilización de s angre ovina más allá de la fecha de vencimiento. 7. Agregado de sangre o suplementos termolábiles a medios. que. están por encima de 50 C de temperatura. 8. Almacenamiento de las placas en bolsas abiertas o inapropiadas (pérdida de volumen dependiente de humedad y temperatura).
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública T a bl a 3 C on t ro 1. 1n t erno d eme d' 1os para B t. 1 ac eno og1a Medio ph Método de Tiempo de Microorganismo ATCC Resultado ± inoculación Incubación para control * esperado 0.2 Agar 7.4 A 1 día Streptococcus pneumoniae 6305 Crecim, hemólisis alfa sangre Streptococcus pyogenes 19615 Crecim, hemólisis beta Staphy/ococcus aureus 25923 Crecimiento Escherichia coli 25922 Crecimiento Agar 7.2 A 1-3 días Neisseria gonorrhoea 43069 Crecimiento chocolate Haemophilus influenzae 10211 Crecimiento Bilis 7.1 A,B 1-2 días Enterococcus faeca/is 29212 Cree, depósito negro esculina Streptococcus pyogenes 19615 Inhibición Hemo- A 1-7 días Pseudomonas aeruginosa 27853 Crecimiento cultivo Streptococcus pneumoniae 6305 Crecimiento (aeróbico) Haemophi/us inf/uenzae 10211 Crecimiento Hemo- A. 1-7 días Streptococcus pneumoniae 6305 Crecimiento Bacteroides fragilis cultivo 25285 Crecimiento (anaerob) LIA 6.7 D 1 día Proteus mirabi/is 12453 Neutro/Acido, H 2 S Salmonella typhimurium 14028 Alcalino/Acido, H 2 S Shiaella f/exneri 12022 Alcalino/Acido Mac 7.1 A,B 1-2 días Proteus mirabilis 12453 Colonia sin color, inhibición del hauch Conkey Escherichia col/ 25922 Colonia roja Salmonella typhimurium 14028 Colonia sin color Enterococcus faeca/is 29212 Inhibición MIO 6.5 D 1 día Escherichia co/i 25922 Mov+lndol+Ornit+ Klebsiella pneumoniae 13883 Mov-lndol-Ornit- Fenil 7.4 A 1 día Proteus mirabi/is 12453 Positivo Escherichia coli Alanina 25922 Negativo SS 7.0 A,B 1 día Sa/monel/a typhimurium 14028 Colonia sin color, centro negro Shigella flexneri 12022 Colonia sin color Escherichia co/i 25922 Inhibición o col. rosada Enterococcus faeca/is 29212 Inhibición Citrato de 6.9 e 1-2 días Klebsiel/a pneumoniae 13883 Crecimiento + azul Escherichia co/i Simmons 25922 No cambio de color o no crecimiento TSI 7.3 D 1 día Salmonella typhimurium 14028 Alk/Acido, H 2 S, gas ± Medio de 7.3 E 6-8 hs Streptococcus pyogens 19615 Crecim al subcultivar Neisseria gonorrhoea Stuart 43069 Crecim al subcultivar (transporte) Método de inoculación: A) para comprobar su capacidad nutritiva Preparar una suspensión bacteriana al 0.5 Me Farland con la cepa según tabla. Diluir 1/100 (0.1 mi de suspensión en 9.9 mi de suero fisiológico) Inocular cada medio con 1 O µi de la dilución (si no se obtienen colonias aisladas continuar diluyendo de 1 O en 1 O). B) para comprobar el poder selectivo Preparar una suspensión bacteriana al 0.5 Me Farland con la cepa según tabla. Diluir 1 /1 O (0.1 mi de suspensión en 0.9 mi de suero fisiológico) Inocular cada medio con 1 O µi de la dilución C) para probar medios en tubo Preparar una suspensión bacteriana al 0.5 Me Farland con la cepa según tabla. Inocular cada medio con 1 O µi de la dilución (si no se obtienen colonias aisladas qontinuar diluyendo de 1 O en 1 O). D) para probar bioquímicas Inocular cada medio de acuerdo al uso de rutina. 11
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional d~ Laboratorios, Ministerio de Salud Pública E) para probar medio de transporte Preparar una suspensión bacteriana al 0.5 Me Farland. Colocar un hisopo estéril en la suspe.nsión, eliminar el exceso de líquido contra la pared del tubo y sumergir el hisopo en el medio de transporte. Mantener a temperatura ambiente el tiempo estimado y cultivar en el medio adecuado. Mantenimiento de las cepas de referencia Figura 2. Escherichia coli ATCC 35218: para el control de los discos con inhibidores de beta-lactamasas 1. LIOFILIZACIÓN: pueden conservarse por años 2. CONGELAMIENTO: en caldo+ 15 % glicerol (vol/vol); en skim milk estéril o en leche descremada en polvo (preparada asépticamente) Rotule los viales con la fecha de congelado y el código de la cepa de referencia. Mantenga una lista de los microorganismos que utiliza en el control de calidad y la fuente de la cual se obtuvieron. Prepare un número importante de viales, rotule 2 como viales permanentes que no deben ser tocados. Congele a -20ºC (6 meses); Como regla general, reemplace microorganismos cada 6 meses. Recuperación del vial congelado: Tome una pequeña porción con ansa caliente y retorne el vial inmediatame:nte al congelador. Alternativamente descongele el vial rápidamente en agua caliente y siembre. Las cepas congeladas deben ser cultivadas 2 veces consecutivas antes de ser utilizadas en el control de calidad. 3. REFRIGERACIÓN: Preparar 6 o 12 tubos en TSA. Conservar en refrigerador y cultivar del mismo tubo como máximo 3 veces. 4. TEMPERATURA AMBIENTE: Agar con carbón: Las cepas no-fastidiosas se pueden conservar hasta 6 meses. Para Pseudomonas aeruginosa se recomienda un tubo con agua destilada estéril (6 meses).
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública REGISTROS DOCUMENTALES Los registros sirven para al menos 4 propósitos: A) Documentan lo que ha ocurrido sin necesidad de recurrir a la memoria 8) Sirven como referencia para recrear la situación en la que se produjo un incidente C) Ayudan en el reconocimiento de tendencias y resolución de problemas D) Establecen el grado de credibilidad de un laboratorio ya q~ue demuestran la implementación del sistema de gestión de calidad. 1. FORMATO: planillas que se llenan manualmente o archivos electrónicos 2. TIEMPO DE CONSERVACIÓN: al menos 2 años, excepto los registros de instrumentos (mientras estén en uso), bioseguridad y personal (al menos 5 años). Deben ser accesibles al personal. 3. REGISTROS IMPRESCINDIBLES: Menú de prestaciones Mesa de entrada: lista de todas las muestras. Registro de no conformidades y acciones a tomar. Solicitudes de exámenes Hojas de trabajo con procedimientos y resultados 1 nformes de los resultados (parciales y finales) Controles de calidad de equipos, instrumentos, medios y reactivos, procedimientos (deben ser revisados y firmados por el supervisor mensualmente, cuando se exceden los límites de tolerancia se debe identificar el problema y documentar acción correctiva) Control externo de desempeño I Auditorias externas Reportes de incidentes (errores en la recolección o transporte de muestras, quejas, fallas en seguir procedimientos, violaciones a las normas de bioseguridad) y sus acciones correctivas. Certificados de participación en cursos del personal expuesto a material peligroso (se recomienda al iniciar el empleo y anualmente) Denuncias a MSP y envíos a Servicio Nacional de Laboratorios Registro de la capacitación técnica (y académica) del personal del laboratorio. Incluir cursos de educación continua. 13
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública DOCUMENTOS IMPRESCINDIBLES 1. Manual de Procedimientos: detalle los procedimientos que se realizan en el Laboratorio. Pueden ser documentos internos cuando son técnicas propias del mismo o documentos externos cuando se aplican procedimientos de publicaciones oficiales o normas. 2. Manual de bioseguridad: deberá contemplar la legislación vigente y los siguientes aspectos: Niveles de precaución para diferentes muestras y microorganismos (guantes, ropa protectora, antiparras, tapabocas, flujo laminar). Los.accidentes más frecuentes son las punciones y la contaminación por aerosoles. Descontaminación de superficies y material utilizado (hipoclorito, autoc!ave) Manipulación de deshechos peligrosos sólidos y líquidos, vidrio roto y jeringas. Disposición de recipientes separados para clasificar los residuos en infecciosos y comunes así como recipiente de paredes rígidas para cortopunzantes. Cuidado en el uso de sustancias químicas (almacenamiento, rotulación, lista de precauciones evitando poner juntos las sustancias incompatibles, campana de gases). Instrucciones frente a incidentes y accidentes (disponibilidad de ducha, teléfono de. emergencia móvil, _procedimiento para aseguradoras) Prevención de incendios: tipo, uso y localización de extinguidores, uso y localización de mantas y botiquín, procedimiento de evacuación
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública SEGUNDA PARTE RECOMENDACIONES PARA EL CORRECTO DESEMPEÑO EN LAS PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS l 1. Objetivos: Conocer la actividad in vitro de una sustancia antimicrobiana sobre un microorganismo causante de un proceso infeccioso, cuando esa actividad no puede ser predicha de antemano. Determinar la susceptibilidad al antimicrobiano de acuerdo a los niveles que se alcanzan en sangre y tejidos con las dosis usuales de tratamiento. Generalmente tiene una aplicación clínica (contribuir a la definición de una terapia antimicrobiana) pero también se realiza con fines epidemiológicos (estimar la incidencia de resistencia para proponer tratamientos empíricos) o de investigación (probar nuevas drogas). La respuesta in vitro de un microorganismo al antimicrobiano puede clasificarse en: sensible: una infección dada por la cepa en estudio puede ser tratada apropiadamente con la dosis recomendada para el tipo de infección y la especie infectante. intermedio: una infección dada por la cepa en estudio puede ser tratada apropiadamente con dosis más elevadas, ya sea porque la droga se concentra fisiológicamente (por ej; quinolonas y beta-lactámicos en orina) o porque puede ser. aumentada por encima de lo normal (por ej; betalactámicos ). Esta categoría también actúa de zona de "amortiguación" para prevenir pequeños e incontrolables factores técnicos. resistente: las cepas no son inhibidas por las concentraciones usualmente obtenidas al utilizar el antimicrobiano en la dosis recoméndada y/o se pone de manifiesto posibles mecanismos de resistencia específicos (por ej; beta-lactamasas) frente a los que la eficacia clínica de la droga no ha sido demostrada. Los puntos de corte entre cada una de estas categorías son definidos por comités de expertos que analizan el comportamiento de cepas con o sin mecanismos de resistencia, farmacocinética y farmacodinamia de las drogas, respuesta clínica y bacteriológica y diámetros o halos de inhibición de 15
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clínicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública crecimiento. Para conseguir resultados confiables es necesario adherir totalmente a la metodología y los criterios de interpretación de uno de esos comités de expertos, en este caso el Clinical and Laboratory Standards lnstitute (CLSI), en la cual basamos estas recomendaciones. Para conocer la susceptibilidad in vitro de un microorganismo frente a un antimicrobiano existen distintos métodos: Métodos cuantitativos: Son aquellos que determinan Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). Las pruebas se realizan por microdilución en caldo, en agar y elipsograma (E-test). El método estandarizado por CLSI es el de microdilución que enfrenta un inóculo bacteriano fijo a concentraciones crecientes de la droga hasta determinar cual es la menor concentración que inhibe el desarrollo bacteriano (CIM). Métodos cualitativos: Comprenden las pruebas de difusión que enfrentan un inóculo bacteriano fijo a un disco de papel de filtro embebido en una carga predeterminada de antimicrobiano. Las condiciones del ensayo son seleccionadas por CLSI para buscar la mejor correlación con la CIM. En caso de no obtener correlación no se recomienda utilizar el método de disco-difusión sino determinar la CIM (por ejemplo la susceptibilidad de S.pneumoniae a las cefalosporinas ). 2. DIFUSIÓN EN AGAR: Método de Kirby-Bauer El método más utilizado para conocer la susceptibilidad in vitro de los microorganismos a los antimicrobianos es el de disco difusión (método de Kirby Bauer modificado). Está estandarizado por CLSI (documento M2-A9) para microorganismos de rápido crecimiento. Algunos microorganismos-aeróbicos. denominados exigentes (fastidiosos) poseen requerimientos especiales de cultivo que se describirán brevemente al final. Figura 3. Staphy/ococcus saprophyticus: prueba de susceptibilidad a anti microbianos por el método de disco-difusión
Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública 2.1. PARÁMETROS A CONTROLAR EN LA PRUEBA DE DISCO- DIFUSIÓN. Para estandarizar el método de disco-difusión se debe implementar un control de calidad interno que garantice el.cumplimiento del procedimiento en todos sus pasos. También es conveniente participar de un control de calidad externo en el. que bacterias con susceptibilidad definida por métodos de referencia son distribuidas por un laboratorio. coordin~dor, ya que permite: comparar sus resultados con otros laboratorios obtener una evidencia del desempeño aprender a identificar problemas 2.1.1. CONTROL DEL MEDIO DE CULTIVO MUELLER HINTON El medio de cultivo empleado es el agar Mueller Hinton (MH), porque tiene muy buena reproducibilidad y favorece el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas. No obstante debe cumplir algunas condiciones que deben ser bien tenidas en cuenta al momento de su preparación. La buena calidad del producto y la interrelación con nuestro proveedor pueden ser claves. El medio MH en polvo debe ser evaluado cada vez que se prepara: no usar si está hidratado. Cada lote debe ser verificado antes de su uso de acuerdo a: Fecha de vencimiento ph Contenido de timina-timidina Contenido de cationes Calcio y Magnesio: Espesor. Humedad Esterilidad 2.1.1.1. Control del ph del medio de cultivo DEBE SER ENTRE 7.2 Y 7.4. EVALUAR CADA VEZ QUE.SE. PRE.PARA. Luego de preparar y esterilizar ~I medio, dispensar _agar en un tubo o placa de Petri. Dejar gelificar y medir con electrodo plano. Alternativamente, ro~per el agar y medir con electrodo común o cinta de ph con divisiqnes de 0.2. Si el ph está fuera de rango NO UTILIZAR: revisar el ph del agua destilada con el que se preparó, el recipiente donde se almacenó (frasco de vidrio limpio, tapa de rosca), el funcionamiento del destilador, etc. Si el agua era adecuada, descartar y probar un nuevo lote o frasco de MH y notificar al fabricante. Si el ph del medio es demasiado ácido (<7.2) se observan halos mayores a lo esperado en macrqlidos (eritromicina), aminoglucósidos (gentamicina, amicacina) y quinolonas (norfloxacina, ciprofloxacina) y halos menores en 17
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servici? Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública penicilinas y tetraciclinas. Si el ph del medio es demasiado alcalino (> 7.4) 'se observa el efecto contrario. 2.1.1.2 Control de timina-timídina en el medio de cultivo EL CONTENIDO DE TiMINA-TIMIDINA DEBE SER ESCASO O NULO. EVALUAR SOLO CUANDO SE COMIENZA UN NUEVO LOTE. Ensayar la susceptibilidad de la cepa de referencia Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a trimetoprim/sulfametoxazol. El halo de inhibición debe ser mayor a 20 mm. Eventualmente se corrige con plasma de caballo al 3% (contiene timidina fosforilasa) pero se aconseja descartar, probar un nuevo lote de MH y notificar al fabricante. 2.1.1.3 Control de cationes EL CONTENIDO DE CATIONES D~BE SER 20-25 mg/l de CALCIO y 10-12.5 _mg/l de MAGNESIO. EVALUAR SOLO CUANDO SE COMIENZA UN NUEVO LOTE. Un aumento del contenido de cationes reducirá los halos de inhibición mientras que bajás concentraciones resültan en halos mayores a los esperados.. Ensayar la susceptibilidad de la cepa de referertcia Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785~ frente a gentamicina (10 µg). El halo de inhibición debe ser entre 16y21 mm... El exceso de iones de zinc podría reducir los halos de inhibición de los carbapenems, que deben ser entre 20 y?8 mm para imipenem y entre27 y 33. para meropenem. De ló contrario descartar y probar un nuevo lote de MH y notificar al fabricante. 2.1.1.4 Control del espesor del agar EL ESPESOR DEBE.SER DE.4 ± 0.5 mm EN TODA LA PLACA DE PETRI. ESTANDARIZAR Y EVALUAR CADA VEZ QUE SE PREPARA... El volumen del medio para obtener los 4 mm es aproximadamente de 25 mi para placas de 9 cm de diámetro y aproximadamente de 30 mi para las de 1 O cm. Como existen numerosos tipos. de placas de Petri deberá realizar una prueba repartiendo diferentes volúmenes de medio hasta determinar la cantidad que corresponde a 4 mm de espesor y repetir este ensayo cada vez que cambie la m~rca de las placas de Petri que usa. No es aceptable medir el espesor con una regla por el borde exterior.de la placa, ya que el medio forma un menisco hacia las paredes. El método correcto es utilizar un.calibre cuyo extremo se hunde en el agar en 4 puntos diferentes (para asegurarse de que ~I espesor es homogéneo). Estas placas se descartan.
Departamento de Laboratorio Clinico, Hospital de Clinic~s - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Eventualmente, el medio podría ser fraccionado en tubos o frascos con el volumen estandarizado para cada placa previo a la esterilización, si el laboratorio realiza pocos ensayos de susceptibilidad y los prepara por ejemplo para utilizar en la semana. Si el número de placas de MH que se preparan es alto, recomendamos utilizar un tubo de plástico o vidrio estéril enrasado al volumen definido previamente y que corresponde a los 4 mm para ese tipo de placa y medir el volumen de cada una antes de volcarlo, trabajando en forma aséptica. Este procedimiento debe realizarse sobre una mesada de superficie uniformemente horizontal (controlar con nivel). Si el medio de cultivo tiene un espesor menor al indicado los halos de inhibición son más grandes de lo esperado y el resultado es FALSA SENSIBILIDAD. El. efecto contrario, un espesor mayor al indicado resulta en FALSA RESISTENCIA. Figura 4. Salinonel/a enterica: la resistencia a Ácido Nalidíxico indica susceptibilidad reducida a fluoroquinolonas (podría ocurrir una falla terapéutica en infecciones extraintestinales) 2.1.1.5 Control de humedad LA HUMEDAD DE LAS PLACAS DE MH DEBE SER EVALUADA CADA VEZ QUE SE HACE EL ENSAYO DE SUSCEPTIBILIDAD. Para evitar la condensación en el momento de repartir el medio en placas, se debe dejar enfriar hasta 45-50 ºC, es decir, cuando la mano lo puede tolerar sin quemarse. Al momento de usarlas la superficie del medio debe ser húmeda pero no debe contener gotas de condensación (tampoco en la tapa de la placa de Petri). Para eliminar las gotas se colocan las placas en estufa a 35 C por 1 O a 30 minutos antes de su uso. La ventaja de conservar las placas en refrigerador envueltas en plástico es que se evita la deshidratación (con el consiguiente cambio de concentración y espesor) pero aumenta el riesgo de exceso de humedad. Lo contrario ocurre si se empaquetan en papel. El método de almacenamiento debe elegirse en función de la cantidad que se consuma por semana, el tipo de heladera, etc. 19
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Públ~ca 2.1.1.6 Control de esterilidad LA ESTERILIDAD DEL MEDIO DEBE SER EVALUADA CADA VEZ QUE SE PREPARAN PLACAS. Cada frasco de MH debe ser observado con luz trasmitida antes de distribuir en placas. No usar frascos con medio turbio o con partículas en suspensión. Del lote de placas preparadas, separar aproximadamente el 5 % (incluyendo la última placa repartida). Incubar 48 horas en estufa de 35-37 ºC y 48 horas a temperatura ambiente. Observar cualquier tipo de crecimiento y registrar en la planilla correspondiente. Desechar las placas que ya fueron incubadas para el control de esterilidad. Si la contaminación es mínima (1-2 colonias) revisar el procedimiento de preparación, especialmente el lugar físico donde se realiza. Si la contaminación es notoria (múltiples colonias, más de una placa, colonias en inclusión) descartar el lote e investigar la fuente probable. Antes de realizar el ensayo de susceptibilidad, revisar con luz reflejada la superficie de la placa en búsqueda de micro-colonias. Descartar las placas que las contengan. 2.1.2 CONTROL DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA DE DISCO-DIFUSIÓN Densidad del inóculo Tiempo de aplicación del inóculo Carga de los discos de antimicrobianos Aplicación de los discos Temperatura y tiempo de incubación Medición e interpretación de los halos Informe de los resultados 2.1.2.1 Densidad del inóculo A partir de una placa en medio de cultivo sin inhibidores y con crecimiento mono-bacteriano de no más de 24 horas, se debe preparar una suspensión en suero fisiológico en volumen suficiente y en tubo transparente para poder observar su turbidez. Esta suspensión se ajustará al patrón 0,5 Mac Farland (equivalente a 1-2 x 10 8 UFC/ml). Se recomienda comparar ambos tubos (previa agitación para homogeneizar) contra una tarjeta blanca con líneas negras paralelas. Los tubos tienen que ser del mismo calibre y material que el tubo que contiene al patrón Alternativamente es posible ajustar la suspensión bacteriana con espectrofotómetro a 625 nm (al cual se le ha sido controlado periódicamente el funcionamiento) a una absorbancia de 0,08 a O, 13. El patrón de 0.5 Mac Farland puede obtenerse solicitándolo al Servicio Nacional de Laboratorios de Salud Pública o puede ser el~borado en su laboratorio: agregar 0.05 mi de 1 % CbBa (1, 1 g CbBa + 2H20 en 100 mi H20, PN) a 9.95 mi de 1 % H2S04 (VN).
Departamento de. Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacion~I de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Figura 5. Escherichia coli: hiperproducción de beta-lactamasa de espectro ampliado AmpC Al utilizar el patrón 0,5 Mac Farland deberá tener en cuenta: fecha de vencimiento. 1 almacenamiento a temperatura ambiente y resguardado de la luz control mensual de densidad con espectrofotómetro a 625 nm (absorbancia de 0,08aO,13) control cada vez que se realiza la prueba: al mezclar debe ser una solución homogénea sin partículas en suspensión. registro de preparación y control del estándar o registro de fuente, fecha de recepción y de vencimiento de cada lote. La falta de estandarización en el inóculo es una de las variables que más afecta los resultados de las pruebas de disco difusión. A mayor densidad {>0,5 Mac Farland) se observa disminución en los halos de inhibición o falsa resistencia y a menor densidad se produce el efecto contrario. 2.1.2.2 Tiempo de aplicación del inóculo El inóculo debe sembrarse dentro de los 15 minutos posteriores a la preparación y estandarización de la suspensión o se obtendrán halos de inhibición disminuidos o falsa resistencia. Se sumerge un hisopo en la suspensión bacteriana estandarizada, se escurre contra las paredes del tubo y se aplica en 3 direcciones. Si se siembran varias placas se debe volver a sumergir y escurrir el hisopo entre cada placa. 2.1.2.3 Carga de los discos de antimicrobianos EL CONTROL DE LA CARGA DE LOS DISCOS DEBE REALIZARSE CUANDO SE ADQUIERE UN NUEVO LOTE Y REPETIRSE CADA 15 DÍAS. 21
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública Los discos de antimicrobianos deben ser almacenados a 4-BºC cuando están en uso y a -20 ºC cuando están en reserva. Algunos discos son particularmente inestables: ' 1. los que contienen inhibidores de beta-lactamasas como clavulánico, sulbactam o tazobactam 2. los carbapenems (imipenem y especialmente meropenem) por lo que se recomienda conservar a -20 ºC, aun los que se encuentran en uso. Los envases que los contienen deben ser herméticos y contener desecante (sílica gel), inclusive los dispensadores automáticos, para evitar la humedad y la consiguiente pérdida de concentración. Al adquirir un nuevo lote se debe revisar el contenido o carga del disco en µg y que este de acuerdo a las normas CLSI y su fecha de vencimiento. Regístrelo. La carga del disco se debe controlar mensual o quincenalmente realizando la prueba de disco difusión por el método estandarizado, con las cepas de referencia y los discos que se están usando en ese momento, incluyendo todos los antimicrobianos que se ensayan habitualmente en su laboratorio: T a bl a 4 C epas d e re f erenc1a para e con t ro 1 d e 1 os d' ISCOS Cepa Escherichia co/i A TCC 25922 Escherichia co/i A TCC 35218 Utilidad Control de discos de bacilos Gram negativos fermentadores Control de discos con inhibidores de beta-lactamasas Esta cepa contiene una beta-lactamas_a plasmídica que puede perderse tras varios repiques por lo que se debe comprobar si continua siendo resistente a ampicilina. Pseudomonas aeruginosa ATCC Control de concentración de cationes en el medio 27853 Control de discos de bacilos gram negativos no fermentadores Enterococcus faeca/is A TCC 29212 Control de concentración de timina o timidina en el ' medio Control de disco de gentamicina de alta carga (120 µg) Staphylococcus aureus A TCC Control de discos de cocos Gram positivos 25923 Klebsiella pneumoniae A TCC Control de prueba de tamizaje y confirmatorios de 700603 beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) Enterococcus faecalis ATCC 51299 Control de medio de cultivo con vancomicina y alto nivel de resistencia a aminoglucósidos Staphylococcus aureus A TCC Control de prueba de tamizaje de agar con oxacilina 43300 Estas cepas de control d~ calidad son suministradas por el Servicio Nacional de Laboratorios de Salud Pública anualmente o pueden ser adquiridas de fuentes comerciales en diferentes formatos. Los rangos de los halos de inhibición esperados para cada antimicrobiano están consignados en la tabla 3 del documento M 100 de CLSI. Para interpretar resultados fuera de rango se recomienda recurrir a la "Guía de resolución de problemas" de CLSI. Si su medio de cultivo ha sido debidamente controlado y
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clinicas -.Servicfo Nacional' de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública.. el resultado insatisfactorio se debe. a la pérdida de carga de uno o más discos. L~ acción ~orrectiva es: descártelos, pruebe inmediatamente un nuevo paquete o lote de discos y no olvide anotar 1as acciones correctivas en su hoja de registro.. La pérdida de carga de los discos de antiniicrobianos es un fenómeno común, especialmente cuando las condiciones de almacenamiento no son óptimás: falta de control en la temperatura de los refrigeradores y congeladores,. excesiva humedad en equipos con capacidad sobrepasada, ruptura de la cadena de frío antes de llegar al laboratorio, envases abiertos, etc. Si no se controla la carga de los discos no se puede garantizar la calidad de las pruebas de ~usceptibilidad a los antimicrobianos. p/lrjxoaus t!ptd6711rlis mt!ti::gino IP>s!en~ r:;,,.,,. M(erilroR cllnd.5) Figura 6. Staphy/ococcus. epidermidis: resistencia a betalactámicos evidenciada con los discos de oxacilina (OX) y cefoxitin (FOX). 2.1.2.4 Apli~ación de los discos de antimicrobianos Los discos se deben sacar. del refrigerador o congelador al menos una hora antes de su uso para que se equilibren con la temperatura ambiente antes de abrirlos y así evitar la condens.ación que se produce al entrar en contacto el aire caliente con los discos fríos. Verifique la fe.cha de vencimiento y descarte los discos vencidos. Aplique los discos dentro de los 15 minutos posteriores a la siembra del inóculo, considérelo si debe realizar un gran número de pruebas. La demora resulta en halos de inhibición disminuidos o falsa resistencia. La distancia entre los discos no debe ser menor a 24 mm de centro a centro ni deben colocarse muy cerca del borde de la placa (6 a 7 discos en una placa estándar y 12 discos en la. placa de 150 mm de diámetro). Se recomienda situar los discos que dan halos pequeños (gentamicina y vancomicina) junto a los que dan halos grandes (cefalosporinas).. Como algunos antimicrobianos difunden casi instantáneamente, un disco no d~be ser" re-localizado una vez qu"e ha entrado en contacto con la superficie del agar. En tal caso coloque otro disco del mismo tipo en el lugar correcto. 23
Departamento de Lab~ratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorio~, Ministerio de S~lud Pública 2.1.2.5 Témpe~atura y tiempo _de incubación.. Las placas deben ser incubadas inmediatamente y en posición invertida. La mayor parte de los microorganis_mos deben ser incubados a 35 ± 2 C entre 16 y 18 horas. Las condiciones de cultivo son diferentes para Staphylococcus _aureus con los siguientes antimicrobianos: oxacilina (temperatura s 35 ºC + - 0,2 y 24 horas) y vancomicina. (24 horas) y para Enteroco_ccus con vancomicina (24 horas). Por lo tanto se aconseja tener una estufa a 35 +- 0,2C para incubar todc;1s las pruebas de súsceptibilidad. En general, la incubación por más de 24 horas resulta en halos de inhibición disminuidos o falsa resistencia. La temperatura mayor a 37 ºC resulta en halos de inhibición aumentados o falsa sensibilidad. Figura 7. Stapfiylococcus áureus meticilino-resistente comunitario: fenotipo MLSs de resistencia a eritromicina y clindamicina (inducible) Figura~ Staphy/ococcus aureus meticilino-resistente hospitalario: multirresistente 2.1.2.6 Me~ición e interpretación de lo~ halos Antes de medir los halos de inhibición debemos verificar: que el. desarrollo bacteriano sea confluente (de lo contrario hay un error en la densidad del inóculo, la temperatura de incubación o la calidad del medio de cultivo). que 1as zonas de inhibición sean uniformes y circulares. Las deformaciones de lós halos pueden ser un error de procedimiento o. interacciones que ponen de manifiest~ un m ecanismo de resistencia (ej.
Departamento de Laboratorio Clfnico, Hospital de Clfnicas - Servicio Nacional de Laboratorios, Ministerio de Salud Pública beta-lactamasas de espectro extendido y efecto D o inducción de resistencia a clindamicina por eritromicina) si hay halos dobles que sugieran una flora polimicrobiana si hay colonias dentro de algún halo, lo más probable es que sea un cultivo mixto, pero podría ser una subpoblación resistente Figura 9. Medición de los halos de inhibición con calibre ala luz refleiada Medir con regla transparente o calibre a la luz reflejada, excepto oxacilina y vancomicina en S.aureus y vancomicina en Enterococcus que deben observarse a trasluz (luz trasmitida) en búsqueda de resistencia heterogénea o micro-colonias dentro del halo. Considerar la línea de demarcación obvia entre crecimiento y no- crecimiento, no esforzarse para ver las colonias más diminutas. Los halos difusos deben obviarse cuando se trata de Proteus con hauch o en el caso de trimetoprim/sulfametoxazol en el que se debe medir el punto donde haya una reducción del 80% en el crecimiento. Al incorporar a un nuevo técnico a esa actividad es conveniente hacer un control "ciego" con mediciones en duplicado (nuevo y viejo operador) para estandarizar la lectura. No confiar en la memoria sino comprobar la categoría de interpretación (S, 1 o R) según especie y antimicrobiano en las normas CLSI del año en curso (M 100).. 2.1.2.7 Verificación de los resultados e informe Los reportes de rutina al clínico deben incluir sólo aquellos antimicrobianos de uso terapéutico,_ no los que se usan por razones taxonómicas o epidemiológicas (aunque estos últimos deben.estar disponibles para el Comité de Infecciones). No es conveniente informar aquellos de aplicación parenteral en pacientes ambulatorios, a menos que sean la única opc.ión de tratamiento y se coordine con los Servicios Clínicos. Es conveniente utilizar el nombre original del microorganismo y el nombre genérico (oficial) del antimicrobiano (no la marca)~ También se recomienda 25