PRÁCTICA No. 2 Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias Objetivos. Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivo sólido para la obtención de cultivos puros de bacterias. Que el estudiante prepare medios de cultivo de uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas. Introducción Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los microorganismos para crecer. Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conservación, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deberán realizarse en zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e identificación de las especies microbianas. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líquidos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que se separa dará origen a una población que formará una colonia característica, visible a simple vista. La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja intensidad, se aplican métodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de ph, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de microorganismo de interés y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modificación del ph del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medos diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas. Materiales 3 cajas de Petri con Agar nutritivo 3 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB 3 cajas de Petri con Agar papa-dextrosa 1 Mechero 1 Asa de siembra 1 Parrilla de agitación 1 Autoclave Procedimiento El alumno recolectara muestras para ver el tipo de microorganismos que estan presentes en estas muestras. Técnica de estría cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado borde el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4). b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple).
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 1. Hacer grupos de 3 cajas, primer grupo medio nutritivo, segundo grupo y tercer grupo agar papa-dextrosa. Sembrar en las cajas por estría 2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrara por estría cruzada la muestra problema. Condiciones de incubación 1. Incubar las cajas en forma invertida a 35 C durante 24 horas Resultados A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5 B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
Cuadro 4 Morfología colonial de cultivos bacterianos Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Aislamiento por Estría cruzaca Forma: Color: Tamaño (mm) Borde: Superficie: Aspecto: Elevación: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: Medio Nutritivo Agar EMB Agar papa-dx Siembra en medios selectivos y diferenciales: Microorganismo 1: Forma: Color: Tamaño (mm) Elevación Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide Borde: entero, lobulado, aserrado Superficie: lisa o rugosa Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa Elevación: convexa, plana, hundida Luz transmitida: translúcida, opaca Luz reflejada: brillante, mate Consistencia: dura, blanda, mucoide
Cuestionario 1. Qué es el agar y de donde se obtiene? Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos? 2. Cuál es la composición química de los medios: medio nutritivo, agar EMB, Agar papa-dextrosa.? Cuáles son los componentes o propiedades responsables de su función como medios selectivos o diferenciales? 3. Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negartivas? 4. Bibliografía consultada Referencias Bibliográficas Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Frances Pouch Downes and Kelth Ito, 200 Practical Handbook of Microbiology.CRC Press, 1989. William M O Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. 9 th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater Ed. (1991).