Estudio de las determinaciones hematológicas en sangre Objetivos 1. Conocer y determinar algunos parámetros hemáticos representativos. 2. Interpretar los resultados experimentales. 3. Estudiar diferentes tipos de anemia. 4. Comprobar si el hematocrito tiene relación con el volumen ocupado por los eritrocitos. El estudio de las determinaciones hematológicas en sangre consta de dos bloques: 1. Parámetros e índices hematimétricos: para determinar los valores más representativos de la sangre. 2. El eritrocito como osmómetro: para detectar la susceptibilitat de los eritrocitos frente a pequeñas variaciones de la concentración osmótica del medio. Introducción Principios fisiológicos La sangre de vertebrados constituye una especialización del medio interno; su volumen varía según la especie, y en el hombre representa el 8 % del peso corporal. La sangre es un líquido complejo con un peso específico de 1,055 g/ml. Las células sanguíneas realizan dos funciones importantes: transporte de gases respiratorios (O2 y CO2) y protección inmunológica frente a agentes extraños. La primera la llevan a termino los eritrocitos (también llamados hematíes o glóbulos rojos), células muy especializadas. Si bien en casi todos los grupos de vertebrados los eritrocitos son nucleados, biconvexos y generalmente elípticos, en los mamíferos (aparte de los camélidos) son anucleados y discoidales. Los eritrocitos contienen un pigmento proteico en concentración elevada, la hemoglobina, la cual se combina reversiblemente (en relación con la presión parcial del gas) con el O2 y el CO2. Cada hemoglobina está formada por cuatro subunidades, cada 1 de 10
una con un grupo hemo (responsable del color rojo y al cual se une una molécula de O2) y una globina (responsable de las interacciones alostéricas que modifican la afinidad al O2 y a la cual se fija el CO2). La función de transporte de oxigeno por la sangre vendrá condicionada, en primer lugar, por la cantidad de hemoglobina circulante, la cual dependerá del número de eritrocitos y de la concentración eritrocítica del pigmento. Protocolo Experimental Se hará una determinación de los índices más representativos de la sangre: contaje globular, hematocrito, y hemoglobina con método manual y método automático. A partir de estos valores se calcularán los índices hematimétricos: Volumen corpuscular medio (VCM), Hemoglobina corpuscular media (HbCM) y Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHbCM). Se valorarán los cambio provocados en el volumen celular por efecto de disoluciones de diferente concentración osmótica. Metodología Pararámetros e índices hematimétricos Sacar sangre por punción cardiaca en rata Guardar en tubo heparinizado en nevera a 4ºC Antes de analizar cada parámetro, resuspender la sangre con agitador de rodillo Contaje Globular Esta medida se realiza mediante una cámara de Thoma o de Neubauer que presenta una cuadrícula especial (ver figura 1). El contaje se expresa en millones de glóbulos por mm3 de sangre. La disminución del número indica una anemia y el aumento, una policitemia. Hematocrito Expresa el volumen de eritrocitos que hay en 100 ml de sangre. Normalmente los leucocitos y las plaquetas contribuyen al hematocrito en un grado ínfimo, referido al tanto por ciento de volumen de sangre. El valor del hematocrito varía con la especie y en relación con el número y el tamaño de los eritrocitos así como con el volumen de 2 de 10
plasma. Un hematocrito reducido puede ser un indicador de anemia y un valor elevado (65 %) se observa en casos de deshidratación, como el cólera (a causa de las considerables pérdidas de líquido en la defecación, con la consiguiente reducción del volumen plasmático). El valor del hematocrito constituye un índice indirecto de la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre y es un parámetro importante para detectar una anemia o una policitemia. Índices hematimétricos La relación entre los valores hemáticos de hematocrito o Htc (volumen celular 100/volumen de sangre), contaje o Rc (millones de eritrocitos/mm3) y concentración de hemoglobina o Hb (g Hb/100 ml sangre) permiten calcular los índices hematimétricos. Tienen interés porqué presentan variaciones entre los diferentes vertebrados y permiten interpretar alteraciones patológicas, como por ejemplo las anemias. Volumen corpuscular medio El volumen corpuscular medio (VCM) es el volumen medio de los eritrocitos y viene dado por la expresión: VCM = (Htc 10) / Rc donde Rc representa el número de eritrocitos en millones por mm3 de sangre. Hemoglobina corpuscular media Hemoglobina corpuscular media (HbCM) es la cantidad media de Hb por eritrocito. Se expresa en picogramos y se puede calcular siguiendo la expresión: HbCM = (Hb 10) / Rc donde Hb es la concentración de hemoglobina en g/100 ml sangre y Rc los millones de eritrocitos por mm3 de sangre. Concentración de hemoglobina corpuscular media Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHbCM) es la concentración media de hemoglobina de los eritrocitos, es decir, la cantidad (en g) que hay en 100 ml de glóbulos; viene dada por la expresión: CHbCM = Hb / (Htc / 100) = Hb (100 / Htc) El eritrocito como osmómetro A causa de la marcada susceptibilidad de los eritrocitos frente a las pequeñas variaciones de la concentración de partículas osmóticamente activas en el medio que las rodea, el eritrocito pierde o gana líquido con relativa facilidad. Los cambios provocados en el volumen celular por efecto de disoluciones de diferente concentración osmótica pueden comprobarse fácilmente mediante la determinación del hematocrito. Esta prueba pone de manifiesto la necesidad de controlar cuidadosamente los factores o elementos que puedan modificar la composición del medio con el cual se ponen en contacte los eritrocitos, para evitar errores o variaciones importantes a la hora de determinar el hematocrito de una muestra de sangre. 3 de 10
Material Centrífuga microhematocrito Espectrofotómetro Contador hematológico Microscopio Pipetas automáticas Pipeta cuentaglóbulos Cámara de Thoma Contaje globular A. Método manual Dilución de la sangre: Se introduce la punta de la pipeta cuentaglóbulos, colocándola en posición casi horizontal, y se aspira para hacer subir la sangre hasta al señal 0,5 de la pipeta. Si la sangre pasa de la señal, puede hacerse retroceder tocando el extremo de la pipeta con un papel de filtro, para eliminar el volumen excedente. Es importante no pasarsede la marca 0,5. Es importante limpiar de sangre la superficie de la pipeta con papel de filtro y vigilar de no perder muestra del interior. Con la punta de la lengua se ha de tapar el tubo de goma, sumergir la punta de la pipeta en el líquido de dilución (suero fisiológico al 0,9 %) y aspirar hasta que este líquido llegue a la señal 101. Al sumergir la punta, hay que aspirar al principio con rapidez para evitar que parte de la sangre de la pipeta pase al líquido. Es importante no pasarse. Se ha de tapar con el dedo la punta de la pipeta, quitar el tubo de goma y tapar el otro extremo con el índice (o a la inversa, como sea más cómodo). Se ha de girar la pipeta, así sostenida, diversas veces para mezclar el contenido el. Así, la sangre se ha diludo en 0,5/100 o 1/200. 4 de 10
Aplicación sobre la cámara de Thoma o de Neubauer (ver la fig. 1) Se ha de desengrasar la cámara y un cubreobjetos, el cual se colocará sobre la zona de contaje. Se hace tocar la punta de la pipeta diversas veces con un papel de filtro para eliminar el líquido contenido en el capilar, ja que contiene sólo diluyente. Es importante que antes de este paso se vuelva a mezclar el contenido girando la pipeta diversas veces, ja que durante la preparación de la cámara los glóbulos pueden haberse sedimentado parcialmente. A continuación se hace tocar la punta de la pipeta con el lado del cubreobjetos (sobre la elevación longitudinal central, entre los dos zócalos de la cámara). La suspensión de eritrocitos no habría de sobrepasar el zócalo transversal central (si hay). Alternativamente, se puede depositar una pequeña gota y después colocar encima el cubreobjetos (aunque este sistema es menos fiable). Después de unos minutos, para que sedimenten las células, se observa al microscopio con un objetivo de aumento mediano. 5 de 10
Contaje (ver la fig. 1): La cámara de Thoma o de Neubauer consta de una cuadrícula central (1 mm2) con 16 cuadros grandes (4 4), separados por líneas divisorias. Cada uno de estos cuadrados está dividido en 16 cuadraditos pequeños de 1/400 mm2 de superficie. Si los eritrocitos se han repartido homogéneamente por toda la cuadrícula, se procede al contaje (en caso contrario tendría que repetirse la aplicación a la cámara). Para ésto se cuentan los eritrocitos en cinco cuadritos de cada uno de los cuadros grandes. En cada cuadradito se consideran dentro 10 de las células que estén sobre las 6 de 10
líneas inferior y derecha, pero no se tienen en cuenta las que estén sobre las otras líneas. En total se habrán contado 5 16 = 80 cuadraditos. Cálculo El volumen de líquido de la parte de la cámara donde se realiza el contaje es: 1/400 mm2 (área de un cuadradito) 80 (número de cuadraditos) 0,1 mm (hondura cámara) = 0,02 mm3. El número de células por mm3 de suspensión diluida será: número contado / 0,02 = número contado 50. La dilución en la pipeta es de 1/200; por tanto, el número de eritrocitos por mm3 de sangre será: número contado 50 (factor dependiente de volumen) 200 (factor de dilución). Para expresarlo en millones de eritrocitos por mm3, lo único que tendrá que hacerse es dividir el número contado por 100. B. Utilizando un contador de partículas Los contadores de partículas utilizan el sistema Coulter, que es un sistema no óptico en qué una suspensión de células sanguíneas circula a través de una abertura al mismo tiempo que pasa un corriente eléctrica. El paso de cada célula produce un cambio de impedancia (resistencia) en la abertura según el tamaño de la célula. El contador relaciona el tamaño con el tipo de célula. El número de células contadas es unas 100 veces superior a las contadas en los recuentos microscópicos (manuales), con lo que se reduce el error. El número de pulsos eléctricos indica el número de partículas que pasan por la abertura, y la medida de los pulsos es proporcional al volumen de las partículas. Los contadores Coulter hacen el recuento de eritrocitos, leucocitos y plaquetas por triplicado. Los contadores de partículas disponen de dos baños, uno de eritrocitos con una abertura de 50 µm y otro de leucocitos con una abertura de 100 µm. Contaje de eritrocitos En el baño de eritrocitos, estos son identificados como partículas de medida igual o superior a 36 fl. 7 de 10
En este baño también se llevan a cabo el recuento de plaquetas (volumen entre 2 y 20 fl). Contaje leucocitos A continuación las células son diluidas con diluente isotónico y pasan al baño de leucocitos, donde se aplica un agente que lisa los eritrocitos y leucocitos, de manera que quedan los núcleos de los leucocitos intactos (los eritrocitos no tienen núcleo) y las partículas con un volumen de 35 fl o más son contadas como leucocitos. Valoración de Hb Para la valoración de la Hb, el agente lisante reacciona con la hemoglobina libre y el color resultante se lee a 525 nm. A partir de estos valores el contador tiene capacidad para calcular: Hc, VCM, HCM, CHCM Hematocrito (Hc) 1. Resuspender células por inversión 2. Sumergir el capilar en la sangre por uno de sus extremos. Para favorecer la entrada de sangre conviene mantener el capilar casi horizontal. 3. Cuando falte medio centímetro para el llenado del capilar. Obturar el extremo con plastilina y limpiar sangre exterior. 4. Colocar los capilares en la centrífuga de microhematocrito de forma que el extremo 5. con la plastilina esté en contacto con la goma de la rendija. 6. Ajustar bien la primera cubierta de la centrífuga. 7. Cerrar la centrífuga. Centrifugar durante 5-6 minutos. Hemoglobina (Hb) Se utilizará el método de *Drabkin, que se basa en la conversión de la hemoglobina de una muestra de sangre en cianmetahemoglobina y la determinación fotométrica de ésta. Previamente se habrá de tener confeccionada una **recta patrón con cianmetahemoglobina comercial. 8 de 10
*Drabkin: El reactivo de Drabkin que produce la conversión tiene la siguiente composición : Ferrocianuro potásico 200 mg Cianuro potásico 50 mg Bicarbonato potásico 1 g Agua destiada qsp 1 l. Estable durante un mes a 4 C y en oscuridad. **Recta patrón Construcción de la recta patrón de la hemoglobina: [Hb] (g/dl) Solución patrón (ml) H2O (ml) 5 0,25 0,75 10 0,50 0,50 15 0,75 0,25 20 1,00 0,00 De cada un de los viales coger los 20 µl correspondientes y medir la absorbancia. Ejemplo recta patrón: g Hb/dl sangre = (A540 0,0036) / 0,0301 El eritrocito como osmómetro En diferentes tubos de ensayo es colocar 1 ml de cada cuna de las disoluciones siguientes de NaCl: 50 mm 150 mm 400 mm A continuación, se añade 1 ml de sangre, mantenida incoagulada, a cada uno de los tres tubos y se deja en repos durante 1 minuto. Hay que agitar los tubos invirtiéndolos suavemente. Por capilaridad, se transfiere una muestra de cada sangre a los tubos capilares de microhematocrito y se valora el hematocrito en cada caso, relacionando el valor obtenido con la concentración osmótica del medio en el cual se ha puesto en contacto la muestra inicial de sangre. 9 de 10
Resultados Tipos principales de anemias 10 de 10