BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 4: EXTRACCIÓN DE ARN 1. INTRODUCCIÓN En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y producir las proteínas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula. La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-piro carbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente 2. OBJETIVOS Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción de ARN Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtención de ARN 3. MARCO TEORICO La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenización de la muestra con el (los) reactivo (s) que contengan la solución fenol-isotiocianato, donde este último se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitación el ARN.
La metodología que se va a utilizar en esta práctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencionó, igualmente el ADN y las proteínas pueden ser recuperados de la fase orgánica por precipitación secuencia, así con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitación adicional pueden recuperarse las proteínas de la fase orgánica. Esta técnica permite obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y células en cultivo o suspensión de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Así mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaución está libre de contaminación con ADN y proteínas y finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripción reversa, ensayos de protección de RNAsas PCR y clonaje molecular 4. PRE-LABORATORIO 1. Durante la extracción de ARN se emplea sales de guanidinium. Cuál es su función y que tipo de sales son las más utilizadas? 2. Cuál es la función del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extracción del ARN? 3. Mediante el método de TRIzol se puede aislar simultáneamente ADN, ARN y proteínas? 4. Se obtiene la misma cantidad de ARN que de ADN en la extracción con TRIzol? 5. Qué tipo de ARN se obtiene en este tipo de extracción? 6. Porque se requiere agua milliq, ultrapura o tipo I en este procedimiento? 5. PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos cuando se trabaja con ARN: - Siempre deben utilizarse guantes de látex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer. - Utilizar pipetas y micro pipetas estériles, reservadas para trabajo de ARN, evitando así contaminaciones cruzadas. - Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas) -El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben utilizarse elementos de protección como guantes y gafas, evitando completamente el contacto con piel y ropa, así como evitando inhalar el reactivo o los vapores de este. Otras precauciones son: - Utilizar siempre tubos de polipropileno
- Utilizar material resistente al cloroformo y altas velocidades de centrifugación - Equilibrar los tubos previos a la centrifugación - Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugación y durante la incubación para evitar la evaporación. 6. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato Reactivo TRIzol (Gibco) Eppendorf estériles de 1.5 ml Micro pipetas Puntas estériles Centrífuga y micro centrífuga Guantes Agua desionizada estéril Cloroformo Agua libre de ARNasas Isopropanol Etanol al 75% en agua libre se RNAsas 7. PREPARACIÓN DE REACTIVOS NaCl al 0.9% -Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estéril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina de extracción y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente - Etanol al 75% 100mL de agua libre de RNAsas Etanol grado biología molecular Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en un frasco estéril hasta homogenizar completamente No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente.
8. PROCEDIMIENTO Esta práctica se realizará en dos clases. En la primera se recolectara la muestra a partir de sangre total se obtendrán Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP), mediante gradientes de centrifugación Ficoll Hypaque y se dejara hasta el paso de homogenización. TECNICA DE TRIzol PARA EXTRACCIÓN DE ARN I. HOMOGENIZACIÓN 1. En un tubo Eppendorf de 1.5 ml, homogenizar el pellet de CMSP (obtenidas previo sometimiento de sangre total a gradiente de Ficoll-Hypaque) con 1 ml de reactivo TRIzol. Se deja incubando a -70 0 C, hasta la próxima práctica. 2. Mezclar suavemente con micro pipeta. II. FASE DE SEPARACIÓN 3. Incubar la muestra homogenizada durante 15 minutos a temperatura ambiente, permitiendo así la completa disociación de los complejos de nucleoproteínas. 4. Adicional 200ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo 5. Agitar fuertemente durante 15 segundos 6. Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical 7. Centrifugar las muestras a 14000rpm por 10 minutos preferiblemente a temperatura de 4 a 8 C 8. Luego de centrifugar, la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol cloroformo, en una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene exclusivamente el ARN III. FASE DE PRECIPITACIÓN 9. Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo (aquí puede separarse igualmente la fase orgánica para posterior purificación de ADN o proteínas) 10. Adicional 0.5 ml de isopropanol Eliminar el sobrenadante Homogenizar pellet de células blancas con TRIzol Mezclar e incubar Adicionar cloroformo Agitar e incubar Separación de fases Tomar la fase acuosa y Adicionar isopropanol Descartar el sobrenadante Adicionar etanol al 75% al pellet. Mezclar Dejar secar a T ambiente Adicionar agua libre de RNAsas y homogenizar
para precipitar el ARN de la fase acuosa 11. Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical 12. Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a temperatura de 2 a 8 C 13. El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugación como un pellet parecido a un gel. IV. FASE DE LAVADO 14. Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo 15. Adicionar 1 ml de etanol al 75% al pellet para lavarlo 16. Mezclar por agitación 17. Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2-8 C 18. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante V. FASE DE DISOLUCIÓN 19. Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de papel estéril 20. Adicionar 30ul de agua libre de ARNasas 21. Disolver el ARN por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10 minutos a 55-60 C para lograr una completa disolución 9. POST-LABORATORIO 1. A qué factores puede deberse la obtención de baja cantidad o pérdida total del ARN extraído con esta metodología? 2. Qué otras técnicas comerciales existen para extraer ARN? 3. El ARN obtenido aquí puede utilizarse directamente para realizar una determinación específica a través de PCR? Por qué? 4. A partir de que otras muestras puede realizarse la extracción de ARN y con qué objetivo se realiza en estas muestras la extracción? 5. Qué inhibidores de nucleasas existen y en que procedimientos deben utilizarse? 10. BIBLIOGRAFIA Revista Nature Protocolos Años 2009-2013 - Almonacid, C Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2008 - Chomczynski P. and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156 - Chomczynski P. and Sacchi. 1993. Biotechniques. 15:532 - Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York - David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
- Catálogos de TRIzol casa comercial GIBCO. 11. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LOGRO LA PRACTICA (Objetivos cumplidos) SI NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD
ANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No. 4 OBTENCION DE ADNc 1. INTRODUCCIÓN Cuando el ARN mensajero es obtenido, se puede llevar a cabo una amplia variedad de aplicaciones: elusión del ARNm, cuantificación del ARNm y síntesis de ADNc (ADN complementario) el cual puede ser utilizado para: amplificación, detección de la expresión de genes específicos o almacenaje de ADNc. Para obtener el ADNc se utiliza una técnica denominada RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction; Transcripción Reversa - Reacción en Cadena de la Polimerasa), que nos permite la amplificación de una cantidad pequeña de moléculas de ARN (tanto ARNm como RNA total) con gran especificidad, mediante la Transcripción reversa del RNA a ADNc, que es posteriormente amplificado. 2. OBJETIVOS Identificar los reactivos, funcionamiento y orden de adición de los reactivos necesarios en la obtención de ADNc in Vitro. Adquirir conocimiento básico para el manejo y funcionamiento de la obtención de cadenas complementarias de ADN Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtención de ADNc 3. MARCO TEORICO Esta técnica permite obtener ADNc a partir de pequeñas cantidades de ARN de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Así mismo el ADNc obtenido por este método, si se realiza el procedimiento con precaución, está libre de contaminación con DNAsas y proteínas. Además el ADN contaminante, tanto en las muestras, como en los reactivos, debe ser evitado con el fin de impedir la aparición de productos inespecíficos Hay dos partes bien diferenciadas en cualquier RT-PCR: la transcripción reversa y la amplificación. La transcripción reversa, utilizando RNA total como ARNm, es la etapa clave en una RT-PCR. Existen varios factores que influencian la eficiencia del proceso, tales como: la enzima que va a llevar a cabo esta reacción, la presencia de estructuras secundarias en el ARN, etc.
Las reverso transcriptasas virales, tales como M-MLV y AMV, han sido las enzimas de elección durante muchos años. Estas enzimas, sin embargo, son termolábiles, y no pueden llevar a cabo la transcripción reversa cuando existen estructuras secundarias en el ARN. En este caso, se suelen utilizar transcriptasas reversas termoestables, que pueden llevar a cabo la reacción a 55-70ºC, permitiendo la desnaturalización de las estructuras secundarias, y aumentando la eficiencia global de la reacción. 4. PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria, por lo cual debe utilizarse durante todo el procedimiento guantes de látex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer; utilizar todo el material necesario para el trabajo de ARN (pipetas, micro pipetas, entre otros) estéril y con inhibidores de RNAsas evitando así contaminaciones cruzadas. Se deben tener en cuenta otras precauciones enunciadas en la práctica de extracción de ARN 5. PRE- LABORATORIO Dependiendo las condiciones experimentales puede darse la necesidad de usar ADNc, para lo cual se realiza primero la extracción de ARN que más tarde será sintetizado a ADNc. Para ello, la ciencia se ha valido de un truco viral: los virus que no poseen ADN propio tienen que transformar su ARN a ADN dentro la célula huésped y para ello están equipados con una ADN polimerasa especial, al igual que otras polimerasas es dependiente de ARN, está se denomina transcriptasa reversa. La más conocida comercialmente es la MMLV (Molones Murine Leucemia Virus) que añade nucleótidos al poli nucleótido naciente en dirección 5' 3'. MMLV utiliza ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Teniendo en cuenta el enunciado anterior. Responda las siguientes preguntas: 1. Cuál es la diferencia entre ADNc y ADN genómico? 2. Actualmente en el mercado se cuenta con otro tipo de retrotranscriptasas, mencione alguna de ellas? Cuáles son las diferencias entre cada una de ellas? 3. La retrotranscriptasas utilizan ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Los cebadores más comunes son un oligo dt (TTTTTTTT), primers degenerados (generalmente hexámeros) específicos anti sentido o sentido. En qué condiciones se deben emplear cada uno de ellos? 6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS ARN obtenido con anterioridad
Micro pipetas Puntas estériles Vortex Centrífuga con rotor para tubos de 15ml y Micro centrifuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua des ionizada estéril Tris Acetato EDTA SDS Bromuro de etidio Agarosa Reactivos comerciales para transcripción reversa Cámara de electroforesis 7. PREPARACION DE REACTIVOS Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estéril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenización completa del DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente), adicionando el DEPC en cabina de extracción y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y Almacenar a temperatura ambiente 8. PROCEDIMIENTO TECNICA DE ADNc DE PROMEGA Luego de la extracción de ARN, cada muestra se procesa para la obtención de cadena complementaria o ADNc por medio de una reacción la cual contiene la enzima Transcriptasa Reversa MMLV-RT, buffer para la enzima, dntps, RNAsin y Random Primers u Oligo DT (Promega). El procedimiento utilizado es: 1. En un tubo Eppendorf, colocar 10 µl de RNA (200ng aproximadamente) 2. Adicionar 5ul de agua libre de RNAsas 6ul de buffer para RT, 1ul de RNAsin, 1.5ul de dntp (mezcla de 10mM), 3 µl de Oligo DT o Random Primers y 1.5ul de enzima MMLV-RT. 3. Incubar a 37 C durante 1 hora. 4. El ADNc obtenido se puede guardar a -20 C hasta su futuro uso. 5. Puede observarse la calidad del ADNc visualizándolo en gel de agarosa al 1% preparado en buffer de corrido TAE (tris-acetato-edta) y teñido con bromuro de etidio.
6. El corrido se hace a 100V durante 30 minutos aproximadamente 9. POST-LABORATORIO 1. Cómo actúa o funciona la MMLV-RT en la transcripción reversa? 2. Qué otras transcriptasas reversas existen, de que origen y que características tienen? 3. La enzima para la transcripción reversa en que paso del procedimiento debería adicionarse y porque? 4. El ADNc obtenido en que procedimiento o para que finalidades puede utilizarse? 5. Qué inhibidores de RNAsas existen y cómo actúan? 10. BIBLIOGRAFIA -Revista Nature Protocols años 2009-2012 1..Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, Roche, etc. 2.Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156. 1. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. 2. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 3. Catálogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA. 4. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual Moderno. Universidad de la Sabana. 2005. 5. Biología molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biología molecular e ingenieria genetica. Luque jose et l. Primera edicion. 2001. 11. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LA PRACTICA SI LOGRO (Objetivos cumplidos) NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD