TEMA 14. Métodos inmunológicos para la identificación microbiana

TEMA 14 Métodos inmunológicos para la identificación microbiana

Tema 14. Métodos inmunológicos para la identificación microbiana 1. Introducción 2. Detección de antígenos 2.1. Obtención de anticuerpos 2.2. Marcado de las inmunoglobulinas 2.3. Técnicas de detección 2.3.1. Aglutinación indirecta 2.3.2. Inmunofluorescencia 2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) 3. Detección de anticuerpos 3.1. Clases de antígenos 3.2. Muestras de suero 3.3. Pruebas serológicas 3.3.1. Aglutinación directa 3.3.2. Inmunofluorescencia 3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

1. Introducción Antígenos y anticuerpos son complementarios antígeno anticuerpo posible detectar anticuerpo específico (suero) posible detectar antígeno específico (muestra) Pruebas para detección de anticuerpos: pruebas serológicas (suero) Reacciones inmunológicas portaobjetos tubos convencionales (plástico o vidrio) 12 x 100 mm placas de microtitulación (micropocillos 8 mm ø y 12 mm alto)

2. Detección de antígenos Algunas de estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico rápidas (confirmadas por otras) técnicas de referencia (elevada eficacia) Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas, económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas) Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso) establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayor probabilidad)

2.1. Obtención de anticuerpos Anticuerpos policlonales (animales inmunizados) monoclonales (producidos in vitro) Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de su fragmento Fc a: base de un pocillo de plástico superficie de una membrana Sitio de unión Anticuerpo partículas inertes (látex, gelatina, oro coloidal) Antígeno Fragmento o región Fc

2.2. Marcado de las inmunoglobulinas Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antígenos y otros anticuerpos Marcado del fragmento Fc con: Enzimas (β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano) - actúan sobre sustrato - transformación en producto coloreado (o diferente color) Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina, umbeliferona, lantánidos) - producen luz cuando son excitadas por radiación incidente Sustancias lumínicas (luminol, isoluminol, ésteres de acridina, adamantil dioxietano) - producen luz (reacción química, oxidación, quimioluminiscencia)

2.3. Técnicas de detección Si el microorganismo buscado no está en la muestra los anticuerpos no se unen a él no se produce señal Si el microorganismo está presente en la muestra los anticuerpos se unen a él se producirá el efecto o la señal correspondiente - aglutinación - cambio de color del sustrato - fluorescencia - luz

2.3.1. Aglutinación indirecta Anticuerpos adheridos por región Fc a: partículas grandes de látex (poliestireno, 1-5 µm) otras partículas inertes Facilita la observación de la aglutinación: formación de grumos (de gran tamaño) Permite detección de antígenos solubles (polisacárido) Realizable sobre portaobjetos

2.3.1. Aglutinación indirecta Rápida (minutos) Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanálisis Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antígenos víricos (menor cantidad que bacterianos)

2.3.2. Inmunofluorescencia Directa (IFD) Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes se fijan a los microorganismos Microscopio de fluorescencia Virus microorganismo brillante sobre fondo oscuro no pueden ser observados (pequeño tamaño) se pueden detectar proteínas víricas (producidas durante multiplicación) - anticuerpos específicos para esas proteínas

2.3.2. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Utiliza dos anticuerpos: - Primero - Segundo no marcado se une al antígeno dirigido contra el primero (anti-anticuerpo) está marcado permite revelar diferentes anticuerpos específicos no marcados

2.3.2. Inmunofluorescencia

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) ELISA: enzyme linked immunosorbent assay Método directo Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado). Se añade muestra al pocillo: antígeno presente reacción Ag - Ac Se añade segundo anticuerpo dirigido contra el antígeno marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Técnica en pocillos Técnica sobre nitrocelulosa

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Método indirecto ( sandwich ) Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado). Se añade muestra al pocillo antígeno presente reacción Ag - Ac Anticuerpo anti-ig unido a enzima Sustrato incoloro Se añade un segundo anticuerpo generalmente policlonal Anticuerpo de detección Producto coloreado dirigido contra el antígeno Antígeno diana Se añade un tercer anticuerpo dirigido contra el segundo anticuerpo Anticuerpo de fijación (o de captura) marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Se añade sustrato (incoloro) Actúa enzima sobre sustrato Aparece color Segundo anticuerpo (o tercero) Enzima Sustrato sin color Producto coloreado se puede medir intensidad (colorímetro) Si no existe antígeno buscado no es retenido en el pocillo es eliminado mediante lavado al añadir sustrato no se produce color

3. Detección de anticuerpos Método de diagnóstico indirecto Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente) Técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos La mayoría permiten cuantificar los anticuerpos del suero 3.1. Clases de antígenos Naturales microorganismos íntegros extractos antigénicos (más o menos purificados) obtenidos de ellos Recombinantes se obtienen por ingeniería genética

3.2. Muestras de suero Extraer sangre (5-10 ml) Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos) Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero) Guardar suero 4-6ºC (una semana; -20ºC (años, si se evita descongelar y congelar repetidamente) 3.3. Pruebas serológicas Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales Aglutinación directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (más utilizadas) 3.3.1. Aglutinación directa Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulación Antígeno (suspensión del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinación

3.3.1. Aglutinación directa Patrón característico Tubo - sobrenadante transparente - formación de muchos grumos (al resuspender el sedimento) Pocillos - sedimento amplio y granulado (reacción positiva) - botón puntiforme central (reacción negativa) Permite la cuantificación de anticuerpos mediante el cálculo del título de anticuerpos

3.3.2. Inmunofluorescencia

3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) Antígeno Anticuerpo secundario anti-anticuerpo del paciente Enzima Sustrato sin color Pocillo o membrana Anticuerpo primario del paciente producido contra el antígeno (microorganismo) Producto coloreado