MS E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones

BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Egner, W.: The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J Clin Pathol; 53: 424-432, 2000. 2. Alba, P., Bento, L., Cuadrado, M.J. et al.: Anti-dsDNA, anti-sm antibodies, and the lupus anticoagulant: significant factors associated with lupus nephritis. Ann Rheum Dis; 62:556 560, 2003. 3. Haugbro, K., Nossent, J.C., Winkler, T., et al.: Anti-dsDNA antibodies and disease classification in antinuclear antibody positive patients: the role of analytical diversity. Ann Rheum Dis.; 63 (4): 386-94, 2004. 4. Förger, F. and Helmke, K.: The role of autoantibodies in the management of lupus nephritis. CLI, October, 2005. 5. Waldman, M. and Madaio, M.P.: Pathogenic autoantibodies in lupus nephritis. Lupus; 14: 19-24, 2005. 6. Hughes, R. and UI-Hassan, S.: Anti-dsDNA antibodies: their role in the detection and monitoring of SLE. CLI, 7: 12-17, 2006. 7. Mortensen, E.S., Fenton, K.A. and Rekvig, O.P.: Lupus Nephritis: The Central Role of Nucleosomes Revealed. Am J Pathol; 172 (2): 275-283, 2008. 8. Narayanan, C.K., Marwaha, C.V., Shanmuganandan, C.K. and Shankar, G.C.S.: Correlation between Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index, C3, C4 and Anti-dsDNA Antibodies. MJAFI; 66: 102-107, 2010. MS 10310030148 Imuno-ELISA Anti-dsDNA Kit para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos Anti-DNA dupla fita (Anti-dsDNA) no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative or semi-quantitative determination of double-stranded Anti-DNA (AntidsDNA) antibodies in human serum by enzyme immunoassay (ELISA). Kit para determinación cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos anti-adn de doble cadena (anti-adndc) en el suero humano por enzimoinmunoensayo (ELISA). R E F R E F 403096-E - 96 determinações / determinations / determinaciones 403192-E - 192 determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 11/2012 EC R E P WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, 100 - CEAT CEP 13573-470 - São Carlos - SP - Brasi Fone 55 16 3377.9977 / Fax 55 16 3377.9970 www.wamadiagnostica.com.br Obelis S.A. Boulevard Général Wahis 53 1030 Brussels, BELGIUM Phone. +(32) 2 732-59 54 Fax : +(32) 2 732-60 03 www.obelis.net SAC 0800 772 9977

01 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA Em várias doenças autoimunes são encontrados anticorpos antinucleares (ANA). Os ANA incluem anticorpos contra antígenos nucleares, como o DNA, a histona e diversos antígenos nucleares extraíveis, como o RNP, Sm, SS-A e SS-B. Ocorrem três especificidades com os anticorpos anti-dna, as quais são: 1. Anticorpos anti-dsdna que só reagem com o dsdna (DNA dupla fita) 2. Anticorpos anti-ssdna que reagem com o ssdna (DNA simples fita) 3. Anticorpos anti-ds/ssdna que reagem com o dsdna e com o ssdna. Destes três tipos, os anticorpos anti-dsdna são característicos do lúpus eritematoso sistêmico (LES), ocorrendo raramente em outras doenças autoimunes. A frequência e os níveis destes anticorpos oscilam com a atividade da doença, ocorrendo geralmente em cerca de 50-55% dos casos de LES e em cerca de 89% dos pacientes com LES com doença renal ativa. Os anticorpos contra o dsdna podem desaparecer com um tratamento à base de imunossupressores e durante a remissão da doença. Existe uma boa correlação entre a atividade da doença e os níveis de anticorpos anti-dsdna. O Imuno-ELISA ANTI-dsDNA da WAMA é um teste imunoenzimático para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos anti-dna de dupla fita, classe IgG, no soro humano. Os anticorpos de classe IgA e IgM também ocorrem, mas os de classe IgG são clinicamente relevantes. Os resultados são relatados em Unidades Internacionais por mililitro (UI/mL). Os calibradores e soro controle positivo foram ajustados contra o reagente de referência Wo/80 da Organização Mundial de Saúde (OMS). PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de dsdna (fase sólida). Quando anticorpos anti-dsdna específicos estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-igg humana de cabra marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos anti-dsdna presentes. Um substrato (TMB) é adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos em unidades internacionais por mililitro (UI/mL). 22 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. Lo Imuno-ELISA Anti-dsDNA contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, anti-hcv (excepto el Suero Control Positivo) y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de iniciar los tests. 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos. 14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. TERMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F 403096-E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos dsdna purificados (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (2 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (1 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (1 x 60 ml) 6. Solução Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador-dsDNA: A. 1 frasco, líquido, contendo 400 UI/mL de anti-dsdna (1 x 1,75 ml), B. 1 frasco, líquido, contendo 200 UI/mL de anti-dsdna (1 x 1,75 ml), C. 1 frasco, líquido, contendo 100 UI/mL de anti-dsdna (1 x 1,75 ml), D. 1 frasco, líquido, contendo 50 UI/mL de anti-dsdna (1 x 1,75 ml), E. 1 frasco, líquido, contendo 1 UI/mL de anti-dsdna (1 x 1,75 ml). 8. Soro Controle Negativo (1 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso R E F 403192-E - 192 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos dsdna purificados (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (4 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (2 x 15 ml)

21 PRECISIÓN DEL TEST: a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determiné mediante el ensayo 2 muestras de sueros, un reactivo y un noreactivo, en 20 replicas. Especímenes Número de Veces Media EU/ml Desviación Estándar CV Reactivo 20 167,5 9,41 5,61% No reactivo 20 7,5 0,48 6,42 % b. Precisión Interensayo La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestras de suero, un reactivo y otro no reactiva, en 20 replicas, siendo 10 réplicas para cada lote y por operadores diferentes. Especímenes Número de Veces Media EU/ml Desviación Estándar CV Reactivo 20 167,5 9,41 5,61% No reactivo 20 7,5 0,48 6,42 % LINEALIDAD La linealidad de Imuno-ELISA ANTI-dsDNA es 13.6-450 UI/mL. Se recomienda para muestras con valores superiores a la concentración calibrador ADNdc A se diluye y testeadas nuevamiente. Lo resultado final se determina multiplicando el valor obtenido por el factor de dilución. LÍMITE DE DETECCIÓN Lo límite de detección de lo test se determinó como 13.6 UI/mL basado en 60 replicas del "blank" y 60 replicas para cada una de las seis muestras con bajos niveles de anticuerpos. ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se demostró una injerencia significativa de las siguientes sustancias en las concentraciones indicadas: hemoglobina (hasta 2 g/l), bilirrubina (hasta 342 µmol/l) y el factor reumatoideo (hasta 100 UI/ml). Reactividad cruzada también se ha estudiado en individuos portadores de otras enfermedades autoinmunes o reactivas para auto-anticuerpos, cuyos resultados se muestran en la tabla abajo: Condición Número de Pacientes Número de Reactivos Hipoacusia Autoinmune 10 0 Artritis Reumatoide 18 1 Lupus Eritematoso Sistémico 2 0 TOTAL 30 1 (3,3%). LIMITACIÓN DEL USO Lo test Imuno-ELISA anti-dsdna de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, debido a la posibilidad de falso resultado reactivos y interferencias con otras enfermedades, resultados repetidamente reactivos siempre debe interpretarse con información clínica del paciente con los resultados de otras pruebas de laboratorio. Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2-8 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (2 x 60 ml) 6. Solução Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador-dsDNA: A. 1 frasco, líquido, contendo 400 UI/mL de anti-dsdna (2 x 1,75 ml), B. 1 frasco, líquido, contendo 200 UI/mL de anti-dsdna (2 x 1,75 ml), C. 1 frasco, líquido, contendo 100 UI/mL de anti-dsdna (2 x 1,75 ml), D. 1 frasco, líquido, contendo 50 UI/mL de anti-dsdna (2 x 1,75 ml), E. 1 frasco, líquido, contendo 1 UI/mL de anti-dsdna (2 x 1,75 ml). 8. Soro Controle Negativo (2 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8ºC. SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µ L. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. CALIBRADORES-dsDNA (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo anti-dsdna. A concentração em UI/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta de cada frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. O uso do Calibrador-dsDNA é para determinar resultados semiquantitativos e valores em unidades internacionais. O Calibrador-dsDNA deve ser sempre utilizado em cada ensaio realizado. SORO CONTROLE NEGATIVO (8): pronto para uso. Soro humano negativo para Anti-dsDNA. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém conservante. SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para Anti-dsDNA. Usar puro, ou seja, não diluído. A concentração em UI/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 5 µl e 1000 µ l e ponteiras. Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. 02

03 Lavadora de microplaca. Recipiente para descarte de material. Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1.De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-dsdna (7), frasco D, se o resultado pretendido for qualitativo, ou 5 cavidades, frascos de A a E, se o resultado desejado for semi-quantitativo, 1 cavidade para o soro controle negativo (8) e 1 cavidade para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, a qual conterá somente 100 µl do diluente de amostra (5). 2.Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5 µl da amostra + 500 µl do diluente de amostra (5). 3. Dispensar 100µ L dos calibradores-dsdna (7), soro controle negativo (8), soro controle positivo (9) e amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o blank se a leitura for monocromática, dispensando nesta 100µ L do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µ L de solução de lavagem (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100µ l do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir as etapas 6 a 8. 12. Dispensar 100µ l do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 100µ l da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank, dentro de 30 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1.Pipetar 100µ l do calibrador-dsdna (7), controle negativo (8), controle positivo (9), amostras (1:101) e "blank" (leitura monocromática) nas respectivas cavidades. 2.Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. IMPORTANTE: 1. Los valores anteriores son sólo un guía para interpretación de los resultados. Es recomendable que cada laboratorio establecer su propio rango de referencia. VALORES ESPERADOS La incidencia de los anticuerpos anti-adndc varía en función de la población de pacientes. La siguiente tabla muestra la incidencia de estos anticuerpos en varias enfermedades autoinmunes y personas normales. Los datos fueron recopilados de la literatura. Condición Incidencia LES 50-55 Enfermidad Renal Activa 89 Enfermedad Activa no Renal 56 Enfermedad Inactiva 30 Posible LES 32 Artritis Reumatoide < 12 Esclerodermia Sistémica Fueran probados conjuntos de muestras clínicas usando lo Imuno-ELISA anti-dsdna de WAMA, los resultados que muestra la incidencia de estos anticuerpos en los distintos grupos se muestran en la siguiente tabla: Condición Número de Pacientes Número de Positivos % de Positivos LES 249 155 62,2 % Síndrome do ac antifosfolípido primario 25 0 0,0 % Miositis primaria 20 0 0,0 % Esclerodermia 4 1 25 % Artritis Reumatoide 43 5 11,6 % Enfermedad de Graves 9 0 0,0% Tiroiditis de Hashimoto 14 1 7,1 % Enfermedad no diferenciado de tiroides 9 1 11,1 % Pérdida de la audición inmune mediada 8 0 0,0 % Individuos sanos normales 159 6 3,8 % SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 173 muestras de suero obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 81 eran positivos y 92 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de lo Imuno-ELISA antidsdna de WAMA en comparación con el Kit IMUNO-CON anti-dna from WAMA. Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100 Verdadero Falso Verdadero Falso Sensibilidad Especificidad Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADOS 77 3 89 4 95,06 96,74 < 12 Individuos sanos normales < 1 20

19 04 La determinación de la concentración de las muestras puede ser determinada por uno de los siguientes métodos: 1. Determinación Cualitativa D.O. de la muestra x UI/mL de Calibrador D = UI/mL de la muestra D.O. del Calibrador D Advertencia: Se recomienda que los resultados cualitativos se reportan como "REACTIVO" o "NO REACTIVO". Las muestras con resultados igual o mayor que el calibrador D se considera Reactivo. 2. Determinación semicuantitativo Trace el D. O. y las concentraciones de los calibradores A a E en un papel log-lineal, trazando las concentraciones en UI/ml en el eje X y el D.O s en el eje Y, trazando una curva que conecta los puntos. La concentración de la muestra en UI/ml se obtiene trazando el D.O. de la muestra desconocida en el eje Y, trazando el punto de intersección de la curva de calibración, cuya concentración es el valor correspondiente en el eje X en UI/ml. 2,5 2 1,5 1 0,5 0-0,5 0 200 400 600 800 IU/mL Importante: Como alternativa, puede utilizar una curva de calibración de 4 puntos, descartando el calibrador ADNdc E. Los resultados semi-cuantitativos son reportados en UI/mL, y los "borderline" (50 a 60 UI/mL) se debe volver a probar. Muestras con valores elevados, mayor que el calibrador ADNdc A, deben ser diluidas y volver a pasar la prueba, cuyo resultado final en UI/ml se obtiene tras multiplicar por el factor de dilución. VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente lo diluyente de muestra, debe ser inferior a 0,3 a 450nm. Lo valor de la D.O. de lo Calibrador ADNdc A deben ser igual o superior a 1.0, de lo contrario, la prueba debe repetirse. Lo valor de la D.O. de lo controle negativos deben ser inferior a 30 UI/mL Cuando se determina la determinación cualitativa, lo D.O. de lo calibrador ADNdc D debe ser mayor que el D.O. del control negativo y menor que el D.O. del control positivo. Para determinaciones semi-cuantitativas, el control positivo debe tener valores en el rango indicado en la etiqueta de la botella. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Para la interpretación de los resultados, se recomienda el siguiente valores de referencia: Valores de Anticuerpos Anti-ds DNA Interpretación < 50 UI/ml Resultado Negativo 50-60 UI/ml Resultado "Borderline" > 60 UI/ml Resultado Positivo 3.Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 4 vezes com solução de lavagem (2). 4.Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5.Pipetar 100µ l do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto "blank". 6.Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 7.Repetir as etapas 3 e 4. 8.Pipetar 100µ l do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no "blank". Haverá mudança na cor da reação onde houver peroxidase. 9.Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz 10.Pipetar 100µ l da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. 11.Homogeneizar por 30 segundos. 12.Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos. A B C D E F G H A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA DETERMINAÇÃO QUALITATIVA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador D A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A10 3 4...... 12 EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA DETERMINAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador A Calibrador B Calibrador C Calibrador D Calibrador E 2 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 3 A9 A10 A11 A12 4...... 12 CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. A determinação da concentração das amostras pode ser determinada através de um dos seguintes métodos: 1.Determinação Qualitativa D.O da Amostra x UI/mL do Calibrador D = UI/mL da Amostra D.O do Calibrador D

05 Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como REAGENTES ou NÃO REAGENTES. As amostras com resultados superiores ou iguais ao Calibrador D são consideradas Reagentes 1.Determinação Semi-Quantitativa Plotar as D.Os. e concentrações dos Calibradores de A a E em papel linear-log, plotando as concentrações em UI/mL no eixo X e as D.Os. no eixo Y, traçando uma curva que ligue os pontos determinados. A concentração da amostra em UI/mL é obtida plotando a D.O. da amostra desconhecida no eixo Y e traçando o ponto de intersecção na Curva de Calibração, cuja concentração será o valor correspondente no eixo X em UI/mL. 2,5 Importante: Alternativamente, pode-se usar uma curva de calibração de 4 pontos, descartando-se o calibrador-dsdna E. Os resultados semi-quantitativos são reportados em UI/mL, devendo os borderline (50-60 UI/mL) serem retestados. Amostras com valores elevados, superiores ao calibrador-dsdna A, devem ser diluídas e retestadas, cujo resultado final em UI/mL é obtido após multiplicar pelo fator de diluição. VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450 nm. O valor da D.O. do Calibrador-dsDNA A deve ser igual ou superior a 1,0, caso contrário o teste deve ser repetido. A concentração do controle negativo deve ser inferior a 30 UI/mL. Quando se realiza determinação qualitativa, a D.O. do Calibrador-dsDNA D deve ser superior à D.O. do controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo. Para as determinações semi-quantitativas, o controle positivo deve apresentar valores na faixa indicada na etiqueta do frasco. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Para a interpretação dos resultados sugere-se a seguinte referência: 2 1,5 1 0,5 0-0,5 0 200 400 600 800 IU/mL Valores de Anticorpos Anti-dsDNA Interpretação < 50 UI/mL Resultado Negativo 50 60 UI/mL Resultado Borderline > 60 UI/mL Resultado Positivo IMPORTANTE: 1. Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência. VALORES ESPERADOS A incidência dos anticorpos dsdna varia de acordo com a população de pacientes. O quadro abaixo mostra a incidência desses anticorpos em diversas doenças autoimunes e indivíduos IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 100μl del calibrador ADNdc (7) control negativo (8), control positivo (9), muestras (1:101), y blank (lectura monocromatica) en sus respectivos pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 4 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y 4. 8. Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Cambio de color aparecerá donde está presente la enzima peroxidasa. 9. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.protegido de la luz 10. Dispensar 100 µl de la Solución Stop (6) en cada uno de los pocillos de la microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 30 minutos. EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA DETERMINACIÓN CUALITATIVA 1 2 3 4...... 12 A Blank A5 B Controle Neg. A6 C Controle Pos. A7 D Calibrador D A8 E A1 A9 F A2 A10 G A3 H A4 EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA DETERMINACIÓN SEMI-CUANTITATIVA 1 2 3 4...... 12 A Blank A1 A9 B Controle Neg. A2 A10 C Controle Pos. A3 A11 D Calibrador A A4 A12 E Calibrador B A5 F Calibrador C A6 G Calibrador D A7 H Calibrador E A8 CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. 18

17 ESPECÍMENES Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. 18 Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO Micropipeta de 5µl y 100μl y puntas de pipeta. Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Lavador de microplaca. Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, use 1 pocillo para el Calibrador ADNdc (7), botella D, si el resultado esperado es cualitativa, o 5 pocillos, botellas A a E, si el resultado deseado es semicuantitativo, 1 pocillo para el suero control negativo (8) y 1 pocillo para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 100μl de diluyente de muestra(5). 2. Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra + 500 µl de la muestra diluyente (5). 3. Dispensar 100 µl de lo calibrador ADNdc (7), suero control negativo (8), suero control positivo (9) y muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado devitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 6 al 8. 12. Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 100μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 30 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. normais. Os dados foram compilados da literatura. Condição Incidência LES 50-55 Doença Renal Ativa 89 Doença Ativa Não Renal 56 Doença Inativa 30 Possível LES 32 Artrite Reumatóide < 12 Esclerodermia Sistêmica Foram testados conjuntos de amostras clínicas usando o Imuno-ELISA Anti-dsDNA da WAMA, os resultados demonstrando a incidência desses anticorpos nos vários grupos estudados são mostrados no quadro a seguir: Condição Nº de Indivíduos Nº de Positivos % de Positivos LES 249 155 62,2 % Síndrome do Ac. Antifosfolípide primária 25 0 0,0 % Miosite Primária 20 0 0,0 % Esclerodermia 4 1 25 % Artrite Reumatóide 43 5 11,6 % Doença de Graves 9 0 0,0% Tireoidite de Hashimoto 14 1 7,1 % Doença Não Diferenciada da Tireóide 9 1 11,1 % Perda Auditiva Imunomediada 8 0 0,0 % Indivíduos Saudáveis Normais 159 6 3,8 % SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 173 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 81 eram positivas e 92 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno- ELISA Anti-dsDNA da WAMA em comparação com o Kit IMUNO-CON anti-dna da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos Falsos Positivos Verdadeiros Negativos Falsos Negativos Sensibilidade Especificidade RESULTADO 77 3 89 4 95,06 96,74 PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em 20 replicatas. Amostras Número de Vezes Média UI/ml Desvio CV Padrão Reagente 20 172,50 10,1 5,85% Não Reagente 20 7,46 0,46 6,11 % < 12 Indivíduos Saudáveis Normais < 1 06

07 16 b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em 20 replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes. Amostras Número de Vezes Média UI/ml Desvio CV Padrão Reagente 20 167,5 9,41 5,61% Não Reagente 20 7,5 0,48 6,42 % LINEARIDADE A linearidade do Imuno-ELISA Anti-dsDNA é 13,6-450 UI/mL. Sugere-se que amostras com valores superiores a concentração do calibrador-dsdna A sejam diluídas e retestadas. O resultado final é determinado pela multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição. LIMITE DE DETECÇÃO O limite de detecção do teste foi determinado como de 13,6 UI/mL com base em 60 replicatas do "blank" e 60 replicatas de cada uma de seis amostras com baixos níveis de anticorpos. ESPECIFICIDADE ANALÍTICA Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/l) e Fator Reumatóide (até 100 UI/mL). Foi também estudado a reatividade cruzada em indivíduos portadores de outras doenças autoimunes ou reagentes para auto-anticorpos, cujos resultados são mostrados no quadro abaixo: Condição Nº de Pacientes Nº de Reagentes Perda Autoimune da Audição 10 0 Artrite Reumatóide 18 1 Lupus Eritematoso Sistêmico 2 0 TOTAL 30 1 (3,3%) LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA ANTI-dsDNA da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Entretanto, devido à possibilidade de falsos resultados reagentes e interferência com outras doenças, resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer por várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA Anti-dsDNA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-hcv e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirirem a temperatura ambiente (20 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar as cavidades da microplaca secarem durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. A. 1 botella, líquido, que contiene 400 UI/mL de anti-adndc (1 x 1,75 ml), B. 1 botella, líquido, que contiene 200 UI/mL de anti-adndc (1 x 1,75 ml), C. 1 botella, líquido, que contiene 100 UI/mL de anti-adndc (1 x 1,75 ml), D. 1 botella, líquido, que contiene 50 UI/mL de anti-adndc (1 x 1,75 ml), E. 1 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-adndc (1 x 1,75 ml), 8. Suero control negativo (1 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso R E F 403192-E - 192 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos ADNdc purificados (24 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (2 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml) 6. Solución Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador ADNdc: A. 1 botella, líquido, que contiene 400 UI/mL de anti-adndc (2 x 1,75 ml), B. 1 botella, líquido, que contiene 200 UI/mL de anti-adndc (2 x 1,75 ml), C. 1 botella, líquido, que contiene 100 UI/mL de anti-adndc (2 x 1,75 ml), D. 1 botella, líquido, que contiene 50 UI/mL de anti-adndc (2 x 1,75 ml), E. 1 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-adndc (2 x 1,75 ml), 8. Suero control negativo (2 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE REACTIVOS MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente (20-25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y 8 C. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. Calibradores ADNdc (7): Listo para usar. Producido de suero humano que contiene anti-adndc. La concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 y 8 C. Lo uso de Calibrador ADNdc es para determinar resultados semicuantitativos y los valores en unidades internacionales. El Calibrador ADNdc deben utilizarse siempre en cada prueba realizada. SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): listo para usar. Suero humano negativo para anti-adndc. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene conservante. SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para anti-adndc. Usar puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2-8 C. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC).

15 08 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA En varias enfermedades autoinmunes se encuentran anticuerpos antinucleares (ANA). Los ANA incluyen anticuerpos contra antígenos nucleares, como el ADN, la histona y diversos antígenos nucleares extraíbles, tales como el RNP, Sm, SS-A y SS-B. Ocurren tres características específicas de anticuerpos anti-adn, las cuales son: 1. Anticuerpos Anti-ADNdc que sólo reaccionan con lo ADNdc (ADN doble cadena) 2. Anticuerpos anti-adnsc que reaccionan con ADNsc (una sola cadena de ADN) 3. Anticuerpos Anti-dc/scADN que reaccionan con ADNdc y ADNsc. De estos tres tipos, los anticuerpos anti-adndc son típicas de lupus eritematoso sistémico (LES), raramente se producen en otras enfermedades autoinmunes. La frecuencia y los niveles de estos anticuerpos varían de acuerdo con la actividad de la enfermedad, por lo general ocurre en aproximadamente 50-55% de los casos de LES y en aproximadamente 89% de los pacientes con LES con enfermedad renal activa. Los anticuerpos contra ADNdc pueden desaparecer con un tratamiento de inmunosupresores y durante la remisión de la enfermedad. Hay una buena correlación entre la actividad de la enfermedad y los niveles de anticuerpos anti-adndc. La Imuno-ELISA Anti-dsDNA de WAMA es una prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos doble trenzado anti-adn, clase IgG, en suero humano. Los anticuerpos de clase IgA y IgM también ocuren, pero los de clase IgG son clínicamente relevantes. Los resultados se expresan en unidades internacionales por mililitro (UI/mL). Los calibradores y lo suero control positivo fueron ajustados contra el reactivo de referencia Wo/80 de la Organización Mundial de la Salud (OMS). PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de micrititulación se recubren con antígeno purificado de ADNdc (fase sólida). Cuando anticuerpos anti-adndc especificos están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando anti-igg humana de cabra marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos anti-adndc. Un sustrato (TMB) es adicionado, el cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm). La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los resultados se expresan en unidades internacionales por mililitro (UI/mL). PRESENTACIÓN DEL KIT R E F 403096-E - 96 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos ADNdc purificados (12 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (1 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml) 6. Solución Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador ADNdc: 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar as Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. ENGLISH SUMMARY In several autoimmune diseases antinuclear antibodies (ANA) are found. The ANA include antibodies against nuclear antigens, such as DNA, histone and various extractable nuclear antigens, such as the RNP, Sm, SS-A and SS-B. The three specific characteristics of anti-dna antibodies are: 1. Anti-dsDNA antibodies that only react with the dsdna (DNA double strand) 2. Anti-ssDNA antibodies that react with the ssdna (single-strand DNA) 3. Anti-ds/ssDNA antibodies that react with the dsdna and ssdna. Out of these three types, the anti-dsdna antibodies are typical of systemic lupus erythematosus (SLE), rarely occurring in other autoimmune diseases. The frequency and level of these antibodies fluctuate with the activity of the disease, usually occurring in approximately 50-55% of SLE cases and in approximately 89% of SLE patients with active renal disease. The antibodies against dsdna may disappear with a treatment of immunosuppressants and during remission of the disease. There is a good correlation between disease activity and levels of anti-dsdna antibodies. The Imuno-ELISA Anti-dsDNA of WAMA is an immunoenzymatic test for qualitative or semi-quantitative determination of double stranded anti-dna antibodies, IgG, in human serum. The IgA and IgM antibodies also occur, but the IgG the clinically relevant class. The results are expressed as International Units per milliliter (IU/mL). The calibrators and serum positive control were adjusted against the reference reagent Wo/80 from the World Health Organization (WHO). PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with purified dsdna antigen (solid phase). When specific antidsdna antibodies are present in the serum sample, they bind to proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. A goat anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the anti-dsdna antibodies present. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. The results are expressed as international units per milliliter (IU/mL). KIT PRESENTATION R E F 403096-E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified dsdna antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (2 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (1 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (1 x 15 ml) 5. Sample Diluent (1 x 60 ml) 6. Stop Solution (1 x 15 ml) 7. dsdna Calibrator: A. 1 bottle, liquid, containing 400 IU/mL of anti-dsdna (1 x 1.75 ml), B. 1 bottle, liquid, containing 200 IU/mL of anti-dsdna (1 x 1.75 ml), C. 1 bottle, liquid, containing 100 IU/mL of anti-dsdna (1 x 1.75 ml),

09 D. 1 bottle, liquid, containing 50 IU/mL of anti-dsdna (1 x 1.75 ml), E. 1 bottle, liquid, containing 1 IU/mL of anti-dsdna (1 x 1.75 ml), 8. Negative Serum Control (1 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 1.75 ml) 10. Instructions for use R E F 403192-E - 192 determinations 1. Microplate with wells coated with purified dsdna antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (4 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (2 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (2 x 15 ml) 5. Sample Diluent (2 x 60 ml) 6. Stop Solution (2 x 15 ml) 7. dsdna Calibrator: A. 1 bottle, liquid, containing 400 IU/mL of anti-dsdna (2 x 1.75 ml), B. 1 bottle, liquid, containing 200 IU/mL of anti-dsdna (2 x 1.75 ml), C. 1 bottle, liquid, containing 100 IU/mL of anti-dsdna (2 x 1.75 ml), D. 1 bottle, liquid, containing 50 IU/mL of anti-dsdna (2 x 1.75 ml), E. 1 bottle, liquid, containing 1 IU/mL of anti-dsdna (2 x 1.75 ml), 8. Negative Serum Control (2 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (2 x 1.75 ml) 10. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature (20 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (2): Dissolve the contents (powder) of 1 bottle in 1000 ml of distilled or deionized water. During each wash cycle, each well must be washed filled with approximately 350µl. Keep at 2-8ºC. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. GOAT ANTI-HUMAN IgG LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE (TMB) (4): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. SAMPLE DILUENT (5): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. dsdna Calibrators (7): ready to use. Made from human sera containing anti ds-dna. The concentration in IU/mL and the expiration date are printed on the label of each bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. The use of dsdna Calibrator is to determine semi-quantitative results and the values in International Units. The ds-dna Calibrator must always be used in each test performed. NEGATIVE SERUM CONTROL (8): ready for use. Negative human serum to Anti-dsDNA. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains preservative. POSITIVE SERUM CONTROL (9): ready to use. Positive human serum to Anti-dsDNA. Use it as is (do not dilute it). The concentration in UI/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at 20ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results. b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one reactive and another not reactive, in 20 replications, being 10 replicas for each lot and by different operators. Specimens Number of times. Average IU/ml Deviation CV Standard Reagent 20 167.5 9.41 5.61% Non-Reactive 20 7.5 0.48 6.42 % LINEARITY The linearity of the Imuno-ELISA Anti-dsDNA is 13.6-450 IU/mL. It is recommended for samples with values greater than the concentration of the A dsdna calibrator be diluted and retested. The final result is determined by multiplying the value obtained by the dilution factor. DETECTION LIMIT The detection limit for the test was determined as of 13.6 IU/mL based on 60 replicates of blank and 60 replicates for each one of six samples with low levels of antibodies. ANALYTICAL SPECIFICITY It was not demonstrated significant interference for the following substances at the indicated concentrations: Hemoglobin (up to 2g/L), bilirubin (up to 342 µmol/l) and rheumatoid factor (up to 100 IU/mL). Cross-reactivity was also studied in individuals carrier of other autoimmune diseases or reactive to autoantibodier, whose results are shown in the table below: Condition Number of Patients Number of Reagents Autoimmune Hearing Loss 10 0 Rheumatoid arthritis 18 1 Systemic Lupus Erythematosus 2 0 TOTAL 30 1 (3.3%) 14 LIMITATIONS OF USE The test Imuno- ELISA ANTI-dsDNA from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. However, due to the possibility of false results reagents and interference with other diseases, results repeatedly reactive should always be interpreted with clinical information from the patient and with the results of other laboratory tests. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive.due to the high sensitivity of the ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA Anti-dsDNA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-hcv and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature (20-25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination.