Métodos para el estudio de microorganismos

Métodos para el estudio de microorganismos Técnicas microscópicas Campo claro Campo obscuro Contraste de fases I.D. de Nomarski Fluorescencia Confocal Electrónica de barrido Estereoscópica (magnificación) Métodos para el cultivo bacteriano Medios de cultivo Técnicas de sembrado Aislamiento de cepas Pruebas de susceptibilidad Conc. mínimas inhibitorias (MIC) Conc. mínimas bactericidas (MBC) Antibiogramas (Kirby-Bauer) Identificación fenotípica Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al oxígeno Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares Identificación genética Hibridaciones DNA-DNA PCR Secuenciación 16S rrna

Métodos para el estudio de microorganismos Métodos para el cultivo bacteriano Medios de cultivo Técnicas de sembrado Aislamiento de cepas

Métodos para el cultivo bacteriano Curva de crecimiento bacteriano (in vitro) Cuentas viables/ml (10 log ) 10 9 8 7 6 5 Fase de latencia Periodo de aceleración Fase exponencial Periodo de retardo Fase estacionaria Fase de declinación 4 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Tiempo (hrs)

Medios de cultivo Medios generales y enriquecidos Nutricionalmente complejos favoreciendo el crecimiento de un gran número de especies Pueden ser semi-selectivos variando su composición, ph y condiciones de cultivo (O 2, C, etc.) USO: aislamiento primario para recuperación amplia de microorganismos y mantenimiento de cepas EJEMPLOS: agar nutritivo, infusión cerebro-corazón, soya-tripticasa, agar sangre, agar chocolate, NHK, etc. Medios selectivo Nutricionalmente pobres con componentes que estimulan e inhiben el crecimiento de cepas específicas Inhiben el crecimiento de la mayoría de especies y favorecen el de un númeroreducidode microorganismos USO: aislamiento primario de microorganismos específicos EJEMPLOS: agar mitis-salivarius, agar Salmonella-Shigella, medio Thayer-Martin, etc. Medios diferenciales Por definición son también selectivos Permiten la identificación de actividades metabólicas específicas USO: aislamiento primario de microorganismos específicos EJEMPLOS: agar MacConkey, agar manitol salado, agar eosina-azul de metileno, etc.

Técnicas de sembrado Estría simple Estría cuádruple Estría triple

Aislamiento de cepas Obtención de la muestra Dispersión y dilución 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 4.5 ml 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Sembrado Cultivo Conteo X X X Confluyente Confluyente >300 UFCs 30-300 UFCs ( 150 UFCs) 30-300 UFCs ( 50 UFCs) X <30 UFCs

Conteo de colonias CCCCCCCCCCCC UUUUUUUU vvvvvvvvvvvvvv dddd ddddssssssssssssónn (μμμμ) vvvvvvvvvvvvvv ssssssssssssssss (μμμμ) vvvvvvvvvvvvvv dddd ddddddddddddddddónn (mmmm) ffffffffffff dddd ddddddddddddónn = UUUUUUUU/mmmm 10-3 500 µl 10-4 5555 UUUUUUUU 55555555 μμμμ 1111, 000000 111111 μμμμ = 55 mmmm 4.5 ml 100 µl 222222, 000000 UUUUUUUU 1111, 000000 111111 μμμμ = 55 mmmm 22, 555555 UUUUUUUU 1111, 000000 = 55 mmmm 2222, 000000, 000000 UUUUUUUU = 55, 000000, 000000 UUUUUUUU/ml = 55 1111 66 UUUUUUUU/mmmm 55 mmmm 30-300 UFCs ( 50 UFCs)

Propagación de cepas Propagación Aislamiento Medio Enriquecido Medio Selectivo

Métodos para el estudio de microorganismos Identificación fenotípica Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al oxígeno Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares

Identificación fenotípica Definición Aplicación Ventajas Desventajas Secuencia consecutiva de métodos de microbiología tradicional que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o en paralelo a la identificación Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas En comparación a la identificación genética: Más laborioso Mayor tiempo y costo Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Subestimación de especies fastidiosas No permite la identificación de especies no-cultivables

Identificación fenotípica- Diagrama de flujo Tinción de Gram Morfología celular Motilidad Tolerancia al O 2 Morfología de colonia Tipificación bioquímica Perfiles de proteínas celulares

Identificación fenotípica- Tinción de Gram Gram positivo Gram negativo

Identificación fenotípica- Morfología celular Coco Bacilo Espirilo Pleomórfico

Identificación fenotípica- Motilidad Contraste de Fases Campo Obscuro En Agar Sin motilidad De nado (Swimming) De deslizamiento (Glidding) En espasmos (Twitching) Tubo de Punción

Identificación fenotípica (Tolerancia al oxígeno) Anaerobio estricto (en ausencia de O 2 ) Microaerofílico (en conc. bajas de O 2 ) Capnofílico (en presencia de CO 2 ) Anaerobio facultativo (en presencia/ausencia de O 2 ) Aerobio estricto (en presencia de O 2 )

Identificación fenotípica- Morfología de colonia Color Tamaño Forma Textura Consistencia Periferia Adherencia al agar Formación de fosas Propiedades hemolíticas Fluorescencia con luz UV

Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica Fermentación de carbohidratos Productos terminales Catalasa Oxidasa Coagulasa Reacciones de aglutinación

Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)

Métodos para el estudio de microorganismos Pruebas de susceptibilidad Conc. mínimas inhibitorias (MIC) Conc. mínimas bactericidas (MBC) Antibiogramas (Kirby-Bauer)

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana CONSIDERACIONES GENERALES Todas las pruebas que se discutirán, dependen del cultivo bacteriano in vitro Requieren de un tiempo relativamente largo para la obtención de resultados (3-7 días) No infieren sobre la susceptibilidad bacteriana en biopelículas Sólo permiten la evaluación de especies cultivables Son aplicables únicamente para cultivos puros

Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) Definición Concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento visible de microorganismos después de su cultivo en presencia del agente Aplicación Estándar de oro en pruebas de susceptibilidad para diagnóstico e investigación Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis, septicemia, osteomielitis, pacientes inmunosuprimidos, infecciones de prótesis y cuando no ha habido una buena respuesta a pesar de haber tenido resultado de S con antibiogramas En pacientes críticos para quienes se requiere una MIC exacta ( 10 diluciones) Ventajas Desventajas Proporciona concentraciones útiles clínicamente Permite establecer puntos de corte de sensibilidad y resistencia En comparación a los antibiogramas: Técnicamente más laborioso Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados Es más costoso

Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) Suspender en caldo Transferir a pozos Caldo con diferentes conc. de 12 antibióticos Ajustar D.O. de 10 4 a 10 6 Incubar Conc. sugeridas 512 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 4 µg/ml 2 µg/ml 1 µg/ml 0.5 µg/ml 0.25 µg/ml 0.12 µg/ml 0.06 µg/ml 0.001 µg/ml 32 µg/ml 16 µg/ml 8 µg/ml 4 µg/ml 2 µg/ml 1 µg/ml 0.5 µg/ml MÉTODO DE DILUCIÓN EN CALDO Control* *Sin antibiótico Aplicación: Bajo número de cepas contra número elevado de antibióticos Estándares: CLSI (antes NCCLS) Metronidazol Eritromicina Vancomicina Clindamicina Amoxicilina Ampicilina Ciprofloxacina Cloranfenicol Amikacina Kanamicina Norfloxacina Gentamicina Determinar MIC a cada antibiótico

Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) Incubar Suspender en caldo Transferir a pozos (S/A) Control* 0.5 µg/ml 1 µg/ml 2 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml 32 µg/ml Ajustar D.O. de 10 4 a 10 6 Replicar en placas de agar MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR Aplicación: Elevado número de cepas contra bajo número de antibióticos Estándares: CLSI (antes NCCLS) Agar con diferentes conc. de 1 antibiótico *Sin antibiótico Determinar MIC de cada cepa

Concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) Suspender en caldo Transferir en césped Incubar Ajustar D.O. de 10 4 a 10 6 Colocar tira con antibiótico Determinar MICs MÉTODO DE TIRAS DE GRADIENTE Aplicación: Elevado número de cepas contra elevado número de antibióticos

Interpretación de MICs- La relatividad de la susceptibilidad Interpretación clínica de la susceptibilidad = Resultado de la prueba MIC (µg/ml) + Valores de los puntos de corte No tienen utilidad per se Estándares del CLSI Se interpreta considerando las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica Basados en las concentraciones que el fármaco puede alcanzar en el sitio de la infección después de administrar una dosis terapéutica FARMACOCINÉTICA Dosis, distribución y vida media del fármaco: factores que determinan la concentración alcanzable en el sitio de infección Difiere de fármaco a fármaco, de sitio a sitio y de paciente a paciente Por lo tanto, los puntos de cortes son diferentes para cada agente: Una MIC baja puede representar R a un fármaco y una MIC elevada S a otro por diferencias en sus puntos de corte

Interpretación de MICs- Puntos de corte e índices PD PUNTOS DE CORTE (PC) MIC < PC(1) = S MIC > PC(3) = R PC(2): Puede ser efectivo si la infección se localiza en sitios que concentran al fármaco ó cuando se pueden administrar dosis altas con seguridad ÍNDICES FARMACODINÁMICOS (PDI) Consideran la cinética y dinamia del fármaco junto con la MIC para determinar su efectividad Se compara el coeficiente del punto de corte (MBQ) con el valor de la MIC MBQ = Punto de corte(1) MIC <MIC y >MBQ: >eficacia del fármaco Antibiótico Susceptible (1) PUNTOS DE CORTE Intermedio (2) Resistente (3) EJEMPLOS MIC MBQ Interpretación A. Imipenem 8 16 32 48 0.17 R B. Ampicilina 2 4 8 4 0.5 I C. Cefotaxima 2 4 8 1 2 S D. Clindamicina 16 32 64 2 8 S E. Metronidazol 12 24 48 4 3 S (Concentraciones en µg/ml)

Interpretación de MICs R I S R I R I R I S R I S S S Fármaco A Fármaco B Fármaco C Fármaco D Fármaco E Antibiótico Susceptible (1) PUNTOS DE CORTE Intermedio (2) Resistente (3) EJEMPLOS MIC MBQ Interpretación A. Imipenem 8 16 32 48 0.17 R B. Ampicilina 2 4 8 4 0.5 I C. Cefotaxima 2 4 8 1 2 S D. Clindamicina 16 32 64 2 8 S E. Metronidazol 12 24 48 4 3 S (Concentraciones en µg/ml)

Concentraciones mínimas bactericidas (MBC) Definición Aplicación Ventajas Desventajas Concentración más baja de un fármaco capaz de matar microorganismos, se determina después de subcultivar en agar sin el agente, muestras de caldo sin crecimiento visible en una serie de diluciones para la determinación de MIC Se utiliza con menor frecuencia que las MICs Uso obligado en casos de endocarditis, meningitis y en pacientes críticos Proporciona concentraciones útiles clínicamente Permite identificar el efecto bactericida y bacteriostático del fármaco En comparación a MICs y antibiogramas: Técnicamente más laborioso Requiere mayor tiempo para la obtención de resultados Es más costoso

Concentraciones mínimas bactericidas (MBC) Subcultivo en agar sin antibiótico Incubar MIC: método de dilución en caldo Determinar MBC

Interpretación de MBCs Antibiótico Ejemplos Efecto Penicilinas Cefalosporinas Carbapenems Aminoglucósidos Quinolonas Amoxicilina Ampicilina Cefotaxima Cefalexina Imipenem Meropenem Amikacina Gentamicina Ciprofloxacina Levofloxacina Bactericida Bactericida Bactericida Bactericida Bactericida Lincosaminas Clindamicina Bacteriostático Macrólidos Azitromicina Claritromicina Bacteriostático Tetraciclinas Doxiciclina Minociclina Bacteriostático Nitroimidazoles Metronidazol Bacteriostático Fenólicos Chloramfenicol Bacteriostático Bactericida vs. Bacteriostático Bactericida: MBC 4 veces MIC Bacteriostático: MBC > 4 veces MIC

Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de bacterias, basado en el tamaño de zonas de inhibición de crecimiento alrededor de discos impregnados con diferentes fármacos en un sembrado en césped Determinación rápida (presuntiva) de la susceptibilidad de microorganismos a diferentes antimicrobianos En casos donde se requiere un resultado rápido para la selección y administración inicial del antimicrobiano En comparación a MIC y MBC: Menos laborioso y costoso Requiere menos tiempo para la obtención de resultados No proporciona concentraciones útiles clínicamente Los resultados son un indicador pobre de la efectividad clínica del agente

Antibiogramas- Prueba de Kirby-Bauer Suspender en caldo Sembrado en césped Ajustar D.O. de 10 4 a 10 6 Colocar discos Incubar Medir zonas de inhibición

Interpretación de antibiogramas INTERPRETACIÓN ESTÁNDAR Diámetro 18 mm o radio 6 mm = S Diámetro < 18 mm o radio < 6 mm = R Lo anterior considera discos de 6 mm Los puntos de corte varían específicamente para algunos MO y/o antibióticos La interpretación debe basarse en los estándares vigentes del CLSI El punto de corte intermedio se interpreta igual que en MICs Ejemplo para E. coli y otros bacilos entéricos G(-) PUNTOS DE CORTE Antibiótico Conc. en disco (µg) Resistente Intermedio Susceptible Amikacina 30 14 15-16 17 Ampicilina 10 13 14-16 17 Cefazolina 30 14 15-17 18 Gentamicina 10 12 13-14 15 Tetracyclina 30 14 15-18 19 Ticarcilina 75 14 15-19 20 Trimetoprim 5 10 11-15 16 Tobramicina 10 12 13-14 15 (Diámetro en mm)

Métodos para el estudio de microorganismos Identificación genética Hibridaciones DNA-DNA PCR Secuenciación 16S rrna

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete) Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a otras pruebas genéticas: Es posible cuantificación las especies evaluadas En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a otras pruebas genéticas: Menor sensibilidad y especificidad

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadora que permite su detección después de la hibridación Molécula Reportadora Radioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P 32 ) No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc. Especificidad: determinada por el diseño de la sonda Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda Southern Blot Blanco = DNA Sonda = DNA Northern Blot Blanco = RNA Sonda = DNA Western Blot Blanco = Proteína Sonda = Anticuerpo

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA MiniSlot MiniBlotter Canales abiertos Membrana de nylon Canales de hibridación Membrana de nylon Filtros Socransky et al. Biotechniques 1994

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Socransky et al. Biotechniques 1994

Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA Especie ATCC Especie ATCC Actinomyces georgiae 49285 Actinomyces israelii 12102 Actinomyces meyeri 35568 Actinomyces naeslundii stp. 1 12104 Actinomyces odontolyticus 17929 Actinomyces viscosus 43146 Aggregatibacter actinomycetemcomitans * Campylobacter gracilis 33236 Campylobacter rectus 33238 Campylobacter showae 51146 Capnocytophaga gingivalis 33624 Capnocytophaga ochracea 27872 Capnocytophaga sputigena 33612 Dialister pneumosintes 33048 Eikenella corrodens 23834 Eubacterium nodatum 33099 Eubacterium saburreum 33271 Filifactor alocis 35896 Fusobacterium nucleatum Fusobacterium periodonticum 33693 Neisseria mucosa 19696 Parvimonas micra 33270 Porphyromonas asaccharolytica 25260 Porphyromonas gingivalis 33277 Prevotella intermedia 25611 Prevotella loescheii 15930 Prevotella melaninogenica 25845 Prevotella nigrescens 33563 Propionibacterium acnes 6919 Selenomonas noxia 43541 Streptococcus anginosus 33397 Streptococcus constellatus 27823 Streptococcus gordonii 10558 Streptococcus intermedius 27335 Streptococcus mitis 49456 Streptococcus oralis 35037 Streptococcus sanguinis 10556 Tannerella forsythia 43037 Treponema denticola 35405 Veillonella parvula 10790 * Serotipos a: 43717 & b: 43718 Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256

Métodos genéticos- PCR Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete) Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor sensibilidad En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real) En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas

Métodos genéticos- PCR Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers y extensión para producir múltiples copias de una secuencia determinada de DNA Especificidad: determinada por el diseño de los primers Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula PCR

Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Definición Aplicación Ventajas Desventajas Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rrna en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros En comparación al resto de las pruebas de identificación: Mayor especificidad En comparación a la identificación fenotípica: Menor tiempo y costo Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas Permite la identificación de especies no-cultivables En comparación a la identificación fenotípica: No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA: No permite la cuantificación de especies En comparación a hibridaciones DNA-DNA: Bajo número de especies evaluadas

Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rrna Comparación con bancos de secuencias conocidas Especificidad: hipotéticamente absoluta Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula Secuenciación 16S rrna