ARTÍCULOS ORIGINALES Indicadores láser y daño retiniano. Estudio histopatológico en conejos Lina María Loaiza Schoonewolff* Gabriel Jiménez Echeverri** Julia Duarte*** *Residente tercer año Oftalmología. Pontificia Universidad Javeriana. **Profesor. Unidad de Oftalmología. Facultad de Medicina Pontificia Universidad Javeriana. ***Profesora asociada departamento de patología. Facultad de medicina pontificia universidad javeriana. RESUMEN Objetivo: evaluar los cambios histopatológicos de la retina en conejos Nueva Zelanda, luego de exponerlos a indicadores láser por un tiempo determinado, para así evaluar el daño que se puede presentar con su utilización. Materiales y métodos: consta de dos partes: la primera es el estudio histopatológico de la retina normal de los conejos Nueva Zelanda y la segunda el análisis histopatológico de la retina de conejos de similares características genéticas, luego de exponerlos al rayo de indicadores tipo 2 durante 1 minuto. Resultados: la hipótesis del posible efecto deletéreo de los indicadores láser, no fue demostrada en este trabajo; ya que los resultados histopatológicos de los dos grupos a estudio no mostraron diferencias cuantificables significativas. Conclusión: aunque con este estudio no se logró documentar ninguna evidencia histológica de daño retiniano en los ojos expuestos a la radiación láser, los peligros y seguridades de
los láser deben ser recalcados al público en general hasta que no sea demostrada su seguridad en estudios a gran escala. Palabras clave: indicadores láser, daño retiniano. INTRODUCCIÓN Los indicadores láser pueden producir fotocoagulación retiniana en un ojo con medios oculares claros al exponerlos por más de 10 segundos. Estos indicadores son catalogados como de clase 3a y producen energías de menos de 5mW[1]. En oftalmología se utilizan rutinariamente poderes entre 100 y 500 mw para fotocoagulación retiniana, poderes con los cuales se ha demostrado destrucción de tejido sano adyacente a la región tratada. Por lo tanto los indicadores láser parecen tener un riesgo ocular relativo[2]. Se sabe que un daño térmico mínimo determinado oftalmoscópicamente en vivo es una aproximación gruesa al daño en el tejido retiniano y que cambios morfológicos que podrían afectan la función visual pueden ocurrir a niveles no visibles con el oftalmoscopio[3]. Este trabajo busca encontrar la presencia de daño retiniano a nivel histopatológico luego de la exposición a indicadores láser mediante un estudio experimental en conejos Nueva Zelanda. La retina del conejo es similar, estructuralmente hablando, a la de los cerdos guinea, la cual ha contribuido tanto al conocimiento de la morfología normal de la retina. La retina normal del conejo ha sido analizada con microscopia electrónica por Robertis y sus observaciones confirmaron las reportadas previamente por Sjostrand en los cerdos guinea. La primera es particularmente difícil de preservar en comparación con las retinas de otros animales estudiados en laboratorio, por lo cual se han estudiado técnicas especiales de fijación ya que con las convencionales, sólo se logra obtener una parte limitada de la retina. La descripción general de la retina del conejo tiene tres tipos de elementos: los receptores, las células bipolares y las células ganglionares; elementos que se identifican más fácilmente por la posición del núcleo celular. Los núcleos de los receptores están en la capa más cercana a la esclera y tiñen intensamente; las células bipolares situadas en una capa intermedia de núcleos grandes y pálidos y por último las células ganglionares que tienen núcleos grandes, pálidos y dispersos en cercanía a la superficie vítrea de la retina. En resumen, no hay diferencias básicas con respecto a la organización estructural de las células receptoras de los conejos en comparación con otros mamíferos.
Las capas de la retina del conejo son: capa de receptores, capa de células bipolares, capas plexiformes interna y externa, capa de células ganglionares, células de Müller, capa de fibras nerviosas (axones de las células ganglionares) y el epitelio pigmentario. Las células receptoras tienen segmentos internos y externos, existen dos tipos: dominan en cantidad los bastones típicos y existe otro tipo celular en menor cantidad pero sin ser típicos conos. La relación entre la capa de receptores y el epitelio pigmentario es también característica: sus segmentos externos están rodeados por procesos celulares numerosos, densamente organizados, del epitelio pigmentario. Las células bipolares se caracterizan por núcleos grandes y pálidos con nucleolo bien demarcado rodeado por escasa cantidad de citoplasma. Existen es esta capa otras células que pueden representar células horizontales, sin embargo es imposible caracterizar varios tipos celulares en microscopia electrónica sin reconstrucción tridimensional. En las capas plexiformes es donde ocurren los contactos sinápticos y su complejidad es bien revelada por medio de microscopia electrónica. Las células ganglionares son muy pocas y no forman una capa continua; tienen grandes núcleos localizados excéntricamente, hacia la superficie vítrea de la retina, con un gran citoplasma extendiéndose escleralmente. Las células de Müller se extienden con grandes cuerpos desde la membrana limitante interna hasta la nuclear externa, donde la organización densa de los núcleos de los receptores sólo permite que delgadas extensiones de las células de Müller lleguen a la membrana limitante externa. La capa de fibras nerviosas muestra la característica general de fibras amielínicas con filamentos de axones, elementos vesiculares y mitocondrias dispersas. Por último el epitelio pigmentario (epr) consiste en una capa simple de células con polaridad definida. En una pequeña área central de la retina, la cual es diferente histológicamente al resto de la retina, hay aproximadamente 9 filas de receptores (mucho menos que en el resto de la retina) y tres o cuatro filas de células ganglionares. Aunque las células ganglionares están completamente desarrolladas al segundo día de vida, la retina del conejo probablemente no está completamente diferenciada hasta las seis semanas de nacido aunque para el final de la segunda semana ya está lo suficientemente diferenciada como para ser funcional[5]. Las similitudes histológicas de la retina del conejo con las del humano hacen que se estudien hallazgos que pueden extrapolarse al ojo humano. En años recientes los indicadores láser han sido utilizados como juguetes para niños por lo cual se ha aumentado el interés público sobre su bioseguridad. Es así como el gobierno federal de Estados Unidos obliga a los fabricantes a marcar cada instrumento láser con el anuncio apropiado de su potencial daño. Los láser han sido clasificados en cuatro grupos: los láser clase 1 son considerados incapaces de producir daño por exposición ocular, no requieren medidas de control y su
poder mayor es de 0.024mW. Los clase 2 producen un poder entre 1 y 5 mw mientras que los clase 3a y 3b tienen poderes entre 5 y 500 mw, respectivamente. Los clase 4 ya son láseres peligrosos de uso industrial, militar o médico y generan más de 500mW de poder. Los oftalmólogos utilizan rutinariamente poderes entre 100 y 500 mw para fotocoagulación retiniana, es decir que los láser clase 3b tienen un riesgo ocular serio. Los indicadores láser son de diodo y son clase 2 ó 3a con poderes menores a 5mW, teniendo así una seguridad relativa. Estos indicadores producen luz roja, en rangos entre 632.8 nm para helium-neón hasta 670 nm para GaA1As diodo. La luz roja puede causar fotocoagulación retiniana a irradiaciones altas[1]. La absorción retiniana de la energía liberada por el láser se debe a la presencia normal de pigmento y hemoglobina en dicho tejido[4]. Existen reportes de daño retiniano bilateral causado por la exposición a la luz de un indicador láser por 20-30 segundos de exposición. Los síntomas presentados fueron visión borrosa bilateral y escotoma central en ambos ojos, síntomas que resolvieron espontáneamente a los dos días aunque persistiendo cicatrices retinianas durante los diez meses de seguimiento[9]. Otros estudios reportaron epiteliopatía e incomodidad ocular secundaria a la exposición ocular a dichos rayos, aunque los hallazgos retinianos no fueron consistentes[10]. Algunos investigadores han encontrado que los indicadores láser comerciales, comúnmente utilizados con propósitos de enseñanza o entretenimiento, pueden causar daño macular notable si se abusa de ellos. Siendo éstos clase 2 y con exposición de aproximadamente 10 segundos. Morfológicamente esto se puede manifestar como alteración en el epitelio pigmentario a nivel de la fóvea[11]. Existen otros estudios donde consideran que no existe un riesgo real de daño retiniano inmediato o tardío si la retina es expuesta momentáneamente a la radiación producida por estos indicadores láser. En diciembre de 1997, la fda, alertó sobre la posibilidad de daño ocular a causa de estos instrumentos. En un artículo que revisa los mitos y realidades de los indicadores láser publicado al año siguiente, Marshall sostiene que, aunque estos láser pueden ser peligrosos porque pueden causar distracción (por ejemplo en individuos que van conduciendo), él no cree que ningún láser comercialmente disponible al público pueda causar daño permanente a la retina humana[12]. Los indicadores láser han venido siendo utilizados inapropiadamente, por lo cual es importante mantenerlos lejos de los niños, ya que en los adultos la pupila, el parpadeo y respuestas de aversión terminan con la exposición accidental al láser en menos de 0,25 segundos, por lo menos hasta que se compruebe completamente su inocuidad.
MATERIALES Y MÉTODOS El estudio pretende evaluar los cambios histopatológicos de la retina en conejos Nueva Zelanda, luego de exponerlos a indicadores láser por un tiempo determinado, para así evaluar el daño que se pueden presentar con su utilización mediante un diseño experimental. Este estudio consta de dos fases: la primera es el estudio histopatológico de la retina normal de los conejos Nueva Zelanda y la segunda el análisis histopatológico de la retina de conejos de similares características genéticas, luego de exponerlos al rayo de indicadores láser tipo 2 durante 1 minuto. Primera fase Se utilizaron 5 conejos Nueva Zelanda de 45 días de nacidos, sexo masculino y con pesos entre 1.400-1.600 gramos, posteriormente se sacrificaron con inyección de pentotal sódico por la vena de la oreja a 35 mg por kilo iniciales y posteriormente 1 cc adicional como dosis letal, siguiendo las normas para estudio experimental en animales, finalmente se realizó técnica de enucleación en los 10 ojos permaneciendo los especímenes una vez enucleados en formalina 10% durante 72 horas para su fijación. Durante la enucleación se colocaron suturas de orientación espacial para determinar el área macular y facilitar la inclusión de ésta en el espécimen a estudiar. A cada ojo se le realizó el proceso de histotecnología consistente en sección del espécimen horizontalmente, para así incluir la región macular en el corte P-O (pupila-nervio óptico). El espécimen seleccionado para estudio fue únicamente el P-O el cual es colocado en casete de metal que se sumerge en alcohol etílico al 80% quedando listos para ser procesados. Se retiró la porción P-O del casete se coloca en el molde de parafina, lo cual se conoce con el nombre de "embedding" (figura 1). Luego se dejó enfriar la parafina hasta que estuvo opaca y se colocó en el refrigerador por 30 minutos. Posteriormente se retiró el bloque de parafina y se coloca bajo lámpara de calor. Para finalmente seccionar el bloque con el micrótomo. Por último se montaron las láminas eliminando las arrugas existentes, marcando cada una de las diez placas, y dejándolas secar sobre una mesa durante toda la noche, quedando así listas para la coloración al otro día (figura 2).
Este proceso se realizó con la asesoría y ayuda del histotecnólogo del Departamento de Patología del Hospital Universitario San Ignacio. Las placas se analizaron bajo microscopia de luz en compañía de la doctora Julia Duarte, docente del Departamento de Patología. Segunda fase Esta parte del estudio consistió en utilizar cinco conejos, de iguales características en cuanto a raza, sexo, edad y peso a los utilizados en la primera parte y exponer los ojos de éstos, a radiación ocular con un indicador láser diodo de longitud de onda entre 630 y 680 nm catalogado como clase 2 con poder menor a 3 mw. Para asegurar el ángulo de incidencia de la luz del láser en la mácula y en la retina a 5 de la fijación, fue necesario diseñar y fabricar un instrumento en polipropileno. Éste fue diseñado teniendo en cuenta el diámetro corneal del conejo y el diámetro del rayo de luz. Se realizó en este material para asegurar que su contacto con la córnea y esclera no causara daño alguno en el animal.
Primero se realizó midriasis farmacológica de todos los ojos con mezcla de fenilefrina (OQ-Dilat) y tropicamida (Mydriacyl) para asegurar que el rayo de luz llegara a la retina. Se anestesiaron los conejos con éter y luego se les aplicó proparacaina tópica (Alcaine) previa colocación del blefaróstato. Se colocó el instrumento que sujeta el láser diodo sobre la córnea de cada ojo y se realizó la radiación durante un minuto en posición perpendicular (a 90 ) y en posición lateralizada (a 5 ) de la región foveal durante otro minuto. Procedimiento realizado de igual forma en los 5 conejos. Se utilizaron baterías nuevas en los láser de diodo utilizados. A las 24 horas de la exposición se realizó la enucleación de los 10 ojos previa anestesia intravenosa con pentotal de sodio por la vena de la oreja; de igual forma a la mencionada en la primera parte del estudio. El resto del procedimiento de fijación y manejo histotecnológico del espécimen se realizó de igual forma a la mencionada para el estudio histológico de la retina normal. De igual manera se analizaron las placas bajo microscopia de luz. RESULTADOS Los siguientes fueron hallazgos de la retina normal en los conejos Nueva Zelanda; están seleccionadas las placas histológicas más representativas de cada capa y corresponden a los ojos control, es decir, sin exposición al láser. En la figura 4 se observan las capas de la retina normal del conejo con todos sus componentes celulares. Específicamente se observa cómo el epr se encuentra desprendido de la retina neurosensorial y está adherido a la esclera (figura 4).
Se observan con más detalle la capa nuclear externa compuesta por los núcleos de los fotorreceptores (bastones) y la capa nuclear interna formada por los núcleos de las células bipolares. Los detalles y la complejidad de las capas plexiformes no se observan por no ser ésta una preparación de microscopia electrónica (figura 5). Las células ganglionares son muy pocas y no forman una capa continua; tienen grandes núcleos localizados excéntricamente, hacia la superficie vítrea de la retina, con un gran citoplasma (figura 6). Las siguientes son las preparaciones histológicas de los ojos expuestos a radiación con láser de diodo clase 2. En este corte se observa una zona de transición entre el epitelio pigmentario desprendido y el no desprendido. También se observa el tejido que compone el nervio óptico (figura 7).
En la esta placa histológica es claro cómo el epr se encuentra desprendido de la retina neurosensorial y está completamente adherido, conformando una capa más del tejido escleral. Hallazgo idéntico al encontrado en los ojos control (figura 8). En esta última placa se pueden ver en detalle las capas que componen la retina sin encontrar diferencia alguna a lo ya mencionado al describir la retina normal de los conejos Nueva Zelanda (figura 9). Por lo anteriormente expuesto, la hipótesis del posible efecto deletéreo de los indicadores láser, no fue demostrada en este trabajo; ya que los resultados histopatológicos de los dos grupos a estudio no mostraron diferencias cuantificables significativas. Se presentó un desprendimiento del epitelio pigmentario de la retina (epr) reproduciéndose así lo obtenido en las investigaciones previas de la literatura revisada, sin embargo dichos estudios no utilizaron un grupo control para analizar este hallazgo. Por haber encontrado el mismo desprendimiento en el grupo control y el expuesto, asumimos que esto puede ser debido un artefacto de la preparación histológica.
CONCLUSIONES Aunque con este estudio no se logró documentar ninguna evidencia histológica de daño retiniano en los ojos expuestos a la radiación láser, los peligros y seguridades de los láser deben ser recalcados al público en general hasta que no sea demostrada su seguridad en estudios a gran escala. Por seguridad, es importante que los indicadores láser se mantengan fuera del alcance de los niños y no, como está sucediendo actualmente en nuestro medio, que se utilicen como sorpresa en las fiestas infantiles. Si un láser tiene como fin ser un juguete, éste debe corresponder a los láser tipo 1, únicos que son considerados como incapaces de causar daño ocular por exposición. BIBLIOGRAFÍA 1. Armed Forces Institute of Pathology. Laboratory methods in histotechnology. Editado por Edna Prophet, 1992. 2. Castaño Giovanni. Bioseguridad de los indicadores láser. Riesgos de sufrir lesiones oculares en la población pediátrica. Pediatría. 1999. 34 (1). 3. Ham William. Retinal burn thresholds for the helium-neon laser in the rhesus monkeys. Arch Ophthal. Diciembre 1970. 84, 797-809. 4. Israeli D. Hod y Geyer O. Retinal injury induced by laser pointers. Harefuah. Enero 2001. 140, (1): 28-29. 5. Mainster Martín. Pointers on laser pointers. Ophthalmology. Agosto 1997. 104, (8): 1.213-1.214.
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