TEMA 8.- TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA. 1.-Tecnología del DNA recombinante 2.- Herramientas básicas necesarias para el conocimiento y modificación del DNA 3.- Marcadores moleculares aplicados a la identificación genética TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE 1973 - Berg, Boyer y Cohen Primeros experimentos de DNA recombinante con los que introducen Genes en E.coli Unión artificial de DNA de distintos orígenes 1
Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo PRIMER PASO: cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a utilizar con enzimas de restricción GEN PLÁSMIDO (otro tipo de vector) SEGUNDO PASO: LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el vector y el fragmento de DNA MOLÉCULA DE DNA + RECOMBINANTE TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias Procariotas: transformación, conjugación Eucariotas: Electroporacion microinyección, vectores virales, proyectiles de DNA HERRAMIENTAS BÁSICAS B NECESARIAS PARA EL CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓN N DEL DNA ENZIMAS DE RESTRICCIÓN VECTORES DE CLONACIÓN GENOTECAS IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS PCR MARCADORES MOLECULARES 2
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN FINALES DE LOS 60 Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la invasión de ciertos virus? El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se corta en pequeños fragmentos inactivándose Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasas que cortaban el ADN en una secuencia corta y específica ENZIMAS DE RESTRICCIÓN - Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural - Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena - Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 - Reconocen secuencias palindrómicas y el corte es simetrico AAGCTT TTCGAA Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae 3
PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS: EXTREMOS COHESIVOS EXTREMOS ROMOS ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES (>3000) QUE SE HAN AISLADO.. NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una) ALU I primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus Extremos romos 4
VECTORES DE CLONACIÓN Características generales: - Replicación autónoma - Mapa de restricción conocido: un único punto de corte - Tengan marcadores selectivos: - resistencia a antibióticos -cambios de color - De fácil recuperación TIPOS: -Plásmidos -Fago λ -Cósmidos -YACs -BACs Clonación de fragmentos de hasta 10 kb PLÁSMIDOS -ADN doble y circular -Replicación autónoma; información no vital -Pueden conferir resistencia a antibioticos -Posibilidad de integración en cromosoma principal bacteriano EPISOMA -Tamaño variable: 1 a 500Kb FAGO λ Clonación de fragmentos de hasta 25 kb EXTREMOS COS DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb infecta E. coli extremos cohesivos (COS): extremos 5 monocatenarios (12 nucleótidos de secuencia complemenaria) 5
Cósmidos Clonación de fragmentos de hasta 45 kb Vectores híbridos Fago λ + plásmido BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 300 kb YACs (Yeast Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 1000 kb CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS - Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie - Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA - Numero de clones necesarios depende de - Tamaño del inserto - Tamaño del genoma Fórmula de Clarke y Carbon N= ln (1 - p) ln (1 - f ) N= nº de clones necesarios P= probabilidad de tener el genoma completo F= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma Ejemplo -E.coli- Tamaño: 4.300 Kb P= 0,95 1300 plásmidos 300 cósmidos 130 BACs 12 YACs 6
IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS PARA PODER IDENTIFICAR, AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS TODOS LOS MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS TRANSFERENCIA del ácido nucleico a una membrana o soporte físico ( blotting ) + HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA SONDA: Fragmento de DNA de secuencia conocida que hibridará por complementariedad OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS SOUTHERN BLOTTING Digestión del DNA con enzimas de restricción - Separación mediante electroforesis NORTHERN BLOTTING Similar a Southern blot pero para identificación de secuencias de RNA SLOT/DOT BLOTTING. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita y se transfiere a soporte sólido HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células en cultivo 7
HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA existe otra forma de clonación de DNA PCR Qué es? REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA FORMA DE CLONACIÓN IN VITRO FOTOCOPIADORA MOLECULAR Técnica que nos permite amplificar o clonar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación Cuáles son los fundamentos? EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde DNA Polimerasa 3 5 dttp dntps datp dgtp dctp + Mg ++ 5 3 8
EXTENSION DEL CEBADOR Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3 del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar 5 3 DNA polimerasa DNA Polimerasa 3 5 REPETICIÓN n VECES DE UN CICLO CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES C i c l o 1 EXTENSIÓN 9
n CICLOS : ciclo 3 n CICLOS : ciclo 5 10
La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior. Después de: - 2 ciclos tenemos 2 x 2-3 ciclos - 2 x 2 x 2-4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2 N. Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo. 11
MARCADORES MOLECULARES IDENTIFICACIÓN GENÉTICA Patógenos Test de paternidad Trazabilidad Autentificación de productos Diagnóstico de patologías IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA? Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual. Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis. Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas. Causar patologías Generar variabilidad 12
RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases RAPDs : Random amplified polymorphic DNA SNPs: Single nucleotide polymorphisms Para su detección : amplificación por PCR RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Origen: mutaciones delecciones insercciones reordenaciones CARACTERÍSTICAS Detectables por PCR Bialélicos Muy abundantes Ampliamente distribuidos por el genoma Codominancia Alta reproducibilidad 13
Ejemplo RFLP _ 199 pb 165 pb 34 pb _ + Ampl. CC TT CT + 1 2 3 4 5 6 7 8 MICROSATÉLITES Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb. 14
MICROSATÉLITES - Características - - Su polimorfismo radica en el número de repeticiones - Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10) - Se han encontrado en todas las especies conocidas - Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma - Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios micros a la vez TGLA227 TGLA126 ETH225 BM2113 TGLA122 BM1824 INRA23 ETH10 SPS115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 15
RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA) Ventajas Se utilizan primers diseñados al azar. Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos) No es necesario el conocimiento previo de la secuencia El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad SNPs (single nucleotide polymorphisms) Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido. A C G A C A A C G T C A A C G A C A A C G A C A A C G T C A A C G T C A cerdo 1 AA cerdo 2 TT cerdo 3 AT C/C C/T 16
SNPs Características Variación muy frecuente (1 cada 1000bp) Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia muy estable ( t. mutación 10-6 ) Fácil estandarización Posibilidad de automatización MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, necesita reunir una serie de características: Que sea muy polimórfico, Que esté distribuido por todo el genoma. Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación Que sea público. Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva. Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN. Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes. Que sea estable 17