TEMA 12 Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Tema 12. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 1. Nacimiento de la era de los antibióticos 2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 2.1. En surco 2.2. Con tiras de papel 2.3. En caldo 2.3.1. Cálculo de la CMI 2.3.2. Cálculo de la CMB 2.4. Con discos de papel 2.4.1. Estandarización del medio de cultivo 2.4.2. Estandarización del inóculo 2.4.3. Estandarización de los discos 2.4.3.1. Concentración de algunos antimicrobianos 2.4.4. Condiciones de incubación y lectura de los resultados 2.4.5. Cepas bacterianas para control de calidad de las pruebas 2.4.6. Fundamento de la prueba de Bauer-Kirby 2.4.6.1. Correlación entre el halo de inhibición y la CMI 2.4.6.2. Ejemplos de sensibilidad/resistencia 2.4.6.3. Resultados atípicos 2.4.7. Limitaciones de la prueba de Bauer-Kirby
Tema 12. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 3. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos con determinación de la CMI 3.1. Técnica de dilución en caldo 3.2. Técnica de dilución en agar 3.3. Técnica de microdilución en caldo 3.4. Test Épsilon
1. Nacimiento de la era de los antibióticos Penicilina 1929 Estreptomicina 1943 Gramicidina y tirocidina 1943 Clortetraciclina 1944
2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 2.1. En surco 2.2. Con tiras de papel Realizada por Fleming
2.3. En caldo Efectuar diluciones dobles del antibiótico en un medio de crecimiento líquido Concentración (mg/l) Añadir una concentración baja (aproximadamente 10.000/ml) de las colonias de prueba a cada dilución Concentración (mg/l) Observar el crecimiento tras 18-24 h de incubación a 37 ºC Concentración (mg/l) CMI = 0,25 mg/l
2.3.1. Cálculo de la CMI CMI = 2 mg/l
2.3.2. Cálculo de la CMB CMB = 1 mg/l
2.4. Con discos de papel Prueba de Bauer-Kirby Zona de inhibición
2.4.1. Estandarización del medio de cultivo Agar de Müeller-Hinton Infusión de carne de vaca Casaminoácidos Almidón Agar 300 g/l 17,5 g/l 1,5 g/l 17 g/l Características Permite crecer a la mayoría de los patógenos Transparente No tiene PABA ph Espesor
2.4.2. Estandarización del inóculo Tomar 4-5 colonias Resuspender en TSB Incubar hasta turbidez 0,5 de MacFarland Sembrar tres veces rotando la placa 120º
2.4.3. Estandarización de los discos Colocación manual desde el tubo Discos de alto poder (10-300 µg de los antibióticos) Control calidad (FDA) Posición Colocación manual o con un dispensador No mover Colocación con un dispensador automático Colocación manual con pinzas estériles
2.4.3.1. Concentración de algunos antimicrobianos
2.4.4. Condiciones de incubación y lectura de los resultados Incubación Observación de los halos de inhibición Medida de los diámetros de los halos
2.4.5. Cepas bacterianas para control de calidad de las pruebas
2.4.6. Fundamento de la prueba de Bauer-Kirby
2.4.6.1. Correlación entre el halo de inhibición y la CMI Elaborado por el CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute)
2.4.6.2. Ejemplos de sensibilidad/resistencia Para Staphylococcus aureus
2.4.6.3. Resultados atípicos Microorganismos invasores Colonias aisladas dentro del halo
2.4.6.3. Resultados atípicos Superposición de halos de inhibición Placas deficientemente inoculadas
2.4.7. Limitaciones de la prueba de Bauer-Kirby Microorganismos de desarrollo lento Microorganismos anaerobios Antibióticos de difusión lenta Los resultados se refieren a los niveles de antibióticos que se pueden conseguir en suero Los resultados no se extrapolan necesariamente a todos los antibióticos de un mismo grupo
3. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos con determinación de la CMI Técnica de dilución en caldo Técnica de dilución en agar Técnica de microdilución en caldo Test de Épsilon (E-test) 3.1. Técnica de dilución en caldo
3.2. Técnica de dilución en agar 32 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 4 µg/ml 2 µg/ml Inoculación Incubación............................. Lectura
3.2. Técnica de dilución en agar Replicador manual Replicador de Steers
3.2. Técnica de dilución en agar
3.2. Técnica de dilución en agar Ventajas 32-36 microorganismos Control de calidad Placas comerciales Barata Automatización Adecuada para laboratorios con gran volumen de trabajo CMI
3.3. Técnica de microdilución en caldo Ventajas 10-12 antibióticos diferentes Más microorganismos a menos antibióticos Pipetas multicanal Lectura automatizada Resultados en 4 horas
3.4. Test Épsilon E-test (tiras patentadas, AB Biodisk, Suecia) Gradiente logarítmico de concentración Zona de inhibición elipsoidal (no circular) Valor de la CMI en la escala Método cómodo, pero caro, no para uso rutinario CMI
3.4. Test Épsilon CMI = 2 mg/l CMI = 0,64 mg/l