Citometría de flujo Técnica de análisis celular multiparametrica (cuantifica componentes y estructuras celulares) cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas y de una célula en una por delante de un haz de láser focalizado. El citómetro de flujo se compone de tres sistemas sistema hidráulico, óptico y electrónico. El sistema hidráulico focaliza las células a través de un enfoque hidrodinámico (las diferentes presiones ejercidas sobre el líquido envolvente (menor presión) y sobre la suspensión celular (mayor presión) asegura de que las células permanezcan centradas y viajen una tras otra en el chorro de inyección y pasen una a una a través de la cámara de flujo para que células individuales sean interrogadas por el láser. A través de citometría de flujo SIEMPRE vamos a obtener información acerca del tamaño celular (Forward Scatter, FSC) y complejidad o granularidad (Side Scatter, SSC), adicional a esta información dependiendo de la cantidad de parámetros o marcadores celulares serán la información que nos muestre el citómetro de flujo; obviamente dependerá de la capacidad de nuestro citómetro es decir el tipo y cantidad de láseres así como los tipos de filtros que tenga nuestro citómetro y que puedan recoger la señal para posteriormente procesarla y pueda ser mostrada. Comparando FSC vs SSC, podemos obtener el siguiente DotPlot procesando células de sangre periférica SIN LA UTILIZACIÓN DE NINGÚN FLUOROCROMO, solo basados en las características intrínsecas de la célula: su tamaño y su complejidad celular. Entre más hacia arriba en el eje de las y se desplace nuestra población celular más compleja o mayor granularidad (dada por componentes celulares, proteínas, etc) será nuestras células Entre más a la derecha en el eje de las x se desplace nuestra población celular las células serán más grandes OJO!! La comparación entre FSC y SSC puede ser representada también en ejes contrarios al DotPlot representado arriba, es decir FSC en el eje de las Y y SSC en el eje de la X.
Una vez que hemos realizado el protocolo de tinción adecuado para las moléculas que queremos medir (extracelulares e intracelulares) podemos obtener básicamente dos representaciones de datos: Ejercicio 1. Citometría de flujo para inmunofenotipificación celular. Se analizó una muestra de sangre periférica de un paciente por citometría de flujo con el objetivo de evaluar sus poblaciones celulares. El citómetro nos muestra en el siguiente DotBlot la dispersión clásica (por FSC y SSC) de las poblaciones celulares presentes en la muestra y se ha seleccionado la ventana para linfocitos (en rojo) y de esta ventana se han analizado las poblaciones celulares mostradas en los DotBlot de las preguntas 1 y 2. 1. Investiga en que poblaciones celulares predomina la presencia de CD3, CD4, CD8, CD16, CD56 y CD19? 2. Basados en tus respuestas anteriores; en los siguientes DotBlot identifica las siguientes poblaciones celulares que se encuentran en los recuadros: Linfocitos T cooperadores, Células NK, Células B, Células T, Linfocitos T citotóxicos y Monocitos.
Ejercicio 2. Ciclo celular. El yoduro de propidio es un colorante fluorescente con una estructura de anillo planar lo que le permite intercalarse cuantitativamente entre la escalera de DNA. Al usar el citómetro de flujo para medir la fluorescencia proveniente de una población celular marcada con yoduro de propidio se pueden identificar que tantas células están en cada etapa del ciclo celular. Las células G1 tendrán la mitad del DNA de células G2 (a punto de iniciar mitosis) y las células que se están replicando en la fase S tendrán un valor intermedio. Basado en lo anterior, en el siguiente histograma identifica la región que corresponde células apoptóticas, así como las de fase S, G2/M y G0/G1. Ejercicio 3. Proliferación celular. Células HeLa fueron marcadas con carboxifluoresceína diacetil succinimidil ester (CFSE), se muestra el siguiente histograma de fluorescencia para CFSE proveniente de células HeLa. Basados en esta técnica y su fundamento, explica qué es lo muestra el histograma en cada uno de los diferentes colores. Nota h=horas de incubación
Ejercicio 4. Citotoxicidad celular. Células de la línea celular NK-92 (células NK con capacidad citotóxica) fueron co-cultivadas 48h con la línea celular de cancer cérvico-uterino HeLa (VPH18+); después las células NK fueron recolectadas y en estas células se evaluó viabilidad utilizando el colorante LIVE/DEAD así como la presencia de CD56 y CD107a. PMA/IONomicina fue utilizado como control positivo para estimular a las células NK y favorecer la citotoxicidad mediada por estas células (DotBlot sombreados en Rojo). Señala lo siguiente: 1. Qué células son las que se encuentran en la región R1 en ambas condiciones experimentales (Experimental y PMA/ION)? 2. Qué células están dentro de los recuadros en R2 en ambas condiciones experimentales, y explica el fundamento de los colorante de viabilidad? 3. Explica biológicamente en términos de citotoxicidad que es lo que se representan en los DotBlot inferiores de cada condición experimental? Experimental
Cultivo celular Es una técnica que involucra el aislamiento y mantenimiento in vitro de células aisladas de tejidos u órganos completos de animales, microbios o plantas Una vez establecidos son ideales para el estudio de procesos intracelulares como síntesis proteica, mecanismos de transducción de señales, metabolismo, interacciones célula-célula, genética, efectos tóxicos o farmacológicos etc. y poder elucidar o transpolar a mecanismos que ocurren in vivo. Cultivo Primario. Cuando la células derivadas directamente de un tejido animal embrión o adulto.? Normal o neoplásico? son removidas y sembradas en un medio adecuado, algunas se unen al sustrato, posteriormente se dividen y crecen. Inicialmente es una población heterogénea y un tiempo de vida finito (número de divisiones limitado) Subcultivo. Cuando las células del cultivo primario han crecido y han llenado toda la superficie y se han consumido los sustratos disponibles debe hacerse un pasaje o subcultivo a través de la remoción de células de una manera suave utilizando quizá una solución enzimática de disociación o mecánicamente Cultivo secundario. Deriva de un cultivo primario, aislado por selección o clonación. Es una población más homogénea, tiempo de vida finita in vitro. Línea celular. Consisten en un tipo celular que ha ganado su habilidad para tener un crecimiento establecido. Esto ocurre después de algún tratamiento con carcinógenos o exposición a virus tales como virus del simio 40 (SV40), Eptein-Barr (EBV) estos tratamientos causan que las células pierdan su habilidad de controlar su crecimiento. Crecen continuamente y su tiempo de vida es indefinido Dependiendo de su origen, las células pueden crecer ya sea en adherencia a un sustrato formando monocapas o bien crecer en suspensión: Células adherentes, están ancladas a la superficie del frasco de cultivo y crecen en monocapa, ejemplo células de origen epitelial. Células en suspensión, proliferan sin estar unidas a un sustrato, ejemplo células hematopoyéticas o algunas derivadas de tumores Cultivo tridimensional. las células cultivadas en 3D se comportan de manera más parecida a como lo hacen en sus organismos de origen. La importancia del cultivo tridimensional reside en que las células se encuentran en un sistema que mantiene la integridad de un órgano, de forma que las interacciones entre células están garantizadas. Las células cultivadas en ambientes 3D muestran diferencias, en comparación con las células cultivadas en ambientes 2D, en metabolismo, diferenciación, expresión de genes y proteínas, proliferación, viabilidad y respuesta a diferentes estímulos. Los científicos deben diseñar andamios para que apoyen y se organicen correctamente las células en general se utilizan geles, esponjas, bioreactores, microchips o bien libre de andamios por levitación magnética.
Medio de cultivo la composición general de los medios de cultivo es a base de: Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se pueden suplementar otros aminoácidos como la glutamina, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Vitaminas. En medios usualmente se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular. Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios. Hormonas y factores de crecimiento (suero), los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suelen suplementar sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: Oxígeno, las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica (95%). El dióxido de carbono (CO 2 ) juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO 2 disuelto, el ph y la cantidad de iones HCO3 -, generalmente se administra un 5% de CO 2. El ph óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4. Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, la mayoría de las células crecen bien a 37 C.
Ejercicio 5. Invasión celular. La proteína S10A11 es una proteína relacionada a migración celular en Carcinoma celular escamoso laríngeo. Se cultivó la línea celular Hep-2 (carcinoma laríngeo humano). Algunas células fueron transfectadas con un vector de silenciamiento para la proteína S10A11 es decir a través de este vector la proteína ya no se expresa porque el gen que codifica para esta proteína ha sido silenciado. Posteriormente se realizó un ensayo de invasión celular con células no tratadas, un control negativo y aquellas células que tienen el silenciamiento para S10A11 sirna. Se publica la siguiente Figura: 1. Con base al fundamento de la técnica de invasión celular y la referencia anterior, como podrías interpretar estos resultados?
Ejercicio 6. Migración celular. Con las mismas células y bajo las mismas condiciones experimentales mencionadas se realizó un ensayo de herida para evaluar migración celular. Se publica la siguiente Figura: 1. Con base al fundamento de la técnica de migración celular y la referencia anterior, como podrías interpretar estos resultados?