POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1 RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON ANTICOAGULANTES ORALES

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS TRABAJO DE GRADO POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1 RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON ANTICOAGULANTES ORALES Por Roybel María Barrios Tovar Octubre, 2010

i UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1 RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON ANTICOAGULANTES ORALES Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Roybel María Barrios Tovar Como requisito parcial para optar al grado académico de Magíster en Ciencias Biológicas Con la asesoría de la profesora Dra. Antonietta Porco Octubre, 2010

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v DEDICATORIA A mi familia, pilar fundamental en mi vida y en especial a la pequeña Mariangel. A todos los que han hecho posible este proyecto.

vi AGRADECIMIENTOS A Dios, por darme vida y mantenerme en pie. A mi familia, mis padres y hermano, que siempre han estado en cada momento de mi vida apoyándome, dándome ánimo y respetando mis tiempos. Gracias por mantener mi Fé. A la Dra. Antonietta Porco, mi tutora, fuente de conocimientos, de apoyo, que me ha brindado siempre su confianza, su paciencia, su orientación; que me impulsó a continuar una y otra vez en este largo camino. Gracias por ayudarme a culminar esta meta en mi vida. Al Dr. Argimiro Torres, por colaborar abiertamente desde el Banco Municipal de Sangre, por ser parte de este proyecto y por fusionar los datos vitales para esta investigación. A los profesores Álvaro Rodríguez y Rosaria Ruggiero, por su puntual ayuda y orientación estadística. Al profesor Henry Caballero por facilitar las herramientas para la digitalización de imágenes. A todas mis compañeras del laboratorio de Genética Molecular Humana B, y otros laboratorios de la USB, siempre prestas a ayudarme, no importa la hora y el día: especiales agradecimientos a Carolina, Silvia, Karlena, Nigmet, May Lyn, Vanesa, Lisette, Loly, Zuhail, gracias a todas de corazón. A todas las instituciones financieras que apoyaron económicamente este proyecto: Fonacit, al Decanato de Estudios de Postgrado de la Universidad Simón Bolívar, a Quimbiotec, C.A. A los que han colaborado desde el Hospital Militar, el Banco Municipal de Sangre, el Hospital Pérez Carreño, el IVIC, Quimbiotec, a los participantes de la Universidad

vii Central de Venezuela y la Universidad Simón Bolívar. A todos los donantes voluntarios, pacientes y controles. A todas las personas que de una u otra manera contribuyeron en la realización y culminación de este trabajo. Para todos ustedes mi sincero reconocimiento y mi eterno agradecimiento

viii UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS POLIMORFISMOS EN EL GEN VKORC1 RELACIÓN CON LA TROMBOSIS VENOSA Y LA TERAPIA CON ANTICOAGULANTES ORALES Por: Barrios Tovar Roybel María Carnet N.: 02-82479 Tutora: Dra. Antonietta Porco Septiembre, 2010 RESUMEN El uso de anticoagulantes como la warfarina, es uno de los tratamientos de elección para la prevención contra eventos tromboembólicos. Éste actúa como antagonista de la vitamina K, interfiriendo en la carboxilación de los factores de la coagulación dependientes de esta vitamina e inhibiendo su función en el proceso de la coagulación. La respuesta al tratamiento con este anticoagulante depende de cada paciente y de la variabilidad interindividual en los requerimientos de la dosis adecuada. Existen factores extrínsecos y genéticos que influyen en la respuesta al fármaco. En cuanto al componente genético, se han descrito polimorfismos en el gen que codifica para el complejo Vitamina K epóxido reductasa sub unidad 1 (VKORC1) relacionados con cambios en la farmacodinámica de la warfarina, la resistencia y sensibilidad en la terapéutica. El objetivo de esta investigación fue determinar las frecuencias genotípicas y alélicas de cinco polimorfismos en éste gen: -1639G>A, 106G>T, 698C>T, 2255C>T y 3730G>A, en controles sanos y en pacientes que han sufrido trombosis venosa y establecer la relación con la patología y la influencia de la variabilidad genética en la respuesta al tratamiento. Para ello, los ADNg aislados de muestras de sangre fueron utilizados para el análisis molecular de cada polimorfismo mediante PCR-RFLP. Los resultados obtenidos mostraron que las frecuencias genotípicas y alélicas tanto en controles como en pacientes fueron similares en ambos grupos, según el polimorfismo estudiado. No hubo asociación entre los genotipos de los polimorfismos y la trombosis venosa, excepto para el SNP -1639G>A, el cual se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el SNP 2255C>T. Los genotipos homocigotos mutados, AA y TT de ambos polimorfismos, fueron

ix asociados a cambios en la respuesta a la warfarina. La dosis media de anticoagulante recibida por los pacientes fue de 5,084 mg/día y ésta disminuye conforme aumenta la edad de los afectados. La información derivada de esta investigación es importante para el médico, porque permitirá ajustar y administrar las dosis adecuadas del fármaco a cada paciente, dependiendo de su genotipo y respuesta al tratamiento. Este es el primer avance en Venezuela asociando variabilidad genética y trombosis venosa. Palabras claves: Warfarina, Trombosis, Polimorfismo, VKORC1

x ÍNDICE GENERAL Página RESUMEN DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS INDICE DE TABLAS INDICE DE FIGURAS ABREVIATURAS viii v vi xiv xvii xix INTRODUCCIÓN 1 OBJETIVOS 4 MARCO TEÓRICO 5 JUSTIFICACIÓN 40 MARCO METODOLÓGICO 42 RESULTADOS 53 DISCUSIÓN 80 CONCLUSIONES 100 RECOMENDACIONES 101 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 102 FINANCIAMIENTO 109 ANEXOS 110

xi ÍNDICE GENERAL Página APROBACIÓN DEL JURADO DECICATORIA AGRADECIMIENTOS RESUMEN ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE TABLAS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS iii v vi viii x xiv xvii xix I. INTRODUCCIÓN 1 II. OBJETIVOS 4 II.1. Objetivo General 4 II.2. Objetivos Específicos 4 III. MARCO TEÓRICO 5 III.1. Coagulación Sanguínea 5 III.2. Trombosis 13 III.2.1. Trombosis Venosa 14 III.3. Factores de Coagulación dependientes de la Vitamina K 17 III.4. Anticoagulantes Orales 19 III.4.1 Warfarina 19 III.4.2. Efecto del Componente Genético en la respuesta al tratamiento con warfarina 24 III.4.2.1. VKORC1 24 III.4.2.2. Polimorfismos en el gen VKORC1 25

xii IV. JUSTIFICACIÓN 40 V. MARCO METODOLÓGICO 42 V.1.Análisis Clínico Descriptivo 42 V.1.1.Población 42 V.1.2. Selección del Grupo Pacientes 42 V.1.3. Selección del Grupo Control 43 V.1.4. Toma de Muestras 43 V.1.5. Recolección de Data Clínica 44 V.2. Diagnóstico Molecular 44 V.2.1. Extracción de ADN genómico 44 V.2.2. Determinación de la concentración de ADN genomico (ADNg) 45 V.2.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa 45 V.2.4. Electroforesis en geles de Poliacrilamida 46 V.2.5. Análisis de Polimorfismos de Nucleótidos Simples 47 V.2.6. Secuenciación 51 V.2.7. Análisis de secuencias 51 V.3. Análisis Estadístico 52 VI. RESULTADOS 53 VI.1. Análisis Clínico Descriptivo 53 VI.2. Diagnóstico Molecular 57 VI.2.1. Aislamiento de ADN genómico 57 VI.2.2. Análisis de los Polimorfismos de Nucleótidos Simples en el gen VKORC1 58 VI.2.2.1 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple -1639G>A en el gen VKORC1. 58 VI.2.2.2 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple 106G>T en el gen VKORC1. 61 VI.2.2.3 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple 698C>T en el gen VKORC1. 63 VI.2.2.4 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple

xiii 2255C>T en el gen VKORC1. 66 VI.2.2.5 Análisis del Polimorfismos de Nucleótido Simple 3730G>A en el gen VKORC1. 69 VI.2.3. Análisis de Secuencias de los SNPs en el gen VKORC1 71 VI.3.Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg en la población 71 VI.4. Asociación de la edad de los pacientes con trombosis venosa y los requerimientos de anticoagulante oral (dosis de warfarina). 72 VI.5. Análisis de asociación por coeficiente de determinación de la dosis de warfarina en relación al polimorfismo genético. 73 VI.6. Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1 y Trombosis Venosa. 75 VI.7. Análisis de asociación entre los polimorfismos del gen VKORC1. 76 VI.8. Análisis de riesgo para los polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1 en relación a la Trombosis Venosa. 78 VI.9. Determinación del Desequilibrio de Ligamiento entre los polimorfismos: -1639G>A y 2255C>T del gen VKORC1 79 VII. DISCUSIÓN 80 VIII. CONCLUSIONES 100 VIII. RECOMENDACIONES 101 IX. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 102 XI. FINANCIAMIENTO 109 XI. ANEXOS 110

xiv ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla I. Tiempo de vida media de los Factores de Coagulación. 22 Tabla II. Clasificación de los SNPs por Haplotipos 29 Tabla III. Principales SNPs en el gen VKORC1 relacionados con la respuesta a la Warfarina que fueron investigados en este trabajo. 39 Tabla IV. Resumen de los SNP en el gen VKORC1 para ser analizados por PCR-RFLP. 48 Tabla V. Identificación de las enzimas de restricción empleadas en el análisis de SNPs por PCR-RFLP. 50 Tabla VI. Características de la población. 56 Tabla VII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo -1639G>A. 61 Tabla VIII. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 698C>T. 66 Tabla IX. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 2255C>T. 68 Tabla X. Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas en la población (grupo control y grupo pacientes) para el polimorfismo 3730G>A. 71

xv Tabla XI. Determinación del Equilibrio de Hardy Weinberg (H-W) para los polimorfismos estudiados en el gen VKORC1 en el grupo control. 72 Tabla XII. Análisis de Varianza mediante ecuación de regresión lineal simple estableciendo los requerimientos de warfarina basados en el polimorfismo y las variantes genotípicas. 74 Tabla XIII. Análisis de riesgo para la trombosis venosa en relación a las variantes genómicas de los SNPs en el gen VKORC1 77 Tabla XV. Resumen de Análisis de Asociación entre los polimorfismos -1639G>A y 2255C>T en el gen VKORC1 78

xvi ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Modelo clásico de la Cascada de la Coagulación. 7 Figura 2. Fases de la coagulación según el nuevo modelo celular. 10 Figura 3. Ciclo de la Vitamina K. 18 Figura 4. Estructura química de la warfarina. 20 Figura 5. Mecanismo de acción de la warfarina. 21 Figura 6. Esquema gráfico de la organización del gen VKORC1. 24 Figura 7. Modelo que propone la topología de VKORC1. 25 Figura 8. Esquema gráfico del gen VKORC1 y sus principales polimorfismos. 35 Figura 9. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B) en el grupo de Pacientes. 54 Figura 10. Grafico de patologías presentadas por el grupo de pacientes. 55 Figura 11. Gráfico de Distribución del Sexo (A) e Histograma de Edades (B) en el grupo Control. 55 Figura 12. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 0,8% de los ADN genómicos (ADNg) aislados. 57 Figura 13.Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de

xvii nucleótido simple -1639G>A presente en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 58 Figura 14. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 59 Figura 15. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 106G>T presente en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 61 Figura 16. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 62 Figura 17. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de Poliacrilamida al 8% de productos de digestión con la enzima RsaI. 63 Figura 18. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 698C>T presente en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 64 Figura 19. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 65 Figura 20. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 2255C>T presente en el gen VKORC1 de algunos

xviii pacientes con trombosis venosa. 66 Figura 21. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 67 Figura 22. Registro fotográfico de una corrida electroforética en gel de agarosa al 1,5% de los productos de amplificación del polimorfismo de nucleótido simple 3730G>A presente en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa 69 Figura 23. Registro fotográfico de dos corridas electroforéticas en gel de poliacrilamida al 8% de productos de digestión analizados por RFLP presentes en el gen VKORC1 de algunos pacientes con trombosis venosa. 70

xix LISTA DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxi nucleico ADNg: Ácido desoxi nucleico genómico ADP: Adenosin di fosfato APC: Proteína C activada AT III: Antitrombina III AT: Antitrombina Ca +2 : Cálcio CYP2C9: citocromo P450, sub familia 2C dntps: Desoxi ribonucleotidos tri fosfatos EDTA: Ácido tetra etilendiamino EP: Embolismo pulmonar ETV: Enfermedad trombo embolítica venosa FT: Factor Tisular GGCX: Enzima γ glutamil carboxilasa GLA: Ácido γ carboxiglutámico GLU: Ácido glutámico INR: Indice internacional normalizado KH 2 : Vitamina K quinol Min.: Minuto ml: Mililitro mm: Mili molar o C: Grados Celsius PAI-1: Inhibidores de los activadores del plasminógeno 1 pb: Pares de bases PC: Proteína C PCR: (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la polimerasa PIG2: Prostaciclina I 2 PS: Proteína S

xx RFLP: (Restriction Fragment Length Polymorphism) polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción SNP: Polimorfismo de nucleótido simple TAFI: Inhibidor fibrinolítico dependiente de la trombina TFPI: Inhibidor fisiológico de la vía del factor tisular TM: Trombomodulina t-pa: Activador tisular del plasminógeno TVP: Trombosis venosa profunda UTR: Región no traducida VKO: Vitamina K epóxido VKOR: Vitamina K epóxido reductasa VKORC1: Complejo 1 de la vitamina K epóxido reductasa VKR: Vitamina K oxido reductasa ηm: Nano molar ηm: Nanómetro μg: Microgramo μl: Microlitro

1 I. INTRODUCCIÓN La trombosis es un trastorno vascular que se presenta cuando el proceso de coagulación o hemostasia secundaria se ve alterado, tanto en su activación como en su regulación, ocasionando la formación de un trombo o coágulo. Cuando esto sucede se bloquea de forma total o parcial el flujo sanguíneo. Esta es una enfermedad potencialmente grave, ya que la oclusión del flujo sanguíneo conlleva a la falta de oxigenación del tejido u órgano que abastece y en consecuencia, por falta de irrigación provoca el daño orgánico, incluso la muerte (Benítez y col., 2004). Una de las terapéuticas más usadas en la práctica clínica a nivel mundial, indicada en la prevención y tratamiento de pacientes con desordenes trombóticos venosos y arteriales, es la anticoagulación oral (D Andrea y col., 2005). Entre las drogas anticoagulantes de administración oral más utilizada, está la warfarina, la cual es un derivado cumarínico y fue introducida en el mercado hace más de 60 años. Ésta es usada en todo el mundo en la profilaxis y tratamiento del tromboembolismo arterial y venoso, para la prevención primaria y secundaria de ambas patologías (Osman, 2007). Es un efectivo anticoagulante que actúa por antagonismo de la vitamina K, inhibiendo la acción de factores de coagulación dependientes de esta vitamina (Caldwell y col., 2007). Las proteínas o factores vitamina K dependientes juegan un papel muy importante en la activación del proceso de coagulación sanguínea, así como en el mecanismo natural de anticoagulación, lo que es importante para mantener un adecuado flujo sanguíneo (Wang y col., 2006). En ausencia de la vitamina K o en presencia de anticoagulantes, como la warfarina, estas proteínas no pueden ejercer su papel en la coagulación, evitándose así la formación de trombos. La terapia con anticoagulantes orales para contrarrestar la trombosis, debe realizarse con un cuidado especial en cuanto a la dosis a aplicar, porque no sólo se emplea con el objetivo de evitar complicaciones de la patología en sí, sino que debe

2 asegurarse en todo momento, que las dosis sean adecuadas para no ocasionar sangrado, o al menos reducir el riesgo de hemorragias (Benítez y col., 2004). La respuesta a la warfarina entre pacientes es muy amplia y diversa, por lo que el uso de la misma dosis para todos los pacientes puede ocasionar distintas respuestas. Las diferencias terapéuticas de la warfarina dependen de la variación inter e intra individual de la población (Yuan y col., 2005). Esto es, que existen factores ambientales y adquiridos que pueden modificar la acción de la droga, como lo son la absorción de vitamina K, el consumo de alimentos ricos en esta vitamina, la edad, el índice de masa corporal, la co-medicación, así como el componente genético (Scott y col., 2008. Gage y Lesko, 2008). En relación al componente genético, se ha asociado cambios en la respuesta a la warfarina con la presencia de variantes de los genes que codifican para la citocromo P450, sub familia 2C (CYP2C9), enzima encargada del metabolismo de la warfarina y para el complejo 1 de la vitamina K epóxido reductasa (VKORC1), el cual es responsable de reducir la forma oxidada de la vitamina K de manera cíclica. Se ha sugerido que alteraciones en los genes que conlleven a cambios en estas proteínas, pudieran provocar alteraciones en la farmacogenética y farmacodinámica de la warfarina (Rettie y Tai, 2006). Específicamente para VKORC1, se han realizado investigaciones donde se ha establecido la relación entre algunas alteraciones del gen con la resistencia a la warfarina (Rieder y col., 2005. Scott y col., 2008). Si bien estos resultados son de referencia, no expresan necesariamente la realidad de la población latinoamericana (Marsh y col., 2006). Las alteraciones en el gen que codifica para la VKORC1 también han sido asociada tanto a los desordenes hemorrágicos como a los tromboembólicos, como es el caso de la trombosis venosa. Es posible que ciertas modificaciones en VKORC1 tengan una influencia en el ciclo de oxido reducción de la vitamina K, principalmente en la activación de ciertas proteínas responsables de la constitución

3 del trombo. Así mismo, alteraciones que afectan la capacidad de unión de la warfarina pueden modificar su efecto, causando distintas respuestas al tratamiento (Rost y col., 2004). En Venezuela, no se han realizado hasta ahora, estudios moleculares que permitan establecer un programa coordinado de terapéutica, para pacientes con trombosis venosa sometidos a tratamientos con anticoagulantes orales, ni se ha establecido si existe alguna asociación entre los genotipos de los polimorfismos presentes en el gen VKORC1 y la trombosis venosa. Es por ello que es conveniente realizar un estudio que permita identificar y determinar la frecuencia de polimorfismos en este gen. Basado en lo que previamente se ha señalado, en este trabajo se investigó la relación entre los genotipos de algunos polimorfismos en el gen VKORC1, con la trombosis venosa y con la resistencia al tratamiento con anticoagulantes orales. Este trabajo está enmarcado en el proyecto de grupo titulado "Diagnóstico de polimorfismos asociados a la trombosis arterial y venosa que se lleva a cabo entre el Laboratorio de Genética Molecular Humana B, de la Universidad Simón Bolívar, el Banco Municipal de Sangre de Caracas, Hospital Dr. Miguel Pérez Carreño y el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas.

4 II. OBJETIVOS II.1. OBJETIVO GENERAL Determinar la frecuencia genotípica de los polimorfismos en el gen VKORC1, en pacientes con trombosis venosa e individuos sanos en la población de Venezuela y establecer su relación con la patología y la respuesta al tratamiento anticoagulante. II. 2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar en pacientes con trombosis venosa la frecuencia genotípica de los polimorfismos -1636G>A, 106G>T, 968C>T, 2255C>T y 3730G>A en el gen VKORC1, mediante PCR y RFLP. Establecer la frecuencia genotípica de los diferentes polimorfismos del gen VKORC1, en individuos sanos (población no afectada). Establecer la relación de los genotipos de los polimorfismos encontrados en VKORC1 con la trombosis venosa y la respuesta al tratamiento anticoagulante.

5 III. MARCO TEÓRICO III.1. Coagulación Sanguínea En condiciones normales, la sangre fluye a través de los vasos sanguíneos del organismo sin provocar activación en sus componentes celulares. Eventualmente, pueden activarse los sistemas de coagulación para formar un coagulo (condiciones fisiológicas) o un trombo (patológico), ya que al producirse alguna lesión que genere una alteración de la fisiología vascular, tanto en el endotelio como sub endotelio (fibroblastos, proteínas de la matriz), se desencadena un proceso denominado hemostasia (Colman, 2006). La hemostasia comprende un conjunto de mecanismos, cuya principal función es promover el cese fisiológico del sangrado, cuando se presenta un trauma, una cirugía o una enfermedad que alteren la pared vascular, garantizando la fluidez de la sangre dentro del sistema vascular. En este proceso, interactúan un conjunto de elementos, que se localizan en el punto de la lesión, con la finalidad de formar una barrera estructural que impida la pérdida de sangre, lo que involucra un cambio de estado físico de líquido a sólido, con la formación de fibrina, y el enlace del coágulo en una malla insoluble. Las características de la coagulación sanguínea requieren que las reacciones implicadas en el proceso sean localizadas en el lugar de la lesión, sigan un proceso de amplificación, respondan a un sistema de regulación, sean autolimitadas y que ocurran en un tiempo relativamente muy corto (Quintana, 2002). Durante el proceso de coagulación sanguínea se pueden definir distintas etapas secuenciales que se inician con la vasoconstricción. Posteriormente se forma un tapón hemostático primario bastante inestable, conformado principalmente por plaquetas y glóbulos rojos, que luego es reforzado por una a serie componentes que finalizan con la formación de un coagulo estable de fibrina, el cual será disuelto posteriormente. Debido a su importancia, se ha estudiado por muchos años el proceso de coagulación sanguínea, dividiéndolo en tres fases principales: vasoconstricción, hemostasia primaria y hemostasia secundaria; dependiendo de los

6 componentes que se activan, los cuales están estrechamente relacionadas entre sí y son necesarios para subsanar el problema. Finalmente, se suma a estos tres importantes procesos un mecanismo denominado fibrinólisis, encargado de la disolución final del coágulo, una vez reparado el daño en el endotelio o solventado el procesos hemorrágico (Pérez, 2006). Específicamente, el proceso de vasoconstricción surge como respuesta inmediata a la lesión, con la finalidad de disminuir el diámetro del vaso sanguíneo y retrasar de alguna manera la hemorragia. Simultáneamente y unos segundos después, el sistema plasmático libera al torrente sanguíneo una serie de sustancias que provocan la agregación de las plaquetas, que en condición normal circulan de manera desagregadas y no se adhieren al endotelio. Esta fase, conocida como hemostasia primaria, comprende, la adhesión, la activación y la agregación de las plaquetas entre sí, por una serie de modificaciones internas, además de la liberación del contenido de sus gránulos, así como de calcio, ADP, tromboexano A2, entre otras sustancias que mantienen el proceso activado. La función de las plaquetas es primordial para el desarrollo del proceso que prosigue, llamado cascada de la coagulación y que esta integrado por diversos factores proteicos, iones y fosfolípidos. A esta etapa se le denomina, hemostasia secundaria (Centurión, 2000). La coagulación sanguínea o hemostasia secundaria, consiste de una serie de reacciones que van activando proteínas, que finalizan con la formación de trombina, enzima proteolítica con la capacidad de transformar fibrinógeno en fibrina. Desde hace más de 100 años se ha estado estudiando una serie de proteínas que intervienen en la coagulación, inicialmente de forma aislada y hoy en día de manera conjunta, lo que permite entender la amplificación del proceso (Forastiero y Martinuzzo, 2006). De acuerdo a lo que señala Pérez y Bover en el 2007, para la década de los 60, el modelo de la coagulación presentado por MacFarlane (1964) fue de gran utilidad para dar a conocer la complejidad de la formación del trombo. Desde

7 entonces se comenzó a describir al proceso de la coagulación en forma de cascada, como una ruta con dos vías: la extrínseca iniciada por el factor tisular y el factor VII; y la intrínseca, en la que ocurre la activación de los factores XII, XI, IX, VIII y V. Ambas vías convergen en una vía común para activar el factor X y continuar conjuntamente el proceso de transformación de la protrombina en trombina y, a través de la trombina del fibrinógeno en fibrina y formar finalmente el coágulo estable (Figura 1). Figura 1. Modelo clásico de la Cascada de la Coagulación. Vía intrínseca, extrínseca y común. (Tomado de: Quintana, 2002) El modelo clásico de la cascada de la coagulación propone que la activación de los factores de coagulación se produce de manera secuencial, cada factor sirve de sustrato para el siguiente. Este proceso se inicia cuando un fragmento polipeptídico de una proteína convierte un zimógeno inactivo en una enzima activa. El sitio activo de las enzimas de este proceso, excepto del factor XIII activado (XIIIa), es un residuo de un aminoácido serina, por lo que se denominan serin proteasas, de esta forman cumplen su actividad catalítica (Diaz y Almargo, 2001). En este modelo clásico, la activación de los factores de la coagulación comienza cuando el factor XII se une a la superficie subendotelial cargada negativamente y expuesta por daño del endotelio vascular. El factor XII se autoactiva, transformándose a factor XII activado (XIIa). El factor XIIa produce la escisión proteolítica y la activación del factor XI a

8 factor XIa, éste a su vez, activa al factor IX convirtiéndolo a factor IXa, proceso que requiere de calcio. Finalmente, el factor IXa produce la activación del factor X, esta fase también requiere de calcio, de los fosfolípidos de superficie y de un cofactor glicoproteíco, el factor VIIIa. Con la activación del factor X culmina la vía intrínseca (Figura 1) (Centurión, 2000). La activación del factor X puede producirse independientemente de la activación del factor XII por la vía intrínseca. Las proteínas liberadas al medio por los tejidos del epitelio vascular lesionado, actúan como un cofactor para la activación del factor X por el factor VII. El factor Tisular permite la activación del factor VII a factor VIIa, y se forma el complejo FT-VIIa, el cual promueve, en presencia de calcio y los fosfolípidos de las plaquetas, la activación del factor X. De esta manera se completa la activación de la vía extrínseca. Se conoce que el factor VIIa también puede activar al factor IX uniendo así ambas vías. Por eso se apoya el hecho que ambas rutas comparten sistemas de activación y amplificación, mediante los factores XIIa, IXa y VIIa. (Figura 1) (Colman, 2006). Basados en esta complementariedad, el factor Va, el factor plaquetario 3 que actúa como catalizador y el calcio, conjuntamente con el factor Xa transforman la protrombina (factor II) a trombina (factor IIa) en una vía común (Figura 1). La trombina formada, previamente escinde a la molécula de fibrinógeno en monómeros solubles de fibrina que luego se unen para formar una matriz soluble de fibrina. El factor estabilizante de fibrina (factor XIII) activado por la trombina transforma las fibras solubles de fibrina en un coágulo insoluble (Diaz y Almargo, 2001). En los últimos años, se ha propuesto que a nivel fisiológico el mecanismo de la coagulación ocurre a través de un proceso cuyo modelo propone la participación de un componente celular (el plaquetario, las células endoteliales y fibroblastos) como complemento a los factores de coagulación previamente descritos (Monroe y Hoffman, 2006). Este modelo resalta la importancia que desempeña las diferentes células en la iniciación, amplificación, progreso y terminación de todo el proceso de

9 coagulación; las reacciones ocurren sobre la superficie de las plaquetas y el endotelio vascular, que de alguna manera median o controlan en tiempo la generación del tapón hemostático. Los aportes de los nuevos estudios se basan, por una parte, en que los factores de coagulación, tanto de la vía extrínseca como de la intrínseca, llegan a actuar casi simultáneamente y no de manera independiente y secuencial como se creía. Este modelo propone que previo a la fase de iniciación, se encuentran en la sangre niveles basales de los componentes enzimáticos o factores de la coagulación activados, sin que esto ocasione riesgo de coagulación, debido a que en la superficie se encuentran inhibidores efectivamente localizados (Monroe y Hoffman, 2006). Los investigadores proponen que para que el proceso se logre completamente, es necesario de tres fases continuas, una inicial, una de amplificación y una de propagación, donde el componente celular plaquetario y endotelial es indispensable para la consolidación de las etapas finales del proceso (Figura 2) (Pérez y Bover, 2007). En la fase de iniciación, la superficie celular del endotelio vascular y de las plaquetas son realmente importantes, porque sobre ella se expresa el factor tisular que forma complejo con el factor VIIa, el cual activa a los factores IX y X. Cuando esta activación tiene lugar, el factor Xa se une al factor V para transformar pequeñas cantidades de protrombina a trombina, siendo ésta aún insuficiente para formar la fibrina (Monroe y Hoffman, 2006). En una segunda etapa, la fase de amplificación, la consecuente activación de las plaquetas permite la liberación de sustancias necesarias para formar un ciclo de continua retroalimentación. Tanto el calcio como los fosfolípidos, junto a la trombina previamente formada en la fase de iniciación, provocan la activación de cofactores como el V y el VIII en la superficie de las plaquetas, así como también del factor XI. Para el final de esta fase, la cantidad de trombina, es apreciable (Monroe y Hoffman, 2006).

10 Figura 2. Fases de la coagulación según el nuevo modelo celular. Están presentes los factores de coagulación, calcio, fosfolípidos y factor tisular (Tomado de: Pérez y Bover, 2007). Finalmente, Monroe y Hoffman (2006) proponen que en la fase de propagación ocurren una serie de eventos sobre la superficie de la plaqueta. Los factores IX, VIII, XI y V activados en las fases anteriores forman complejos enzimáticos sobre la superficie celular y en conjunto activan grandes cantidades de factor X y éste a su vez transforma protrombina a trombina, suficiente para formar un tapón definitivo, el cual es estabilizado por el factor XIII activado y por la trombina. En la actualidad y basados en el modelo celular de la coagulación sanguínea, se conoce la importancia que tienen las superficies celulares (plaquetas, células endoteliales, fibroblastos y monocitos) en el proceso. Las células tienen dos papeles básicos en la hemostasia normal; una de ellas es proporcionar una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima/cofactor y su interacción con los sustratos para formar el coágulo de fibrina y la otra, proporcionar los factores de la coagulación que no estén presentes en el plasma normal; además de brindar un mecanismo de control inhibitorio, que garantice la fluidez de la sangre sin riesgo a trombosis (Mann, 2003).

11 Regulación de la Coagulación. Sistema fibrinolítico. El control de la coagulación sanguínea se logra mediante varios mecanismos de anticoagulación y en todos los niveles del sistema. El primero de ellos es el que se desarrolla por la vía del inhibidor fisiológico del factor tisular (TFPI), el cual regula el inicio de la coagulación. Este se une e inhibe al FXa recién activado, que se asocia a su vez con el complejo: factor tisular-fviia. Así mismo, todas las enzimas de coagulación activadas pueden ser inhibidas por una serin proteasa circulante, la Antitrombina (AT), particularmente cuando las enzimas no actúan con su cofactor. Como su nombre lo indica, su principal función es inhibir a la trombina (Dahlbäck, 2008., Mann, 2003). Otro mecanismo de control se logra mediante la regulación de dos factores de coagulación (FVIIIa y FVa). Esto ocurre por el sistema anticoagulante de la proteína C (PC), específicamente rompiendo un número limitado de enlaces peptídicos entre el FVIIIa y FVa, cuando no está unido al factor von Willebrand. Para que sea posible debe activarse la proteína C (APC) por acción de la trombina. Por su parte, la trombomodulina (TM), es un cofactor esencial para comprender el mecanismo. La TM esta presente en la superficie de las células endoteliales y la trombina que se genera en las inmediaciones del endotelio intacto se une con gran afinidad a la TM. La alta concentración de TM en la microcirculación local es crucial para la activación de la proteína C y la anticoagulación de la sangre (Dahlbäck, 2008., Mann, 2003). Existe otra proteína dependiente de vitamina K, denominada proteína S (PS) que funciona como cofactor de la APC, esta proteína puede encontrarse en dos formas en el plasma; como proteína S libre y formando complejo con una de las proteínas de unión del complemento c4b (C4BP), proporcionando así un control local del sistema de activación del complemento. La proteína S por sí sola puede inactivar el FVa, pero requiere de éste último para la inactivación de FVIIIa. (Dahlbäck B., 2005).

12 Por otra parte y simultáneamente al proceso de formación del trombo se produce la lisis del mismo. El coagulo de fibrina sirve de base para que se inicie la cicatrización del tejido lesionado; éste coágulo es eliminado por acción del sistema fibrinolítico, el cual consta de una serie de reacciones enzimáticas que ocurren de manera simultánea y de forma fisiológica en el organismo, conllevando a la disolución del coagulo formado. El proceso mediante el cual la fibrina es degradada enzimáticamente, se denomina fibrinólisis. El principal componente de este mecanismo es la plasmina, cuyo precursor es el plasminógeno. La plasmina es la enzima que se encarga de disolver el coágulo formado para reestablecer el flujo sanguíneo y evitar problemas como la trombosis; si se perpetúa la fibrinólisis en el tiempo puede ocasionar desordenes hemorrágicos. El sistema debe estar en equilibrio, para ello, deben estarlo también sus componentes: Plasminógeno/plasmina, activadores, inhibidores y reguladores (Pérez, 1995). Las reacciones enzimáticas de este sistema deben ser garantizadas cuando se activan los mecanismos de control en la activación y degradación de las proteínas que intervienen en el proceso, entre ellas se encuentran el activador tisular del plasminógeno (t-pa), los inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI-1) y la antiplasmina (α2-antiplasmina) (Quintana, 2002). Existen otras proteínas que intervienen en el proceso de control de la hemostasia, las cuales tienen funciones complejas y específicas; el cofactor II de la heparina es uno de ellos (Quintana, 2002), así como también se han descrito otros factores en diversos estudios igualmente influyentes como la proteína Z, el inhibidor fibrinolítico dependiente de la trombina (TAFI) y las anexinas. (Forastiero y Martinuzzo, 2006). Debido a que el proceso de coagulación tiene un perfecto balance, entre las reacciones procoagulantes y anticoagulantes, alteraciones en estos procesos pueden desencadenar, como se ha mencionado previamente, estados de hiper o

13 hipocoagulabilidad, originando en consecuencia desordenes hemorrágicos o trombóticas, siendo éste último de especial interés en este trabajo. III.2. Trombosis La trombosis es un proceso patológico, caracterizado por la formación de un coágulo que obstruye el flujo sanguíneo, pudiendo ocasionar isquemia en los tejidos que abastece o infarto en órganos. La formación de trombos puede ocurrir como consecuencia de la activación anormal del proceso de la coagulación y del sistema fibrinolítico, lo que induce a una disminución del flujo sanguíneo. Su origen es producto de la interacción de fenómenos vasculares, celulares y humorales. Dependiendo de la instalación de la obstrucción, la trombosis puede localizarse en la circulación venosa o en la arterial (Bañas, 2001). Es necesario diferenciar entre trombosis venosa y arterial, porque no sólo el origen es diferente, sino que también lo son su fisiopatología y tratamiento. La Trombosis Arterial es aquella que ocurre en las arterias y son los daños en la pared vascular los que contribuyen a la liberación de ADP, a la activación y agregación de las plaquetas al sitio de la lesión, al rompimiento de eritrocitos, pero en menor proporción en la formación de fibrina (Heras y cols., 1999). Una de las causas principales de los daños en la pared vascular es la placa de ateroma, formada por un cúmulo de lípidos, de células, macrófagos y tejido conjuntivo que disminuye considerablemente la luz del vaso arterial (Jiménez, 2002). Por otro lado, en la Trombosis Venosa, predomina la activación del sistema de coagulación y el depósito de fibrina. La participación del daño vascular no es tan importante como en la trombosis arterial; en este caso cobra mayor relevancia los estadios de hipercoagulabilidad y el estancamiento sanguíneo, debido a que los vasos venosos, se caracterizan por un flujo sanguíneo lento, baja presión y baja velocidad. Esta disminución del flujo sanguíneo aumenta la viscosidad de la sangre,

14 lo que hace que la concentración de trombina sea tal, que los mecanismos de inhibición de la coagulación no sean suficientes, generándose un coágulo o trombo venoso en la zona (Heras y col., 1999). Son muchos y muy diversos los factores de riesgo que conllevan a los individuos a manifestar patologías trombóticas, sin embargo aquellos que han sido expuestos a cirugías o traumas que causan una inmovilización prolongada y no reciben un tratamiento preventivo adecuado son candidatos potenciales. Así mismo, hay condiciones como el embarazo, las enfermedades cardíacas y neurológicas, varicosidades, neoplasias, que aumentan el riesgo a padecer de trombosis venosa. Hay otros factores independientes como la edad, la obesidad, la raza, el grupo sanguíneo, el uso de anticonceptivos orales, entre otros que favorecen a la aparición de la patología (Pérez, 1995). Igualmente hay factores genéticos que crean deficiencia de proteína C, proteína S y antitrombina III y otros que presenten alteraciones adquiridas que produzcan hipercoagulabilidad (Rodrigo y Villa, 2002). Tanto la trombosis venosa como arterial, son patologías igualmente graves, ya que mueren muchas personas a consecuencia de ello (Jiménez, 2002). Aunado a esto, existe un componente adquirido predisponente en la formación de trombos y por tanto de la trombosis, sin embargo, cada día cobra mayor atención las alteraciones genéticas que influyen en el origen de esta patología. III.2.1 Trombosis Venosa Específicamente el tromboembolismo venoso, incluye dos formas de expresión clínica, la trombosis venosa profunda (TVP) y el embolismo pulmonar (EP), que se consideran manifestaciones de una misma enfermedad y comparten el mismo tratamiento (Bañas, 2001). Éstas, en conjunto con la expresión clínica de la trombosis arterial tanto en el sistema vascular como neurovascular, constituyen una importante causa de morbimortalidad en todo el mundo (González y col., 2006). En Estados Unidos anualmente a causa de la trombosis venosa, se reportan aproximadamente 300.000 hospitalizaciones y alrededor de 50.000 muertes.

15 Expresado de otra forma, 100 de cada 100.000 individuos están en riesgo de desarrollar trombosis venosa en ese país, siendo mas frecuente en adultos mayores que en niños, donde se alcanza menos de 5 casos por cada 100.000 personas (Ofuso, 2006). Esta realidad no es distinta en ciertos países latinoamericanos, donde más de la mitad de las defunciones en adultos son debidas a problemas tromboembólicos. En Venezuela, no hay estudios que sustenten las cifras reales de la trombosis venosa, aunque se cuenta con algunas descripciones importantes que llevan a pensar en la enorme probabilidad de presentar de trombosis venosa profunda o embolismo pulmonar. En nuestro país, aproximadamente el 50% de los casos no son reportados porque permanecen asintomáticos, no existe un registro estadístico confiable en cuanto a la morbimortalidad de esta patología. Aplicando criterios de prevalencia mundial se estima la existencia de 24.000 casos nuevos por año y en estudios prospectivos se ha determinado una incidencia aproximada de 0,1% para la población general que llega a incrementarse hasta 1% para individuos mayores de 40 años, siendo más frecuente en mujeres (Molero y col., 2005). Pérez reporta que la incidencia anual a nivel mundial de trombosis venosa aumenta con la edad: de una frecuencia de 1 por 100.000 en la infancia, pasa a 1 por 100 en las edades avanzadas. Es decir, que por cada 100.000 habitantes, se presentarán aproximadamente 160 casos de trombosis venosa profunda (TVP) y 50 casos de tromboembolismo pulmonar fatal al año (Pérez, 2006). Existen factores predisponentes, que pueden ocasionar riesgo a presentar trombosis venosa. Se ha definido una triada clásica denominada, la triada de Virchow relacionado con estos factores: (Kahn, 1998). Estasis venoso, asociado a un estado de sedentarismo, obesidad, inmovilidad, patologías que cursen con disminución del gasto cardíaco, venodilatación, efectos hemodinámicos disminuidos, desaparición de los mecanismos de la bomba muscular, entre otros. Coagulopatías o estados de hipercoagulabilidad, donde el sistema de coagulación está alterado. Se produce un aumento del fibrinógeno y de

16 algunos factores de coagulación (VII, VIII, IX y X). Déficit en los inhibidores de la coagulación, disminución de ciertas proteínas como la C, S y antitrombina III, favoreciendo la formación de trombina y por ende del proceso de trombosis. Lesiones endoteliales, que activan las vías de la coagulación, tanto intrínseca como extrínseca, desencadenando las reacciones de coagulación y desapareciendo los sistemas fibrinolíticos. Así mismo, algunas condiciones adquiridas como por ejemplo, el consumo de los anticonceptivos orales, el tabaquismo, la diabetes y la inactividad física, entre otras. Éstas están más directamente implicadas en la importancia y frecuencia para el desarrollo y la consolidación del trombo o proceso vaso oclusivo (Jiménez, 2002) (Benítez y col., 2004). También se ha establecido que la presencia de factores genéticos conllevan a una tendencia trombótica familiar, aunque aún no está del todo claro la asociación entre los alelos de ciertos polimorfismos en diferentes genes y la trombosis venosa (Smadja y col., 2008). La mayoría de las investigaciones sobre el proceso de la coagulación y sus complicaciones, van dirigidas a contrarrestar la tendencia a la trombosis, en aquellas personas con predisposición a sufrirla, controlando los factores claves de amplificación y propagación de la cascada de la coagulación. Estos son, el factor tisular, el factor X y el VIII, así como también la protrombina y trombina. Sin embargo, se ha señalado que muchas de las drogas utilizadas muestran ciertos grados de toxicidad hepática (Pérez y Bover, 2007). Adicionalmente, el control específico sobre el VIII por ejemplo, logra ser efectivo con ciertos tratamientos, pero se hacen insuficientes en muchos casos y en otros es limitado su aplicación. Debido a esto, se ha considerado que lo más difícil de mantener es el equilibrio homeostático entre factores trombóticos y hemorrágicos durante el tratamiento anticoagulante. Evidentemente estos pueden alterarse por una inhibición insuficiente de la coagulación, en el caso de la trombosis, o por la aparición de hemorragia debido a excesivo tratamiento antitrombótico (Pérez y Bover, 2007).

17 A nivel mundial la terapia antitrombótica va dirigida a la prevención de los procesos crónicos, y debe conjugar los alcances efectivos, con la repercusión económica. Heras y colaboradores en el 2007 explican que para indicar un tratamiento antitrombótico, debe determinarse previamente el tipo de sustrato trombogénico y evaluar el riesgo relativo de sufrir un episodio tromboembólico. Uno de los tratamientos más ampliamente utilizado contra la trombosis a nivel mundial, incluyendo nuestro país, es el uso de los anticoagulantes orales, conocidos como cumarínicos, donde la warfarina es un ejemplo de ellos. Estos son fármacos que permiten inhibir la coagulación a través de su acción sobre los factores de la coagulación cuya función es dependiente de la vitamina K. III.3. Factores de Coagulación dependientes de la Vitamina K La vitamina K es un compuesto químico con propiedades procoagulantes, ya que interviene como co-factor en la gamma glutamil carboxilación del factor II (protrombina), factor VII (proconvertina), factor IX (componente de la tromboplastina) y factor X (Spronk, 2006). Existen otros factores que también dependen de la vitamina K, pero estos de manera natural inhiben la coagulación, estos son: la proteína C, proteína S y proteína Z (González y col., 2006). Por su parte la proteína Z, está involucrada en la fijación de la trombina a la superficie de los fosfolípidos (Spronk, 2006). En los factores de coagulación dependientes de vitamina K, como por ejemplo en el FII (protrombina), existe un tetrapétido en el extremo N-terminal que contiene residuos de ácido glutámico (Glu), los cuales sufren modificaciones para transformarse en ácido γ-carboxiglutámico (Gla). Estos le dan la habilidad a dichos factores para unirse al Ca +2, lo cual es indispensable para que estos a su vez puedan unirse a los fosfolípidos de la membrana, unión necesaria para ejercer su función (Stenflo y col., 1974); (Osman, 2007). El mecanismo de gamma glutamil carboxilación ocurre gracias al ciclo de la vitamina K (Figura 3), a través de reacciones que ocurren en la membrana del retículo endoplasmático.

18 Proteína Inactiva Proteína Activa Figura 3. Ciclo de la Vitamina K. Reacciones del ciclo de la vitamina K. Explicación en el texto. (Tomado de Osman, 2007) Los componentes del ciclo de la vitamina K incluyen las siguientes reacciones: 1. En un primer paso, la Vitamina K hidroxiquinona, obtenida de la dieta en diversas fuentes de alimentación, es reducida a la vitamina K quinol (KH 2 ) por una enzima llamada vitamina K reductasa (VKR), o DTdiaphorase. Es posible, que también pueda ser reducida por la Vitamina K epoxido reductasa (VKOR) (Osman, 2007). 2. En un segundo paso, una vez generada la KH 2 como un cofactor, la enzima γ-glutamil carboxilasa (GGCX), usa la KH 2 en conjunto con CO 2 y O 2 para convertir los residuos del ácido glutámico (GLU), en el extremo N-terminal de las proteínas de la coagulación vitamina K- dependientes, a residuos ácido γ-carboxiglutámico (GLA). De esta forma la GGCX, es también una epoxidasa. 3. En un tercer paso, en la misma reacción y con la misma enzima (GGCX), la KH 2 es oxidada a vitamina K epóxido (VKO). Posteriormente la VKO es reducida a la forma hidroxiquinona de la vitamina K por acción de la enzima VKOR.

19 De esta manera se perpetúa el ciclo y se permite la carboxilación de las proteínas o factores dependientes de vitamina K que intervienen en la cascada de coagulación. La deficiencia de vitamina K pueden conducir a deficiencias en las funciones de los factores de coagulación y en consecuencia, a un sangrado excesivo. Esto puede ocurrir mediante el bloqueo de la carboxilación de los radicales del ácido glutámico, del extremo amino terminal de estas proteínas de la coagulación, impidiendo que se unan mediante el calcio a las cargas negativas fosfolipídicas de la pared vascular y de las plaquetas. Estos dos eventos son necesarios en los procesos que conducen a la formación de coágulos (Heras y col., 2007). Debido a esto, el ciclo de la vitamina K puede ser blanco farmacológico en el tratamiento de eventos trombóticas. Durante los últimos años, la terapia profiláctica antitrombótica con fármacos antivitamina K se ha incrementado de manera notable en la población, beneficiando de alguna manera a los pacientes que la consumen. Estas drogas son efectivas y eficaces, sin embargo tienen un estrecho margen farmacológico. Además, es importante considerar que hay un gran número de factores que influyen en la actividad de estos compuestos, entre estos factores están la dieta, una alimentación rica o baja en vitamina K, la co-medicación, la edad, la condición física en general, entre otros (Ansell y col., 2004). Si por alguna razón no se cumple efectivamente la acción del cumarínico y no ejerce su función, no se evita la trombosis o bien si excede la eficacia del mismo se produce una crisis hemorrágica. III.4. Anticoagulantes Orales III.4.1 Warfarina Para la prevención y tratamiento de anticoagulación de los pacientes con trombosis venosa, se ha desarrollado desde hace muchos años el cumplimiento de la terapia con anticoagulantes orales. Como se mencionó anteriormente, una de las