MEMORIA FINAL DEL PROYECTO

MEMORIA FINAL DEL PROYECTO Biodiversidad de la microbiota láctica presente en la fermentación maloláctica de vinos tintos Cencibel elaborados en Castilla-La Mancha en dos vendimias consecutivas CÓDIGO PROYECTO: RM2006-00011-C02-00 Investigadores responsables: Mª de los Llanos Palop Herreros- Universidad Castilla-La Mancha Pedro M. Izquierdo Cañas- Instituto de la Vid y el Vino de Castilla- La Mancha 1/47

1.- INTRODUCCIÓN En los últimos años, la industria enológica ha sufrido una importante transformación, convirtiéndose en un sector en constante innovación y con importantes inversiones. Este hecho ha propiciado un interés creciente por la mejora del proceso de vinificación, no sólo en lo que a infraestructuras se refiere, sino también en lo referido al proceso de fermentación, siendo cada vez más frecuente la utilización de cultivos iniciadores comerciales para favorecer el inicio tanto de la fermentación alcohólica como de la fermentación maloláctica. La fermentación maloláctica es un proceso en el que se ha descrito la participación de diferentes especies de bacterias, siendo Oenococcus oeni la especie identificada con mayor frecuencia debido, entre otras razones, a su mayor tolerancia a las condiciones adversas que, desde el punto de vista del crecimiento microbiano, posee el vino (Lonvaud-Funel, 1999), motivo por el que los cultivos iniciadores comerciales suelen estar constituidos por cepas de esta especie. Sin embargo, la inducción de la fermentación maloláctica mediante la inoculación de cepas comerciales de O. oeni no siempre es satisfactoria (Coucheney et al., 2005) y, por ello, algunos autores (Izuagbe et al., 1985; Henick-Kling et al., 1989; Nielsen et al., 1996) recomiendan la utilización de cultivos iniciadores autóctonos, bien adaptados a las condiciones específicas de cada zona o región vitivinícola. Además, la utilización de estos cultivos autóctonos, evitaría la continua perdida de biodiversidad microbiana producida como consecuencia del incremento de la producción industrial a gran escala de cultivos iniciadores comerciales, lo que es motivo de preocupación para diferentes instancias internacionales. La selección de un cultivo iniciador es una complicada tarea que requiere de un estudio de la biodiversidad y de la caracterización genética y tecnológica de la microbiota presente en el proceso espontáneo, lo que permitirá seleccionar las cepas que presenten las mejores propiedades. Una vez seleccionadas, será necesario llevar a cabo un estudio de implantación, tanto a escala de laboratorio 2/47

como a escala industrial, para conocer su comportamiento en condiciones reales y confirmar así la idoneidad de las mismas como cultivos iniciadores. La utilización de técnicas con suficiente capacidad de diferenciación intraespecífica, exactas y reproducibles, será por tanto un requisito en esa primera etapa de caracterización genética ya que es bien conocido que las características tecnológicas tienen un carácter dependiente de cepa (Zapparoli et al., 2000; Gómez-Alegría et al., 2004; Coucheney et al., 2005). En los últimos años son numerosos los trabajos publicados que describen la utilización de técnicas moleculares (ribotipaje, análisis de los fragmentos de restricción del DNA mediante electroforesis en campo pulsante, análisis de poliformismo de ADN, etc.) para el estudio de la diversidad genética de especies de los géneros Leuconostoc (Ennahar et al., 2003; Barrangou et al., 2002), Lactococcus (Blaiotta et al., 2002) y Lactobacillus (Heiling et al., 2002; Sánchez et al., 2004) de distinta procedencia y para el estudio de la dinámica de la población de bacterias lácticas en algunos alimentos fermentados (Randazzo et al., 2002; Rudi et al., 2002; Meroth, et al., 2003; Giraffa, 2004; Puig y Olmos, 2004). Los autores (De Angelis et al., 2001; Vincent et al., 1998; Sánchez et al., 2004; Reguant y Bordons, 2003) coinciden en afirmar que las técnicas basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR, como la PCR-RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), o la multiplex-rapd, que utiliza mas de un cebador simultáneamente en la reacción de PCR, son las mas útiles, por su rapidez, poder discriminante y reproducibilidad. Otras como la PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) a pesar de ser metodológicamente más complicadas, poseen mayor poder discriminante (Zapparoli et al., 2000; Chu, 1990; Grothues y Tümmler, 1991; Lortal et al., 1997; Tynkkynen et al., 1999; Blaiotta et al., 2001). También se ha descrito que la utilización en la RAPD de distintos cebadores y el análisis combinado de los perfiles obtenidos con los mismos, permite aumentar la capacidad discriminante de esta técnica (Farber y Addison, 1994; Zapparoli et al., 2000; Sánchez et al., 2004), lo que resulta de gran interés especialmente cuando se trata de caracterizar cepas de una especie como O. oeni, predominante en la fermentación maloláctica, y que ha sido descrito como genómica y 3/47

filogenéticamente homogénea (Farrow et al., 1989; Dicks et al., 1990; Zavaleta et al., 1996; Le Jeune and Lonvaud-Funel, 1997). Respecto de la idoneidad de la RAPD-PCR para la caracterización molecular de las cepas de Oenococcus oeni, existe una gran diversidad de opiniones y así mientras Zapparoli et al. (2000) indican que esta no es la mejor técnica, porque la reproducibilidad de los perfiles de polimorfismo es escasa, Guerrini et al. (2003) describen su utilización para la caracterización genética de cepas de O. oeni obtenidas de vinos italianos, obteniendo buenos resultados. Otra de las técnicas basadas en la reacción de PCR, cuya utilización para la caracterización molecular de cepas de O. oeni ha sido descrita recientemente (Lechiancole et al., 2006), es la Differential Display PCR (DD-PCR), técnica que había sido utilizada para la identificación de genes expresados de manera diferencial, y que permite una detección sensible, rápida y precisa de eventuales modificaciones en el patrón de expresión génica. Los objetivos de este proyecto fueron: La caracterización molecular de los aislados de bacterias lácticas procedentes de la fermentación maloláctica espontánea de vinos tintos de la variedad Tempranillo elaborados en bodegas de Castilla-La Mancha en dos vendimias consecutivas. El estudio de la diversidad genética de las especies de bacterias lácticas presentes en distintas bodegas, para conocer el carácter endémico o cosmopolita de las cepas. La creación de un banco de cepas de bacterias lácticas autóctonas potencialmente utilizables en procesos industriales. 4/47

2.- PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS El plan de trabajo previsto fue: 1) Toma de muestras 2) Análisis físico-químico y microbiológico de las muestras. 3) Obtención y purificación de aislados de bacterias lácticas. 4) Caracterización molecular de los aislados obtenidos en la etapa anterior. 5) Identificación de los aislados. 6) Estudio de la microbiota bacteriana mediante un método independiente de cultivo (DGGE-PCR). Desarrollo de las actividades: 1) Toma de muestras Durante las vendimias de los años 2006 y 2007 se tomaron muestras de vino de la variedad Cencibel en 6 bodegas situadas en cuatro provincias (Ciudad Real, Albacete, Toledo y Cuenca) de Castilla-La Mancha (Figura 1). E-Casarrubios del Monte E-Pozoamargo D-Noblejas B-Tomelloso A- Villarrobledo C-Villarrubia de los Ojos Figura 1.- Mapa de las bodegas muestreadas 5/47

El criterio utilizado para la selección de las mismas fue su situación geográfica y el que nunca con anterioridad hubieran utilizado cultivos iniciadores para la fermentación maloláctica (FML). Las muestras fueron tomadas en tres etapas del proceso, al final de la fermentación alcohólica (T0) y cuando se había degradado en torno al 50 y al 90% del contenido inicial de ácido málico (T1 y T2, respectivamente). En cada bodega se muestrearon dos elaboraciones tomándose en cada caso dos muestras, una para el análisis físico-químico y otra para el análisis microbiológico. 2) Análisis de las muestras 2.1) Análisis microbiológico Las muestras, convenientemente diluidas, fueron sembradas en placas de agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe) y de agar MLO (Oenococcus oenos medium) suplementado con jugo de tomate, azida de sodio y cicloheximida, medios adecuados para el crecimiento de las bacterias lácticas. Las placas se incubaron en condiciones anaerobias a 30ºC durante 5 días, tras lo cual se efectuaron los correspondientes recuentos. 2.2) Análisis físico-químico Las muestras fueron también analizadas para algunos de los parámetros físico-químicos convencionales: contenido de ácido L- málico y L- láctico, grado alcohólico, ph, acidez total, acidez volátil y contenido de ácido cítrico. Para realizar estas determinaciones se siguieron los métodos oficiales de análisis (OIV, 2004). 3) Obtención y purificación de aislados de bacterias lácticas De las placas utilizadas en los recuentos se tomaron al azar un número de aislados que fueron purificados, por resiembras sucesivas en placas de los mismos medios, y conservados a -80ºC en MRS y glicerol al 20% (v/v), hasta su análisis. 6/47

4) Caracterización molecular de los aislados Se ensayaron tres métodos moleculares: 4.1) Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) Los pasos seguidos fueron: 4.1.1) Preparación de los extractos crudos de ADN y reacciones de PCR El ADN genómico fue extraído a partir de colonias de un tamaño adecuado crecidas en placas de agar MRS, siguiendo el procedimiento descrito por Veyrat et al. (1999) modificado por Sánchez et al. (2004). Se ensayaron dos primers de secuencia arbitraria el M13 (5 - GAGGGTGGCGGTTCT-3) y el M14 (5 -GAGGGTGGGGCCGTT-3 ) en reacciones de amplificación separadas. Cada reacción de PCR contenía: 5 μl de extracto crudo de ADN, 150 pmol de primer, 200 μm de cada dntp (Biotools B&M Labs., Madrid, Spain), 5 μl 10x Taq Mg free Buffer (Biotools; 1x: 75 mm Tris- HCl, ph 9 at 25 ºC; 50 mm KCl; 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 ), 2mM MgCl 2 (Biotools), 2.0 U Taq polymerase (Ultratools DNA Polymerase, Biotools) y agua bidestilada hasta un volumen final de 50 μl. Las reacciones de PCR de realizaron en un termociclador (PTC-100 Thermal Cycler) y las condiciones de amplificación fueron las descritas por Veyrat et al. (1999). En cada grupo de reacciones se incluyó un control negativo. 4.1.2) Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación Muestras de 20 μl de los productos de amplificación fueron sometidas a electroforesis, según el procedimiento descrito por Sánchez et al. (2004). Como marcador de pesos moleculares se utilizó el Lambda DNA (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) digerido con el enzima de restricción PstI (Gibco BRL Life Technologies, Milan, Italy), que contiene 21 fragmentos de ADN de tamaños comprendidos entre 210 y 11.509 pb. 7/47

4.1.3) Lectura y análisis numérico de los perfiles de polimorfismo de ADN (RAPDs) Los geles de agarosa fueron fotografiados con una cámara Polaroid MP-4 Land y película Polaroid 665. Los negativos fueron digitalizados con un scanner Scanject 5300C (Hewlett-Packard Co., Dublin, Ireland) antes de realizar el análisis computerizado. Los perfiles de polimorfismo de ADN fueron digitalizados y analizados con el software informático GelCompar Version 4.0 (Applied-Maths, Kortrijk, Belgium) (Vauterin and Vauterin, 1992). Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson (r), y se realizó un análisis cluster mediante el algoritmo UPGMA (unweighted pair group method with arithmetical average) que permitió la construcción del correspondiente dendrograma de similitud, calculándose el coeficiente de correlación cofenética. Tras el tratamiento de los geles obtenidos con cada uno de los primers, se realizó un análisis combinado con el que se obtuvo un dendrograma consenso. 4.2) Restriction Enzyme Analysis-Pulsed Field Gel Electrophoresis (REA- PFGE) Los pasos seguidos fueron: 4.2.1) Preparación del ADN genómico Para la obtención del ADN genómico de alto peso molecular se siguió el procedimiento descrito por Sánchez et al. (2004) con ciertas modificaciones. 10 ml del cultivo en caldo MLO fueron centrifugados (4.000 rpm, 10 min, 4ºC) en tubos falcon y los pellets resuspendidos en 10 ml de TE 1 [12 g/l Tris(hidroximetil)aminometano, 4 g/l EDTA, ph 8]. Los tubos fueron centrifugados de nuevo en las mismas condiciones anteriores y los pellets fueron resuspendidos en 1 ml de T100E [1,21 g/l Tris(hidroximetil)aminometano, 37,22 g/l EDTA, ph 7,5]. A estas suspensiones celulares se les añadió un volumen igual de agarosa de alta pureza (Agarose, Low Melting Point; Sigma-Aldrich, 8/47

Madrid, España) preparada al 2% (p/v) en TE 1 y mantenida a 45ºC. La mezcla se descargó en los pocillos (10 x 5 x 1,5 mm) de un molde que seguidamente fue introducido en un refrigerador a 4ºC durante 15-20 minutos o hasta que solidificara. De este modo, las células bacterianas quedaban inmovilizadas en la agarosa, formando los denominados insertos. Las células inmovilizadas fueron sometidas a un tratamiento de lisis in situ. Para ello, los insertos se introdujeron en tubos estériles y se cubrieron con la solución de lisis [3 ml de T100E, 0,7 mg/ml de lisozima (Sigma-Aldrich)], incubándose a 37ºC durante 4 horas. Seguidamente, se sumergieron en 3 ml de TESP [1,2 g/l Tris(hidroximetil)aminometano, 167,5 g/l EDTA, 10 g/l Sarcosyl, ph 8,1] con 100 mg/ml de pronasa (Protease Tipe XIV Bacterial From Streptomyces Griseus; Sigma-Aldrich) incubándose a 37ºC durante 24 horas. Finalizada la incubación, se inactivaba la pronasa mediante sucesivos lavados con tampón TE 1. Los insertos se almacenaban en condiciones de esterilidad, sumergidos en dicho tampón y en refrigeración, hasta su digestión. 4.2.2) Digestión del ADN Porciones de 1-2 mm de los insertos fueron digeridas con 30 U de ApaI (Roche, Penzberg, Alemania) o 30 U de SfiI (New England BioLabs), incubándose durante 4 horas en baño seco a 28ºC o 50ºC, respectivamente. Algunos autores (Zapparoli et al., 2000; Lechiancole et al., 2006) han descrito que estos enzimas proporcionan perfiles con características adecuadas para la discriminación de cepas de O. oeni, motivo por el que se seleccionaron para este estudio. Tras la digestión, los insertos se lavaron con tampón TE 1 durante 30 minutos. 4.2.3) Electroforesis de campo pulsado Para la separación de los fragmentos de restricción, los insertos se introducían directamente en los pocillos de un gel de agarosa (Bio-Rad), al 1% (p/v) en tampón TBE 0,25, sellándolos con la misma agarosa. 9/47

La electroforesis de los fragmentos de restricción se realizó en un equipo CHEF-DRIII (Bio-Rad) a 14ºC y un voltaje constante de 6 V/cm. Los fragmentos de restricción obtenidos con el enzima ApaI fueron separados mediante la aplicación de tres pasos: 6 h con un tiempo de pulso de 3 a 5 s, 6 h con un tiempo de pulso de 2 a 3 s y 5 h con un tiempo de pulso de 0,5 a 1 s, incrementados de forma lineal. Para separar los fragmentos de restricción obtenidos con el enzima SfiI se utilizó un único paso de 21 h con un tiempo de pulso de 1 a 50 s, incrementado de forma lineal. 4.2.4) Lectura y análisis numérico de los perfiles de macrorrestricción Los geles fueron teñidos con una solución de bromuro de etidio al 0,05% (p/v) en agua y decolorados con agua destilada hasta que las bandas aparecían nítidas. Se visualizaron en un transiluminador ultravioleta (UV) (Vilber Lourmat) a 254 nm y sus imágenes eran recogidas con un sistema digital de captación de imágenes (DC 290 Zoom, KODAK). Para la normalización de los geles, en cada uno de los extremos del gel, se cargaba el marcador de peso molecular Low Range PFG Marker (New England BioLabs) que contiene 10 fragmentos de ADN, de tamaños comprendidos entre 2,03 y 194,0 kb. 4.3) Differential Display- Polymerase Chain Reaction (DD-PCR) Los pasos seguidos fueron: 4.3.1) Preparación del ARN La extracción del ARN se realizó a partir de 5 ml del cultivo en caldo MLO, según el procedimiento descrito por Lechiancole et al. (2006), utilizando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Barcelona, España). La calidad de las muestras de ARN fue verificada en geles de agarosa al 1,2% (p/v), y la concentración se determinó mediante la medida de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro Beckman DU-530. 4.3.2) Transcripción inversa de ARNm a ADNc 10/47

Un volumen adecuado de la muestra de ARN que contenía 6 µg de ARN, fue tratado con DNAsaI libre de RNAsa (Roche) (2 U/µg ARN) durante 30 minutos a 37ºC, en presencia de RNAsin (4 U/µg) (Promega, Madison, USA) y DDT 0,1M (Invitrogen, Barcelona, España), en un volumen final de 10 µl, incubándose a 95 ºC durante 3 minutos. Seguidamente se añadían 200 U/µL de transcriptasa inversa (M-MLV Reverse Transcriptase; Invitrogen), 0,5 mm de hexanucleótidos sintéticos degenerados p(dn) 6 (Roche) y el resto de componentes del tratamiento previo con la DNAsaI, en un volumen final de 20 µl. La mezcla se incubaba a 37 ºC durante 1 hora tras lo cual se calentaba a 95ºC durante 3 minutos para inactivar la transcriptasa inversa. 4.3.3) Amplificación del ADN 15 µl del ADNc fueron utilizados como molde para la amplificación. Las cantidades de los componentes de la mezcla de reacción fueron las descritas para la RAPD-PCR, adaptadas a un volumen final de 50 µl. Se empleó el cebador M13 y las condiciones de amplificación fueron también las descritas para la RAPD-PCR. 4.3.4) Electroforesis en geles de agarosa de los productos de amplificación La separación y visualización de los productos de amplificación se realizó del mismo modo que se ha descrito para la RAPD-PCR. 4.4) Estudio de reproducibilidad Para las tres técnicas descritas anteriormente se realizó el correspondiente estudio de reproducibilidad seguiendo el procedimiento descrito por Sánchez et al. (2004). Se utilizaron seis aislados elegidos al azar con los que, por duplicado, se realizó todo el procedimiento descrito anteriormente para cada uno de los métodos de caracterización. De cada uno de los aislados se prepararon 4 cultivos en placas de agar MRS. Los productos de amplificación o de restricción obtenidos fueron separados 2 a 2 en geles diferentes para determinar así la reproducibilidad entre geles. 11/47

El análisis numérico, siguiendo el procedimiento indicado anteriormente, de los patrones de amplificación y/o de restricción obtenidos para cada uno de los aislados y para cada replicado, permitió calcular el valor del coeficiente de similaridad (r) o umbral de discriminación por debajo del cual los perfiles fueron considerados diferentes. 5) Identificación de los aislados Aislados representativos de cada uno de los genotipos obtenidos en el estudio de caracterización genética fueron analizados mediante la técnica 16S- ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) (Rodas et al., 2003) comparando los perfiles obtenidos con los correspondientes a algunas cepas de referencia. Los aislados que no fueron identificados por este procedimiento fueron analizados fenotípicamente utilizando tiras API 50 CH (API System, BioMérieux, Montalieu Vercie, France) y el sistema de identificación microbiana APILAB Plus (Version 4.0, BioMérieux). 6) Estudio de la microbiota bacteriana utilizando un método independiente de cultivo: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE-PCR) Los pasos seguidos fueron: 6.1) Extracción de ADN La extracción del ADN se realizó a partir de 1 ml de las muestras de vino, utilizando un kit comercial (DNeasy Blood & Tissue) de Izasa (Madrid, España). 6.2) Amplificación del gen 16S ARNr Se llevo a cabo utilizando los primers y las condiciones descritas por Pérez Pulido et al. (2005). 6.3) Electroforesis en geles de poliacrilamida utilizando un gradiente de urea Biorad. 10 µl del amplificado fueron separados utilizando el equipo DGGE de 6.4) Secuenciación y clonaje de las bandas 12/47

Las bandas observadas en los geles de poliacrilamida fueron eluidas y enviadas a secuenciar y posteriormente sus secuencias fueron comparadas con las existentes en las bases de datos, lo que permitió su asignación a una especie determinada. 13/47

3. RESULTADOS OBTENIDOS Los resultados de los análisis físico-químicos efectuados a los vinos (Tabla 1) fueron los habituales para un vino de la variedad Cencibel, pudiendo quizás destacarse el elevado grado alcohólico de algunas de las muestras, por su posible influencia en el crecimiento de las bacterias lácticas. Tabla 1.- Resultados de los análisis físico-químicos efectuados a las muestras procedentes de las 6 bodegas. Bodega A B C 1 2 1 2 1 2 Elaboración a b a b a b a b a b a b Alcohol (% v/v) 13,12 13,22 13,85 14,43 13,84 14,10 ph 3,47 3,84 3,56 3,90 3,56 3,96 3,56 3,67 3,88 4,03 3,71 3,75 Ác. L-málico (g/l) 2,16 0,00 2,20 0,00 2,31 0,22 2,20 0,21 1,78 0,17 1,27 0,24 Äc. L-láctico (g/l) 0,19 1,46 0,33 1,96 0,21 1,70 0,22 1,60 0,44 1,77 0,76 1,35 Acidez volátil (g/l) 0,21 0,29 0,22 0,37 0,30 0,44 0,34 0,37 0,45 0,52 0,43 0,53 Ácido cítrico (g/l) 0,09 0,00 0,33 0,00 0,22 0,00 0,28 0,26 0,26 0,00 0,24 0,00 Bodega D E F 1 2 1 2 1 2 Elaboración a b a b a b a b a b a b Alcohol (% v/v) 13,25 13,15 12,94 13,21 13,99 14,02 ph 3,56 4,00 3,74 3,99 3,47 3,81 3,49 3,89 3,75 4,07 3,74 4,08 Ác. L-málico (g/l) 2,22 0,15 2,21 0,22 1,88 0,26 1,54 0,27 2,42 0,19 2,31 0,18 Äc. L-láctico (g/l) 0,11 1,69 0,65 1,63 0,37 1,79 0,31 1,80 0,48 1,96 0,32 1,86 Acidez volátil (g/l) 0,18 0,28 0,20 0,43 0,28 0,48 0,32 0,38 0,25 0,52 0,35 0,52 Ácido cítrico (g/l) 0,32 0,16 0,31 0,00 0,35 0,08 0,36 0,22 0,38 0,00 0,21 0,00 a= Fin FA; b= Fin FML 14/47

La evolución seguida por algunos de los parámetros analizados fue la esperada. Se observa una casi total desaparición del ácido málico y su transformación en ácido láctico, lo que ocasiona una disminución de la acidez total (datos no mostrados) y el aumento del ph. Paralelamente ocurren otros cambios como el aumento de la acidez volátil y la disminución del contenido en acido cítrico. Los recuentos obtenidos en las placas de las muestras de las diferentes bodegas (Tabla 2) fueron similares entre sí, con valores que oscilaron entre las 10 2 y las 10 6 ufc/ml al inicio de la FML, valores que se incrementaban hasta las 10 5-10 7 ufc/ml al final del proceso. Estos valores fueron similares a los descritos por otros autores (Ribéreau-Gayon et al., 1998; Lonvaud-Funel, 1999). La duración del proceso fue por el contrario más variable con valores que oscilaron entre los 7 y los 37 días. Tabla 2.- Recuentos de bacterias lácticas obtenidos en la placas de agar MLO en las distintas etapas de la FML. Bodegas Elaboración Duración FML Recuentos (ufc/ml) Etapas 0 1 2 No. de aislados A 1 14 1.87x10 4 3.70x10 6 1.61x10 7 35 2 7 9.80x10 5 6.60x10 6 3.12x10 7 32 B 1 15 2.20x10 4 2.90x10 6 1.96x10 7 39 2 37 1.60x10 2 2.45x10 5 1.80x10 7 31 C 1 11 2.07x10 6 9.00x10 6 1.42x10 7 20 2 8 1.36x10 5 1.65x10 7 2.36x10 6 24 D 1 20 6.10x10 2 4.45x10 5 4.28x10 6 36 2 19 4.02x10 5 1.69x10 6 2.00x10 7 24 E 1 17 8.50x10 2 3.60x10 5 4.32x10 5 15 2 17 6.26x10 3 5.15x10 6 1.52x10 5 26 F 1 15 8.38x10 4 1.10x10 6 1.71x10 6 27 2 12 3.30x10 6 2.47x10 7 1.69x10 6 30 15/47

De las placas utilizadas en los recuentos, se tomaron al azar 339 aislados (Tabla 2) que fueron purificados por resiembras sucesivas en placas del mismo medio y mantenidos a -80ºC hasta su análisis. Seguidamente, y antes de realizar la caracterización genética de los aislados de todas las bodegas, se realizó un estudio previo con los aislados de la bodega D, en el que se ensayaron diferentes técnicas moleculares, la RAPD- PCR, la REA-PFGE y la DD-PCR, a fin de seleccionar aquella con mayor capacidad discriminante, habida cuenta que en la bibliografia consultada se habían encontrado importantes discrepancias respecto a la utilidad de las mismas en el genotipado de cepas de bacterias lácticas. Este estudio se inicio con las técnicas RAPD-PCR y REA-PFGE, realizándose una revisión bibliográfica para seleccionar las condiciones de trabajo utilizadas con mas frecuencia por los diferentes autores. Para la RAPD- PCR se seleccionaron los cebadores M13 (5 -GAGGGTGGCGGTTCT-3) y M14 (5 -GAGGGTGGGGCCG TT-3 ) y para la REA-PFGE se seleccionaron los enzimas de restricción ApaI (Roche, Penzberg, Germany) y SfiI (New England BioLabs). En ambos casos se realizaron los correspondientes estudios de reproducibilidad, lo que permitió calcular los valores del coeficiente de similaridad (r), para ambas técnicas que fueron del 82% para la RAPD-PCR y del 83% para la REA-PFGE. El análisis cluster de los perfiles RAPD-PCR de los 60 aislados de la bodega D usando el cebador M13 permitió obtener el dendrograma de la Figura 2, en el que, para un valor del coeficiente de similaridad del 82%, se observan 20 genotipos o clusters (R1 R20). Ocho de estos clusters agrupaban a más de un aislado mientras que los 12 restantes correspondían a aislados con un perfil único. 16/47

Similaridad (%) Genotipo/nº de aislados Figura 2.- Dendrograma de similitud obtenido en el análisis cluster de los perfiles RAPD-PCR obtenidos con el cebador M13. Cuando los mismos aislados fueron analizados con el cebador M14, se obtuvieron un menor número de genotipos (datos no mostrados). La Figura 3 muestra los geles obtenidos para algunos aislados con ambos cebadores, pudiendo observarse que el cebador M14 no permitía la diferenciación de los aislados analizados. 17/47

A 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 B 1031 500 300 1031 500 300 Figura 3.- Perfiles RAPD-PCR obtenidos con los cebadores M13 (A) y M14 (B). Líneas 1 (A y B): marcador de peso molecular (100 bp ladder; Biotools). El análisis REA-PFGE con los enzimas ApaI y SfiI (Figura 4) mostró que el enzima ApaI posee una mayor capacidad de discriminación que el SfiI por lo que se utilizó este enzima para el análisis de los restantes aislados de la bodega D. A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B 1 2 3 4 5 6 7 194,0 194,0 97,0 97,0 48,5 48,5 9,42 9,42 Figura 4.- Perfiles de macrorrestricción obtenidos con los enzimas ApaI (A) y SfiI (B). Líneas 1 (A y B): marcador de peso molecular (Low Range PFG Marker, New England BioLabs). 18/47

El análisis cluster de los perfiles de macrorrestricción de todos los aislados de la bodega D con el enzima ApaI permitió obtener el dendrograma de la Figura 5, en el que puede observarse que el número de genotipos obtenido (10) fue muy inferior al obtenido con la RAPD-PCR y el cebador M13. Similaridad (%) Genotipo/nº de aislados Figura 5.- Dendrograma de similitud obtenido en el análisis cluster de los perfiles de macrorrestricción obtenidos con el enzima ApaI. Para confirmar estos resultados, se amplió el ensayo preliminar a los aislados de la bodega B, obteniéndose resultados similares (datos no mostrados). Pudo así concluirse que, si bien ambas técnicas son adecuadas para el genotipado de aislados de bacterias lácticas, la RAPD-PCR con el cebador M13 permite alcanzar un mayor grado de discriminación intraespecífica. Cuando los resultados obtenidos por RAPD-PCR, utilizando el cebador M13, y aquellos del análisis REA-PFGE, utilizando el enzima ApaI, para los aislados de la bodega D, fueron analizados conjuntamente, se obtuvo el 19/47

dendrograma consenso de la Figura 6, en el que se observa un mayor numero de clusters y un aumento considerable de la capacidad de discriminación, hecho que ya había sido descrito por otros autores (Ercolini et al., 2001; Sánchez et al., 2004; Aquilanti et al., 2006; Valmorri et al., 2006). No obstante la dificultad que suponía la realización de un análisis combinado, dado el elevado número de aislados que debían ser analizados, hizo que nos decantáramos por la utilización de la RAPD-PCR con el cebador M13. Similaridad (%) 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Genotipo/nº de aislados C1/2 C2/1 C3/1 C4/2 C5/1 C6/1 C7/1 C8/4 C9/1 C10/4 C11/4 C12/5 C13/1 C14/4 C15/1 C16/2 C17/2 C18/1 C19/1 C20/2 C21/1 C22/1 C23/2 C24/4 C25/1 C26/4 C27/1 C28/1 C29/1 C30/1 C31/2 82% Figura 6.- Dendrograma consenso para los aislados de la bodega D obtenido tras el análisis combinado de los perfiles M13 RAPD-PCR y ApaI PFGE. 20/47

La siguiente técnica ensayada fue la DD-PCR con la que en el estudio de reproducibilidad se obtuvo un valor del coeficiente de similaridad (r) de tan solo un 23%, lo que a nuestro entender invalidaba esta técnica para el objetivo que nos proponíamos. El bajo valor del coeficiente de similaridad obtenido, a pesar de haber reproducido de forma rigurosa las condiciones en los ensayos, hace pensar que es una técnica que se ve afectada por numerosas variables, siendo además sensible a cualquier pequeño cambio. La Figura 7 muestra a modo de ejemplo, un gel con los perfiles obtenidos para los mismos aislados en el estudio de reproducibilidad y el dendrograma obtenido en el mismo. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1031 500 300 23% Figura 7.- Perfiles obtenidos en el estudio de reproducibilidad de la DD-PCR y el dendrograma correspondiente. Los resultados del estudio preliminar nos permitieron por lo tanto concluir que la RAPD-PCR era una técnica adecuada tanto por su capacidad de discriminación intraespecífica, como por su sencillez metodológica, siendo por tanto la elegida para la caracterización genética de los aislados de las restantes 21/47

bodegas. Estos resultados fueron recogidos en un artículo publicado en la revista Food Microbiol. 25, 942-948 (2008). La Tabla 3 muestra el número de genotipos obtenidos para cada una de las bodegas tras el análisis RAPD-PCR con el cebador M13, de los 339 aislados obtenidos en las muestras de la primera vendimia. Tabla 3.- Número de aislados y de genotipos obtenidos para cada una de las bodegas. Bodega Elaboración No. aislados No. genotipos A 1 35 28 2 32 B 1 39 21 2 31 C 1 20 10 2 24 D 1 36 20 2 24 E 1 15 12 2 26 F 1 27 14 2 30 Tras el genotipado de los aislados se abordó su identificación utilizando la técnica 16S-ARDRA para lo que se tomaron representantes de cada uno de los genotipos obtenidos en la caracterización genética. Los perfiles obtenidos eran comparados con aquellos correspondientes a algunas cepas de referencia lo que permitió identificar a 313 de ellos como pertenecientes a la especie O. oeni. La Figura 8 muestra los perfiles obtenidos para algunos de los aislados. Puede observarse que los perfiles de las carreras 2 y 4-14 son idénticas y corresponden a aislados pertenecientes a la especie O. oeni, mientras que el perfile de la carrera 3 corresponde a un aislado no-oenococcus. 22/47

bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1031 500 200 Figura 8.- Perfiles 16S-ARDRA de aislados procedentes de distintas bodegas Los 26 aislados que no pudieron ser identificadas por 16S-ARDRA fueron analizados con tiras API 50CHL, lo que permitió identificarlos como pertenecientes a las especies L. casei, L. plantarum, L. hilgardii y Ln. mesenteroides. La Figura 9 muestra el porcentaje de especies no-oenococcus presentes en cada una de las bodegas. 12 10 Ocurrence of the different species (%) 8 6 4 L. casei L. plantarum L. hilgardii Lc. mesenteroides 2 0 A B C D E F Cellar Figura 9.- Porcentaje de especies no-oenococcus presentes en cada bodega 23/47

Coincidiendo con lo descrito por Renouf et al. (2006 y 2007) la mayor diversidad de especies se observó en las muestras tomadas al final de la fermentación alcohólica, siendo O. oeni la especie dominante al avanzar la fermentación maloláctica. La presencia de estas especies minoritarias ha sido descrita por otros autores (Edwards et al., 1993; Ribéreau-Gayon et al., 2000b; du Plessis et al., 2004), y es bien conocido que su viabilidad disminuye significativamente según avanza la fermentación, como consecuencia de los cambios químicos que tienen lugar. La contribución de estas especies en las características sensoriales del vino también ha sido puesta de manifiesto por diferentes autores (du Plessis et al., 2004; Bartowsky, 2009). Seguidamente, y para conocer si existían genotipos coincidentes en las diferentes bodegas, realizamos un análisis cluster de los perfiles RAPD-PCR de los 313 aislados de todas las bodega identificados como O. oeni, del que se obtuvo el dendrograma consenso de la Figura 10. A un valor del coeficiente de similitud del 83%, puede observarse la presencia de 63 clusters, 33 de los cuales agrupaban 3 ó mas aislados. Once de estos genotipos agrupaban aislados de 2 ó más bodegas, destacando el genotipo 31 que agrupó un mayor número de aislados, procedentes de todas las bodegas y el genotipo 30 que agrupó aislados de todas las bodegas excepto la bodega F. Es importante destacar que algunos aislados de diferentes bodegas agrupados en un mismo genotipo, presentaron un elevado porcentaje de similitud, como por ejemplo aquellos de las bodegas B y C agrupados en el genotipo 50, que mostraron un porcentaje de similitud del 98,3% (datos no mostrados). 24/47

Figura 10.- Dendrograma consenso de los perfiles RAPD-PCR de los aislados O. oeni de todas las bodegas. La Figura 11 muestra la frecuencia de aislamiento de los 33 genotipos principales de O. oeni en cada una da las bodegas, en cada etapa de la FML, y en cada una de las elaboraciones. Puede observarse que la FML está realmente dirigida por un pequeño número de genotipos, a pesar de que en algunos momentos de la misma pueda observarse una considerable diversidad. El genotipo 31 fue uno de los genotipos predominantes en las bodegas A, B, E y F donde estuvo presente en todas las etapas de ambas elaboraciones, con la excepción de la etapa 1 de la primera elaboración y de la etapa 2 de la 25/47

segunda elaboración en la bodega A y de la segunda etapa de la segunda elaboración de la bodega B. Figura 11.- Frecuencia de aislamiento (%) de los 33 genotipos principales de O. oeni. Los resultados de este estudio permitieron confirmar que la RAPD-PCR es una herramienta adecuada para la caracterización genética de aislados O. oeni 26/47

procedentes de muestras de la misma región y han puesto de manifiesto que 1) cuando las condiciones de elaboración son similares, la composición de la microbiota presente es, esencialmente, la misma (Sánchez et al., 2004), 2) la coexistencia de numerosas cepas de O. oeni durante la fermentación maloláctica y 3) la existencia de genotipos coincidentes en las muestras procedentes de bodegas situadas en diferentes provincias de la región, lo que sugiere una distribución geográfica de las cepas de O. oeni que crecen espontáneamente en el vino y confirma la existencia de una microbiota bien adaptada no sólo a las condiciones de elaboración utilizadas en la bodega, sino también a las condiciones ecológicas de esta región. Estos resultados han sido recogidos en una publicación en la revista Journal of Bioscience and Bioengineering vol. 108, 220-224 (2009). Finalizado el análisis de las muestras de la primera vendimia, se procedió al análisis de aquellas de la segunda vendimia. Es necesario indicar que en esta ocasión sólo fue posible muestrear 5 bodegas porque en una de ellas finalizó el proceso antes de que pudiéramos efectuar el muestreo. Los resultados de los análisis físico-químicos y microbiológicos efectuados a los vinos fueron similares a los obtenidos en las muestras de la vendimia anterior. La Tabla 4 muestra los recuentos obtenidos en las diferentes muestras así como el número de aislados obtenidos en cada caso. Tabla 4.- Recuentos y número de aislados obtenidos de las placas de agar MLO sembradas con las muestras tomadas en la vendimia del 2007. 27/47

Winery Batch MLF duration (days) Stages No. of isolates No. of genotypes 0 1 2 A I 14 7.90x10 2 7.50x10 6 1.56x10 7 36 II 12 9.70x10 2 1.71x10 6 2.60x10 7 36 B I 10 4.10x10 3 2.77x10 6 4.80x10 7 36 II 8 1.58x10 4 1.25x10 7 1.49x10 7 35 C I 15 1.00x10 4 3.90x10 6 1.55x10 7 36 II 11 2.97x10 6 6.30x10 6 1.68x10 7 36 D I 24 3.80x10 3 2.17x10 5 6.38x10 7 34 II 21 1.30x10 3 1.70x10 6 4.96x10 6 36 E I 10 9.96x10 3 5.45x10 6 2.66x10 7 36 II 24 2.75x10 3 8.20x10 6 6.05x10 6 34 29 6 43 16 13 Total 355 107 La caracterización genética de los 355 aislados obtenidos, utilizando la técnica RAPD-PCR con el cebador M13, puso de manifiesto la existencia de 107 genotipos, cuya identificación molecular mediante 16S-ARDRA permitió asignar el 94,1% de ellos a la especie O. oeni. En esta ocasión sólo 21 de los aislados fueron no-oenococcus y pudieron ser identificados mediante tiras API 50 CHL, como pertenecientes a las especies L. plantarum y Leuconostoc mesenteroides. La Figura 12 muestra la frecuencia de aislamiento de estas especies en las diferentes bodegas, pudiendo destacarse la menor diversidad de especies observada en las muestras de esta vendimia. Al igual que sucedió con las muestras de la vendimia del 2006 los aislados no-oenococcus procedían de las muestras tomadas en la etapas T0 y T1, es decir final de la fermentación alcohólica e inicio de la fermentación maloláctica. 28/47

Ocurrence of the different species (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 A B C D E Cellar L. plantarum Lc. mesenteroides Figura 12.- Porcentaje de especies no-oenococcus presentes en cada bodega Cuando analizamos de forma conjunta y para cada una de las bodegas, los perfiles RAPD-PCR de los aislados obtenidos en ambas vendimias, se observó que, en general, los aislados de cada vendimia se agrupaban de forma separada, aunque en todas las bodegas se encontró algún genotipo que agrupaba aislados procedentes de ambas vendimias a un elevado valor de similitud. La Figura 13 muestra a modo de ejemplo lo ocurrido con los aislados de la bodega C, y puede observarse que los genotipos 7, 8 y 10 agrupan aislados de ambas vendimias, indicados como C y 2/C, a un elevado porcentaje de similitud. Similaridad (%) 29/47

Figura 13.- Dendrograma de similitud de los aislados de la bodega C procedentes de ambas vendimias. La Figura 14 muestra la frecuencia de aislamiento de los diferentes genotipos de la especie O. oeni en cada una de las etapas de cada una de las vendimias en todas las bodegas. En todas las bodegas se observó la presencia de genotipos coincidentes en ambas vendimias, aunque no aparecieran en todas las etapas y aunque aparecieran en distinta proporción. 30/47

Vendimia 2006 Vendimia 2007 Vendimia 2006 Vendimia 2007 Vendimia 2006 Vendimia 2007 Vendimia 2006 Vendimia 2007 Vendimia 2006 Vendimia 2007 Figura 14.- Genotipos de O. oeni presentes en cada etapa de la FML y en ambas vendimias de cada bodega. Seguidamente realizamos el análisis clusters de los perfiles RAPD-PCR de los aislados identificados como pertenecientes a la especie O. oeni, procedentes 31/47

de todas las bodegas y de ambas vendimias, y obtuvimos un gran dendrograma con 60 perfiles diferentes (datos no mostrados) en el que 21 de ellos incluían aislados de diferentes bodegas. La Tabla 5 muestra los genotipos O. oeni participantes en cada vendimia y en cada bodega así como la frecuencia de aparición de los mismos, calculada como el número de aislados de cada genotipo dividido por el número total de aislados, expresado como porcentaje. Tabla 5.- Genotipos O. oeni participantes en cada bodega y en cada vendimia y su frecuencia (%) de aparición. 32/47

El número de genotipos presentes en cada bodega varió entre 8 y 22. En las bodegas A, B y C se observaron importantes diferencias en el número de genotipos participantes en cada vendimia, indicando que existe una considerable diversidad genética. En todas las bodegas se encontró un pequeño número de genotipos que podrían ser considerados predominantes y un elevado número de genotipos cuya 33/47

presencia fue inferior al 10%. También se observó un pequeño número de genotipos que estuvieron presentes en ambas vendimias y cuya frecuencia de participación varió de año a año. Los genotipos XVII, XVIII y XXIII estuvieron presentes en al menos una vendimia en cada bodega. El genotipo XVII fue el dominante en ambas vendimias en la bodega A y en las vendimias del 2006 y del 2007 en las bodegas B y E, respectivamente. En las bodegas C y D, este genotipo estuvo presente en forma minoritaria y no en ambas vendimias. El genotipo XVIII estuvo presente en una baja frecuencia excepto en la vendimia del 2006 en la bodega E donde fue dominante. Cuando realizamos una comparación de los genotipos presentes en cada bodega, se observó que las bodegas A, B y C compartían un mayor número de genotipos, a pesar de estar localizadas en diferentes provincias. Las bodegas A- B y A-C compartían 9 genotipos mientras que las bodegas B y C compartían 8 de ellos. Sólo 3 genotipos fueron coincidentes en las 3 bodegas. La Figura 15 muestra la frecuencia de aislamiento de los 21 genotipos O. oeni que agrupaban aislados de las diferentes bodegas. Aunque con algunas excepciones, los genotipos predominantes aparecían en las diferentes etapas de la FML y en ambas vendimias, en todas las bodegas. Como indicábamos anteriormente, el genotipo XVII fue uno de los genotipos predominantes y estuvo presente en todas las etapas de ambas vendimias, aunque en un porcentaje inferior al 10% en algunos casos, con la excepción de la etapa 0 en la vendimia del 2007 en la bodega A. 34/47

Winery A Winery B 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 1 2 0 1 2 0 0 1 2 0 1 2 Stage Stage Stage Stage 2006 vintage 2007 vintage 2006 vintage 2007 vintage Winery C Winery D 120 100 80 60 40 20 0 20 00 80 60 40 20 0 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 Stage Stage Stage Stage 2006 vintage 2007 vintage 2006 vintage 2007 vintage Winery E Genotypes 0 1 2 0 1 2 Stage Stage 2006 vintage 2007 vintage 120 100 80 60 40 20 VII XI XIII XIV XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXVI XXVII XXIX XXXVI XXXVII XXXVIII XL XLVI LI LIII * Figura 15.- Frecuencia de aislamiento (%) de los genotipos O. oeni, en cada etapa de la FML, y en ambas vendimias. (*) Los genotipos con un % de participación menor del 10% han sido agrupados. 35/47

En todas las bodegas, el número de genotipos en las dos últimas etapas se mantuvo o decreció ligeramente, lo que podría ser debido a los cambios ocurridos durante la FML. La permanencia de los genotipos XVII, XVIII y XXIII en todas las bodegas y en las dos vendimias analizadas, hizo pensar en su idoneidad para un uso industrial y fue el criterio utilizado en la selección de las cepas que fueron utilizadas en el estudio de caracterización tecnológica, realizado como continuación a este proyecto. Con respecto a las especies no-oenococcus, destacar que Lc. mesenteroides estuvo presente en cada bodega en al menos una vendimia, siendo por tanto la especie no-oenococcus predominante, seguida de L. plantarum. Además, Lc. mesenteroides fue la única especie no- Oenococcus aislada en las bodegas C y D, mientras L. plantarum estuvo presente en ambas vendimias en las bodegas A y E. L. hilgardii estuvo presente únicamente en la vendimia del 2006 en la bodega B y L. casei estuvo presente en la misma vendimia en las bodegas A y B. Cuando se realizó el análisis cluster de los perfiles RAPD-PCR de estos aislados, pudo comprobarse que se agrupaban en 19 genotipos. Los aislados Lc. mesenteroides se agruparon en dos de estos; uno agrupó a los aislados de las bodegas A y B y el otro aquellos de las bodegas C y E. En ningún caso alguno de estos 19 genotipos fue detectado en más de una vendimia ni en más de una bodega. Los resultados de este estudio han sido recogidos en un articulo publicado en la revista Food Control vol. 21, 70-75 (2010). Por último, indicar que en los últimos meses del proyecto, y para tener un conocimiento más completo de la microbiota bacteriana presente en la fermentación maloláctica de los vinos de la variedad Tempranillo, se llevó a cabo un estudio utilizando una técnica de las denominadas independientes de cultivo, como es la PCR-DGGE, a fin de comparar los resultados con aquellos que habíamos obtenido mediante siembra en placa. 36/47

Para la puesta a punto de la técnica se ensayaron diferentes cebadores, seleccionándose los denominados HDA (Ogier et al., 2002) con los que, y en concordancia con diferentes autores (Lopez et al., 2003; Pérez Pulido et al., 2005; Giannino et al., 2009), se obtuvieron los mejores resultados. La Figura 16 muestra los geles obtenidos para algunas de las muestras de ambas vendimias. Vendimia 2006 Vendimia 2007 1 2 3 4 5 Figura 16.- Perfiles PCR-DGGE de los productos de amplificación de la región V3 del rrna, obtenidos de muestras tomadas en diferentes etapas de las dos vendimias en la bodega. Los resultados de la secuenciación de las 5 bandas obtenidas en los perfiles PCR-DGGE de las diferentes muestras y su posterior comparación con otras de las bases de datos, permitieron identificarlas como correspondientes a las especies O. oeni, Gluconobacter (G.) oxydans, Asaia (A.) siamensis, Serratia sp. y Enterobacter sp. (Tabla 6). Tabla 6.- Identidad de las bandas obtenidas a partir de la región V3 del rrna mediante análisis PCR-DGGE. 37/47

Estos resultados fueron parcialmente coincidentes con los descritos por Renouf et al. (2006), quienes al estudiar la evolución de las bacterias lácticas durante la vinificación en diferentes bodegas utilizando la misma técnica, describieron la presencia de O. oeni, L. casei y G. oxydans. En ese estudio, y de acuerdo con nuestros resultados, O. oeni fue la especie predominante, presentando una banda muy intensa en la mayoría de las muestras analizadas. Los restantes géneros también han sido encontrados por otros autores en la superficie de la uva, pudiendo representar poblaciones importantes en los mostos (Holt et al., 1994; Lonvaud-Funel, 1999). Renouf et al. (2005) publicaron que las especies de Enterobacter y Serratia desempeñan un papel importante en el consorcio microbiano de la superficie de la uva por la producción de exopolisacáridos, y años más tarde (Renouf et al., 2007) describieron la presencia de especies de estos géneros en la superficie de uvas de diferentes viñedos de la zona de Burdeos. Bae et al. (2006) pusieron de manifiesto la presencia de A. siamensis en medios enriquecidos con vino de uvas cultivadas en Australia. Cuando se compararon los resultados obtenidos en este estudio con aquellos de los análisis de los aislados crecidos en las placas de agar MLO, se observaron resultados coincidentes en términos de diversidad de especies si bien, se encontraron diferencias importantes en las especies identificadas. Así, las especies L. plantarum, L. hilgardii, L. casei y Ln. mesenteroides únicamente fueron identificadas tras la siembra en placas de agar MLO, mientras que las especies G. oxydans, A. siamensis, Serratia sp. y Enterobacter sp. sólo pudieron ser detectadas mediante el análisis PCR-DGGE. Sólo la especie O. oeni fue puestas de manifiesto por ambos métodos. 38/47

Estos resultados permiten afirmar que la siembra en medios selectivos, como son el agar MLO o el agar MRS, método habitualmente utilizado en estudios de biodiversidad microbiana, favorece la detección de un grupo de bacterias incluso si sus poblaciones son bajas, pero presenta el inconveniente de limitar los grupos de bacterias que pueden ser detectados. Por el contrario, el análisis de poblaciones bacterianas utilizando métodos independientes de cultivo, permite la identificación de diversos grupos de bacterias, aunque éstos deben estar presentes en elevadas concentraciones. Estos resultados coinciden con los publicados por Renouf et al. (2007), quienes describieron que la PCR-DGGE sólo era capaz de revelar las especies predominantes, siendo difícil la detección de numerosas especies presentes en bajas concentraciones. Por lo tanto, el hecho de que no se detecten determinadas especies en el análisis PCR-DGGE no siempre significa que dichas especies están ausentes, pudiendo estar presentes aunque de forma menos abundante. Puede entonces concluirse que, si bien el análisis PCR-DGGE proporciona una imagen más amplia de la población bacteriana presente en la fermentación maloláctica del vino, no da tampoco una imagen completa de la misma. Las diferencias en los resultados obtenidos con los métodos dependientes e independientes de cultivo sugieren la conveniencia de realizar estudios combinados utilizando ambos tipos de métodos, a fin de detectar tanto las especies dominantes como las minoritarias, lo que en definitiva permitirá tener un mejor conocimiento de la ecología bacteriana que existe en la fermentación maloláctica del vino. Además, es importante destacar que la utilización de un método dependiente de cultivo con una alta capacidad de discriminación intraespecífica, como es la RAPD-PCR, posibilita la obtención de información adicional de los genotipos participantes en el proceso, lo cual puede ser importante desde un punto de vista tecnológico. Estos resultados han sido recogidos en un artículo que ha sido recientemente aceptado en la revista Applied Microbiology and Biotechnology DOI: 10.1007/s00253-010-2492-8. 39/47

4. CONCLUSIONES De los resultados anteriormente expuestos pueden extraerse las siguientes conclusiones: 1. La Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) es una técnica adecuada para el genotipado de cepas de Oenococcus oeni, tanto por su capacidad de discriminación intraespecífica, comparable con la de la Pulsed Field Gel Electrophoresis (REA-PFGE), como por su sencillez metodológica. 2. Por el contrario, la DD-PCR mostró una escasa reproducibilidad lo que, en nuestra opinión, invalida este método para estudios de biodiversidad. 3. O. oeni es la especie predominante en la fermentación maloláctica de los vinos de la variedad Tempranillo, si bien también han podido identificarse, aunque en baja proporción, las especies L. casei, L. plantarum, L. hilgardii y Lc. mesenteroides. 4. La presencia de genotipos coincidentes en muestras tomadas en diferentes vendimias y procedentes de bodegas situadas en diferentes provincias de la región, sugiere una distribución geográfica de las cepas de O. oeni que crecen espontáneamente en el vino y confirma la existencia de una microbiota bien adaptada no sólo a las condiciones de elaboración utilizadas en la bodega, sino también a las condiciones ecológicas de esta región. 5. El análisis PCR-DGGE proporciona una información de las especies de bacterias presentes en el vino, diferente y complementaria a la obtenida tras el análisis RAPD-PCR de los aislados obtenidos por siembra en placa, por lo que 6. Un estudio polifásico combinando ambos métodos, RAPD-PCR y PCR-DGGE, sería una solución interesante para alcanzar un mejor conocimiento de la ecología microbiana de un ecosistema tan complejo como es el vino. 7. Este estudio ha permitido la creación de un banco de cepas potencialmente utilizables en procesos industriales y con las que actualmente se está llevando a cabo un estudio de caracterización enzimática. 40/47