CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales... Según el tipo de célula Germinales Somáticas (cáncer) Genéticas Según el tipo de alteración Génicas Cromosómicas Mutaciones puntuales Inserciones y deleciones numéricas estructurales Según el genoma y cromosoma afectados nucleares autosómicas Ligadas al sexo mitocondrial Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas
ALCAPTONURIA Archibald Garrod Orina negra ocronosis
1902 1945 1949 1953 1960-80 1977/1980 1985 A. Garrod Beadle y Tatum Pauling e Ingram Watson y Crick varios Maxam y Gilbert/Sanger Mullis estudios sobre la alcaptonuria Hipótesis "un gen-un enzima" bases moleculares de la anemia falciforme estructura de doble hélice del DNA técnicas de DNA recombinante técnicas de secuenciación del DNA técnica de PCR 1990-2004 2002-2008- Proyecto Genoma Humano Proyecto HapMap Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing)
Tipos de enfermedades genéticas. Patrones de herencia. Cromosomopatías Enfermedades monogénicas o de herencia mendeliana autosómicas recesivas autosómicas dominantes ligadas al sexo. Enfermedades complejas o multifactoriales Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansión de tripletes) Genes con impronta genética y disomías uniparentales Enfermedades de DNA mitocondrial Cáncer hereditario
CROMOSOMOPATIAS Se definen como cambios que resultan en una alteración visible de los cromosomas Son muy frecuentes (1% de recién nacidos, principal causa de abortos espontáneos, recién nacidos muertos...) Se producen por una mala reparación de cromosomas rotos o dañados o por fallos en la recombinación o en la segregación de los cromosomas durante mitosis o meiosis Se clasifican en : alteraciones numéricas alteraciones estructurales Se identifican por observación de los cromosomas del paciente mediante distintas técnicas: bandeo cromosómico con distintos colorantes, FISH, CGH...
Preparación de los cromosomas y análisis Obtención de muestra (eg: sangre) Tratamiento de las células con mitógenos (eg: PHA) mínimo 3 días Adición de colchicina para arrestar a las células en metafase Fijar las células Tratamiento con tripsina y Giemsa u otros colorantes
Caracterización de los cromosomas Técnicas citogenéticas G bands (Giemsa) C bands (centrómero) Q bands (quinacrina, fluorescente equivalente a G) R bands (patrón opuesto a G y Q) Bandeo de alta resolución (>400 bands) FISH (fluorescent in situ hybridization)
CROMOSOMOPATÍAS ALTERACIONES NUMÉRICAS POLIPLOIDIA (triploidia: 69XXX, XXY ó XYY) LETAL (Causa: dos espermatozoides o fallo en la 1ª división cigótica) ANEUPLOIDIA AUTOSÓMICAS CROMOSOMAS SEXUALES (Causas: edad avanzada, mala segregación en meiosis o mitosis)
Alteraciones numéricas autosomicas Características generales: Retraso mental Retraso en el crecimiento Anomalías congénitas múltiples Viabilidad baja, alta letalidad Asociadas a abortos espontáneos diagnóstico prenatal posible
Alteraciones numéricas autosómicas Monosomía: letal Trisomía:usualmente letal (dosis génica) Excepciones: Trisomía 21 - Down Syndrome (1:1000) Trisomía 13 - Patau Syndrome (1:20.000) Trisomía 18 - Edward Syndrome (1: 8.000)
Alteraciones numéricas de los cromosomas sexuales Características generales: Retraso en el crecimiento problemas reproducción viabilidad alta Asociadas a abortos espontáneos diagnóstico prenatal posible Ejemplos: Monosomía X: Síndrome de Turner (45, X) Trisomía (47, XXY): S. de Klinefelter Trisomía (47, XYY)
QUANTITATIVE FLUORESCENT PCR (QF-PCR) CUANTIFICACIÓN RELATIVA MICROSATÉLITES PARA DETERMINAR DOSIS GÉNICA amplificación microsatélites seleccionados con primers fluorescentes separación por tamaños mediante electroforesis capilar cuantificación relativa del área de los picos QF-PCR chr. 18: detección de una trisomia APLICACIONES: Diagnóstico prenatal de aneuploidias más comunes en 24 h: trisomia 21 (Down), trisomia 13 (Patau), trisomia 18 (Edwards), S. Turner (X), S. Klinefelter (XXY)
Chromosomopatías Alteraciones estructurales Deleciones e.g.46,xy, del(4) (p16.3) Translocaciones e.g.46,xx, t(2;6) (q35;p21.3) Inversiones e.g.46,xy, inv(11) (p11p15) Duplicaciones e.g.46,xx, dup(1) (q22q25) Cromosomas en anillo e.g.46,xy, r(7) (p22q36) Isocromosomas (se pierde 1 brazo, crom. Simétricos) Causas: reparación defectuosa de roturas en el DNA, o fallos en la recombinación) Efectos: variables, según punto de ruptura y pérdida o ganancia de material genético)
Translocación Robertsoniana (se fusionan dos cromosomas) break break 14 14 21 21 14 21 14/21
ENFERMEDADES GENÓMICAS (GENOMIC DISORDERS) -Producidas por reordenamientos genómicos -Se caracterizan por la presencia de duplicaciones segmentarias flanqueantes (>1kb, >90% identidad)que son sustrato de recombinación homóloga no alélica (NAHR) lo que origina deleciones, duplicaciones e inversiones -Pueden dar lugar a enfermedades mendelianas, predisponer a enfermedades complejas o ser polimorfismos neutros (CNV) -Patogénesis: dosis génica interrupción génica fusión de genes efecto posicional manifestación de mutaciones recesivas (para deleciones)
SINDROMES DE MICRODELECIÓN Cri du chat Williams-Beuren Prader-Willi/Angelman 5p14 7q11.23 (elastina) 15q11-q13 Rubinstein-Taybi 16p13.3 DiGeorge 22q11.21-q11.23 DUPLICACION Charcot-Marie-Tooth 17p12 (mielina) INVERSION Hemofilia A Factor VIII
FISH:FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
mfish: multiplex FISH Otra técnica: Spectral karyotyping (SKY)
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH) ARRAY CGH
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION: MLPA SONDAS HIBRIDACION region A region B LIGACION region A region B PCR
MLPA www.mlpa.com Fragment Analysis Sample deletion Control Análisis y cuantificación por electroforesis capilar Cuantificación relativa a una muestra control Areas de los picos normalizadas con la suma de todas las areas de esa muestra
EJEMPLO: DETECCION DE TRISOMIAS
MLPA www.mlpa.com Current applications of MLPA: Detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X and Y Detection of large chromosomal deletions or duplications: DiGeorge syndrome, Williams syndrome, CMT1 / HNPP, Pelizaeus-Merzbacher disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA), subtelomeric regions etc Detection of gains and losses of genes in cancer tissues: Her2-neu (ERBB2), TP53, MYC etc. Detection of deletions / duplications of single exons: BRCA1 and 2, MSH2, MLH1, VHL, SHOX, MECP2, APC and NF2, PAH.
ENFERMEDADES MONOGÉNICAS frecuencia estimada de 10:1000 Defecto en un único gen Se clasifican según el patrón de herencia en : autosómicas recesivas autosómicas dominantes ligadas al sexo
Enfermedad autosómica recesiva (el individuo heterocigoto o portador no se distingue del homocigoto normal) Padres portadores con fenotipo normal 75% probabilidad de hijos normales 25% probabilidad de hijos afectados 50% de probabilidad de hijos portadores Hombres y mujeres afectados en igual proporción Generalmente enzimas A veces asociadas con regiones geográficas o grupos étnicos Consanguinidad entre los padres
Enfermedades AR en grupos étnicos y geográficos fibrosis cística Tay-Sachs Anemia falciforme Thalasemias Caucasianos Judíos Ashkenazi Africanos Mediterraneo
SIMBOLOS MAS COMUNES EMPLEADOS EN LOS PEDIGREES VARÓN HEMBRA SEXO DESCONOCIDO AFECTADOS (ENFERMOS) NO AFECTADOS PORTADORES (Enf. AR o XR) Matrimonio consanguineo Muerto
Pedigree AR PATRON HORIZONTAL
EJEMPLOS: ENF. AR
Autosómica Dominante (AD) (el individuo heterocigoto es enfermo) Un progenitor afectado y el otro normal 50% probabilidad de hijos normales 50% de probabilidad de hijos afectados Hombres y mujeres afectados en igual proporción Penetrancia Expresividad o variabilidad fenotípica
Pedigree AD PATRON VERTICAL
EJEMPLOS: ENF. AD
Enfermedades AD: ejemplos Marfan s Syndrome Osteogenesis imperfecta Neurofibromatosis Braquidactilia Retinoblastoma Tuberous sclerosis Multiple polyposis of colon
ENFERMEDADES LIGADAS AL SEXO riesgo distinto según el sexo (AL CROMOSOMA X) Las mujeres pueden ser homocigotas o heterocigotas para el alelo mutante y pueden tener una expresión recesiva o dominante (aunque variable por la inactivación del cromosoma X) Los hombres muestran el fenotipo completo Ausencia de herencia de hombres a hijos varones Todas las hijas de un hombre afectado heredan el alelo mutante Hombres no afectados no transmiten al enfermedad
Enf. Ligada al X recesiva (XR) Madre portadora normal Padre normal 50% probabilidad de varones afectados 50% probabilidad de varones normales 100% probabilidad de niñas normales 50% portadora 50% homocigotas normales Hombre y mujeres TIENEN DISTINTO RIESGO Padre afectado y madre normal: 100% hijas portadoras 100% varones normales
Pedigree XR PATRON OBLICUO
EJEMPLOS: ENF. XR : Hemofilia, Lesh-Nyhan, def. piruvato DH )
Enf. Ligada al X dominante (XD) Padres afectados: 100% probabilidad de hijas afectadas 0% riesgo de varones afectados Madres heterocigotas afectadas: 50% probabilidad de varones afectados 50% probabilidad de hijas afectadas
EJEMPLOS: ENF. XD Raquitismo resistente a Vitamina D Albright s hereditary osteodystrophy
FACTORES QUE PUEDEN COMPLICAR LOS PATRONES DE HERENCIA MUTACIONES NUEVAS MOSAICISMO DE LINEA GERMINAL RETRASO EN LA EDAD DE APARICION NO PENETRANCIA EXPRESIVIDAD VARIABLE PLEIOTROPIA DE EFECTOS HETEROGENEIDAD DE LOCUS NMD (nonsense mediated mrna decay)
PTC:premature termination codon EJC:exon junction complex NMD : nonsense mediated mrna decay
Enfermedades complejas o multifactoriales: -Causadas por >1 gen -Influencia de factores ambientales -Cada gen implicado puede tener un efecto pequeño -No hay una herencia clara en familias -Posibles interacciones entre los genes implicados (epistasis) -Posibles interacciones ambiente-genes - medida de la enfermedad (fenotipo) a veces dificil
Efecto acumulativo: los alelos de varios loci interaccionan de manera que el efecto de la combinación de alelos es la suma de los efectos individuales. epistasis: interaccion entre genes en la que un gen interfiere con al expresión del otro. En general, el efecto combinado de alelos en más de un locus es diferente de lo esperado según sus efectos
Evidencias de que hay un componente genético en una enfermedad compleja: estudios familiares estudios de concordancia en gemelos estudios en hijos adoptados
Estudios en gemelos: Concordancia % Enfermedad G.Monocigoticos G. Dicigóticos Cleft lip 35 5 Type I diabetes 50 5 Type II diabetes 100 10 Multiple sclerosis 20 6 Rheumatoid arthritis 50 8 Tuberculosis 51 22 Alcoholism 40 20 Autism 60 7 Schizophrenia 44 16
Estudios en hijos adoptados: % de hijos adoptados Padres biológicos muestra (n) alcohólicos Padre alcohólico 89 39,4 Madre alcohólica 42 28,6 Padre no-alcohólico 723 13,6 Madre no alcohólica 1029 15,5 34,0% 14,6% Bonham 1978
Riesgo relativo: el cociente entre la frecuencia de una enfermedad compleja para un familiar de una persona afectada y la frecuencia de la población general λ r = frecuencia de los familiares del enfermo frecuencia en la población r = el grado de parentesco (λ r =5-10% para familia directa) Es un riesgo empírico
Riesgo relativo en familiares. Ejemplos: Enfermedad RIESGO (según grado de parentesco) Población 1º 2º 3º Cleft lip/palate 1/1000 35x 7x 3x Congenital dislocation/hip 1/1000 40x 4x 1.5x Pyloric stenosis 1/1000 20x 5x 2x Clubfoot 1/1000 20x 5x 2x Anencephaly/spina bifida 1/500 8x 2x
Enfermedades producidas por expansión de tripletes (mutaciones inestables) Descubierto en 1991 Causadas por expansión de trinucleótidos por encima de un número Por encima de ese numero los tripletes son inestables y se expanden (aumenta el nº de copias o repeticiones) No se transmite el mismo nº de repeticiones a los hijos sino un nº mayor (mutaciones dinámicas) El nº de repeticiones está relacionado con la severidad y edad de aparición de los síntomas: anticipación
ANTICIPACION La edad de aparición de la enfermedad es menor y la severidad de la enfermedad peor en generaciones sucesivas, lo que se correlaciona con el aumento del nº de tripletes Edad aparición síntomas severidad Nº repeticiones
Gatchel JR, Zoghbi HY (2005) Nature Reviews Genetics 6: 743-754.
Disomía uniparental ambos cromosomas homólogos provienen del mismo progenitor Usualmente el origen está en una recuperación o compensación de una trisomía que sería letal
Disomia uniparental
IMPRONTA GENETICA modificaciones del material genético (silenciamiento génico) que ocurren dependiendo de si el alelo proviene del padre o de la madre Resultan en una expresión diferencial según sea la copia materna o paterna identificados en mamiferos y plantas superiores Mutaciones en los genes con impronta genetica dan un patron inusual de herencia Puede deberse a presión evolutiva en genes implicados en crecimiento y desarrollo????
CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN Pérdida de función de genes en el cromosoma 15 que sólo se expresan del cromosoma paterno (PW) o materno (Angelman) La pérdida de función puede deberse a deleciones, disomias uniparentales, mutaciones o errores en la impronta. deleción 15q11-13 : PWS resulta de una deleción en el cromosoma paterno AS resulta de una deleción en el cromosoma materno
CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN disomia uniparental : PWS resulta de dos crom. 15 maternos AS resulta de dos crom. 15 paternos
El genoma mitocondrial no es autónomo mtdna DNA nuclear OTRAS PROTEÍNAS NUCLEARES: LAS IMPLICADAS EN REPLICACIÓN, TRANSCRIPCION Y TRADUCCIÓN
Genoma mitocondrial 37 genes: 22 trnas 2 mt rrna 13 mrnas - En el la matriz mitocondrial - cada mitocondria puede contener 2-10 copias de mtdna - Hay miles de copias de mtdna por célula
Enfermedades del DNA mitocondrial ~ 1/15000 adultos Herencia materna Heteroplasmia = diferente % de mitocondrias normales y mutantes en cada célula o tejido. Las células reciben diferentes poblaciones de mitocondrias normales y mutantes
Características de las enfermedades mitocondriales Los síntomas se manifiestan sobre todo a nivel de tejidos muy dependientes de energía en forma de ATP - cerebro, corazón, músculo, oído Muy variables genética y clínicamente (el mismo síndrome pude deberse a diferentes mutaciones o el mismo defecto genético tener una presentación clínica diferente) el fenotipo dependerá de: gen(es) implicados tipo de mutación (missense/nonsense/deleción) % mitocondrias normales vs anormales tejido implicado
SOLO 20% DE LOS PACIENTES DEFICIENTES EN OXPHOS TIENEN MUTACIONES EN mtdna El resto de pacientes tienen defectos en genes nucleares: Defectos en genes estructurales de los complejos Defectos en la comunicación entre genomas nuclear y mt Defectos en ensamblaje, homeostasis o importe de las proteínas de los complejos
The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. Smeitink et al (2001) Nat Rev Genet 2: 342-352 Mitochondrial disease-its impact, etiology and pathology. McFarland et al (2007) Curr Topics in Dev Biol 77: 113-143.