Vectores Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa.. Se introducen dentro de la célula c hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Vectores de expresión, poseen toda la información n necesaria para expresar una secuencia aminoacídica dica.
Vectores de clonado PLASMIDOS: Características: Son pequeños (miles de pares de bases) Son circulares moléculas de DNA doble cadena y circular que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma Tienen un único origen de replicación Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción Gran numero de copias Marcadores que permitan su reconocimiento
Características generales de los vectores de clonado: Sitios de restricción únicos mcs Marcadores genéticos (permiten selección de transformantes) pbr322 4361 bp Orígen de replicación Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)
Vectores de expresión n eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación n del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión n de RNA polimerasa. Constitutivos: Elementos promotores Promotor Tata Box SV40, RSV, CMV, hef-1a Inducibles: Tet o T-Rex T inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína na inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona
Vectores de expresión n eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación n del vector dentro del organismo hospedador. Promotor: Sitio de unión n de RNA polimerasa. Terminador: Sitio de terminación n de la transcripción. n. Sitio de unión n a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción n (Secuencias( Kozak y codón ATG). Sitio de clonado múltiple m (MCS): Región n del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricci ción. Factor de selección: Codifica el/los marcador/es de selección n que permita diferenciar células c transformadas. Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag tag, His-tag tag, péptido ptido señal de localización periplasmatica,, etc. Segmentos de DNA para recombinación homóloga (para transfecciones estables).
Vectores de expresión n eucariotas
Resumiendo... k Obtención n de grandes cantidades del plásmido para su posterior transfección n a células c eucariotas.
Clonado de PTP1B en el vector de expresión n eucariota pgfp-n1 PTP1B pgfp-n1
Transfección n de células eucariotas
Se usa el término Transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a las células eucariotas mediante métodos químicos o físicos. Se denomina Infección a la introducción de DNA foráneo dentro de las células eucariotas mediante la utilización de moleculas virales.
Objetivos de la transfección - Expresión de proteínas para su purificacón. - Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. - Estudio de promotores y elementos regulatorios. - Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales,, etc. -Estudio de interacción de proteínas nas. - Estudio de localizacion subcelular de proteínas nas. - Terapia génica.
Transfección: n: proceso por el cual un gen de interés s es introducido dentro de la célula c eucariota por métodos m químicos y físicos. f Métodos químicos: DEAE-Dextrano Dextrano Métodos físicos: f Coprecipitados de Fosfato de calcio Lípidos cationicos (Liposomas) Biobalística Microinyección Electroporación
Métodos químicos
Métodos FísicosF Microinyección Electroporación Biobalistica
Métodos FísicosF Biobalistica
Resumen Liposomas Fosfato de calcio DEAE-dextrano alta eficiencia,, no-tóxico xico, estables simple, baja eficiencia, no para estable simple, alta efiencia, no para estable,toxico para algunas líneas celulares Electroporación Microinyección Biobalística alta eficiencia,, altos niveles de muerte laborioso, alta eficiencia baja eficiencia, muy costosa,, se han logrado buenos resultdos solo para células vegetales
Transfección n estable y transiente Transfección estable Por integración Por recombinación homóloga Requiere de un marcador de selección en el vector Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
Transfección n estable y transiente Transfección transiente (48 a 72 horas) Análisis rápido Múltiples propósitos Análisis de secuencias regulatoria
Consideraciones para transfección n con lípidos l cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos ticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección n del promotor Cantidad de DNA
Infección: n: proceso mediado por una molécula viral donde la células c target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia de interés s en su genoma. Ejemplos: Vaccinia Semmliky Baculovirus