PCR Y SEGURIDAD ALIMENTARIA 1. Trazabilidad 2. Alimentos transgénicos 3. Detección de fraudes alimenticios 4. Detección de microrganismos en alimentos 1.TRAZABILIDAD Objetivo : garantizar la seguridad alimentaria y contribuir a que dejen de comercializarse alimentos y piensos que no son seguros. Trazabilidad : supone el uso de marcadores genéticos polimórficos para establecer un sistema de control de origen geográfico y seguimiento de los animales, desde su nacimiento hasta su venta de sus partes en la carnicería. 1
En el campo de la producción cárnica, se trata de autentificar la población animal que da origen a la carne, permitiendo controlar las denominaciones de origen y marcas de calidad, así como también llevar a cabo el seguimiento de individuos y productos que nos permitirá la identificación del foco original de posibles patologías Sistemas de identificación en ganado bovino En cuanto a los sistemas de identificación y movimiento de ganado bovino, el Reglamento (CE) 1760/2000 del Consejo y del Parlamento Europeo, que establece un sistema de identificación y registro de los animales de la especie bovina, enumera en su artículo 3 los elementos que han de constituir dicho sistema: Marcas auriculares, destinadas a identificar individualmente a cada animal Pasaporte para los animales Registros individuales llevados en cada explotación Bases de datos informatizadas 2
TRAZABILIDAD GENÉTICA Sistema de identificación de animales y productos basado en el ADN contenido en los mismos Instrumento potente para controlar y autentificar los sistemas de identificación tradicionales (crotales, tatuajes, sistemas electrónicos...), puesto que la información genética contenida por un individuo es inalterable durante toda su vida, está presente en cada parte de su organismo y es única en cada sujeto. Sistema con objetividad, repetibilidad y seguridad no alcanzable con ningún otro sistema Fundamentos de la identificación genética Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. Si tenemos en cuenta que el genoma de cada animal contiene aproximadamente 3x10 9 pares de bases (pb), las posibilidades que existen de variación entre los distintos individuos son enormes (3x10 6 ) Cómo se genera esta gran variación genética? Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual. Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis. Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas. Imposibilidad de la existencia de individuos genéticamente idénticos 3
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA 1. Toma de muestra: Cualquier muestra de células nucleadas, casi en cualquier estado. 2. Recogida de información de la muestra y establecimiento de una base de datos. sexo procedencia BASE DE DATOS número de identificación individual identificación del padre y de la madre explotación Resultados de genotipos 3. Análisis de diferentes marcadores genéticos en las muestras. Marcadores genéticos aplicados a la identificación individual Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, y por tanto poder ser usado como sistema de trazabilidad, necesita reunir una serie de características: Que sea muy polimórfico, Que esté distribuido por todo el genoma. Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación Que sea público. Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva. Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN. Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes. Que sea estable 4
5 7 246260 15 SPS115(D15) 15 137183 21 TGLA122(D21S6) 7 113125 20 TGLA126(D20S1) 10 7797 18 TGLA227(D18S1) 5 178190 1 BM1824(D1S34) 10 125143 2 BM2113(D2S26) 7 209223 5 ETH10 4 (D5S3) 10 196222 3 INRA023(D3S10) 8 140158 9 ETH225(D9S1) Bovina Nº alelos Tamaño Cromosoma Microsatélite Especie Microsatélites estandarizados a nivel internacional (ISAG) 152172 INRA132 258270 BM1818 100128 BM1258 9 148190 19 OARFCB304 14 269301 20 HSC 11 215261 CSRD247 9 122146 2 OARFCB11 7 82138 17 OARCP49 8 201219 1 NRA23 7 190210 D5S2 10 165179 5 MCM527 4 138150 15 SPS113 13 120154 10 INRA005 5 162174 6 BM1329 5 135165 5 OARAE129 6 181265 16 MAF214 7 169207 14 INRA063 3 121137 15 MAF65 12 92118 2 OARFCB20 Ovina Nº alelos Tamaño Cromosoma Microsatélite Especie
Especie Microsatélite Cromosoma Tamaño Nº alelos OARFCB20 ILSTS87 2 6 93109 137155 12 8 SRCRSP23 85119 15 INRA063 14 173179 7 SRCRSP05 21 158180 6 SRCRSP08 SRCRSP24 209235 139163 7 9 Caprina INRA005 MAF65 10 15 118126 121157 13 3 MCM527 5 152168 6 CSRD247 INRA23 3 221247 197215 11 9 BM1258 23 110120 BM1329 6 145161 BM1818 23 258270 I NRA132 23 152172 Efecto del número de microsatélites en la probabilidad de que dos muestras coincidan por azar 6
Porcentaje de individuos incorrectamente identificados en función del número de marcadores utilizados 2.DETECCIÓN DE OGMs EN MATERIAS PRIMAS MEDIANTE PCR 7
ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (Directiva 2001/18/CE) Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la recombinación natural CULTIVOS DE GMOs EN EL MUNDO 8
Evolución de los cultivos transgénicos Fuente: James, 2005 (ISAAA Brief 34) Evolución por tipo de cultivo 9
NUMERO DE PAÍSES EN LOS QUE SE CULTIVAN PLANTAS TRANSGÉNICAS 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1990 1998 2001 2002 2003 99% de la superficie cultivada con plantas transgénicas corresponde a cuatro países: Estados Unidos (66%), Argentina (23%), Canáda (23%), y China (4%) PRINCIPALES PAISES PRODUCTORES DE CULTIVOS TRANGÉNICOS SOJA MAÍZ PATATA ALGODÓN 10
Octubre 1998 hasta Mayo 2003 Moratoria europea No se ha autorizado ningún organismo transgénico De los 18 GMOs liberados al medio ambiente 8 son de utilización en la alimentación humana y animal * Maíz 2 variedades tolerantes a herbicidas (Ciba Geigy y AgrEvo) 1 variedad resistente a insectos (Monsanto) 1 variedad tolerante a herbicidas y resistente a insectos (Novartis) *Soja 1 variedad tolerante a herbicidas (Monsanto) * Colza 3 variedades tolerantes a herbicidas (Plant Genetic System y AgrEvo) 11
ETIQUETADO La UE reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003 El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente Creación de plantas transgénicas Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1% Mediante técnica PCR Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes 12
2.Autentificación de los componentes de los alimentos Diferenciación de distintas especies Patés y quesos Hamburguesas y productos cárnicos procesados 13
Proteícos Métodos analíticos Genéticos Identificación de fraudes en quesos RAPD: random amplification of polymorphic DNA RAPDPCR RAPDPCR 14
RAPDPCR Diferenciación de especies 750 pb 340 pb 310 pb 290 pb Caprino Ovino Bovino Sensibilidad de 25 pg RAPDPCR Quesos 750 pb B O C B/O B/C O/C O/B/C 340 pb 310 pb 15
RAPDPCR Patés 1 2 3 RAPDPCR RAPDPCR Patés C/Pt Pt O Pv Pll C Pt 16
PARA DIFERENCIAR ESPECIES BUSCAR REGIONES ESPECÍFICAS DE ESPECIE Pietrain Chato Murciano Landrace Large White Comprobar que se amplifica en todas las razas de cerdo La señal es positiva en cualquier raza de cerdos b o cp cv pll pv pt e Comprobar que ninguna otra especie animal daba una señal positiva Amplificación y cuantificación mediante un fragmento específico de especie. 1% 5% 10% 25% 50% 75% 100% Cuantificación por densitometría de la banda 17
4.Detección de microrganismos en alimentos Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas Deterioran los alimentos Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación VENTAJAS 1.Sensibilidad 2.Especificidad 3.Capacidad de procesamiento de gran número de muestras DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos): Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo bglucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra). Detección gen gtf mediante PCR DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades) 18
Microrganismos Trastorno Posible producto Método que ocasiona portador Acrobacter spp Diarrea Carne de aves RAPDPCR Bacillus cereus Diarrea, vómitos Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos PCR Campilobacter spp Diarrea Aves, cerdo, res y Leche cruda PCR múltiple Clostridium botulinum Botulismo, vómitos Pescado, miel, latas PCR anidado Clostridium perfringens E.Coli Listeria spp Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholera Yersinia enterocolitica Diarrea, dolor abd. Diarrea, colitis Listeriosis Gastroenteritis Fiebre, calambres Cólera Yersiniosis Carne de res y aves, Salsas Carne y productos Lácteos Pate, leche, queso, carne Mariscos, ensalada de col Leche, huevo crudo, carne de res y ave Mayonesa, vegetales crudos Leche y aves Ostras crudas, pescado PCR duplex PCR múltiple RT PCR PCRmúltiple RT PCR RT PCR PCR simple RT PCR Leche, tofu, canales de cerdo RT PCR EXISTEN KITS COMERCIALES BAX (Qualicom, USA) Salmonella Listeria E.Coli O157:H7 PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella Listeria TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella Listeria E.Coli O 157 19