UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES PARA CONTROLAR LA INFECCIÓN POR Cichlidogyrus sclerosus (PLATYHELMINTHES: MONOGENEA) EN LA TILAPIA Oreochromis spp. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: LICENCIADO EN BIOLOGÍA PRESENTA: GRECIA EVELYN BENÍTEZ VILLA DIRECTOR: Dr. Miguel Rubio Godoy XALAPA, VER. NOVIEMBRE 2010
DEDICATORIA A MI HERMANA JESSICA L. BENÍTEZ VILLA ( ). Por ser mi inspiración y luz que guía mí camino día a día. A MIS PADRES. LOS AMO!! Gracias por darme los justos consejos y darme la oportunidad y apoyo incondicional para seguir preparándome profesionalmente y enseñarme que para lograr una meta se necesita de mucho esfuerzo. Por hacer de mí la persona que soy. A MI FAMILIA. Por los ánimos dados durante mi paso por la universidad. A PEDRO A. AGUILAR RODRÍGUEZ. Por estar conmigo en todo momento. Por aguantar mis malos ratos, por los consejos dados, por la motivación brindada. Gracias por no dejarme sola en ningún momento TE AMO!! A MIS AMIGOS. Por estar conmigo en las buenas y en las malas. Por apoyarme tanto a distancia como de cerca. LOS QUIERO!! A TODOS USTEDES MUCHAS GRACIAS!! i
AGRADECIMIENTOS Le agradezco al Instituto de Ecología, A.C. (INECOL, A.C.) por haberme permitido realizar mi trabajo de tesis en sus instalaciones. A mi director, el Dr. Miguel Rubio Godoy por darme la oportunidad de trabajar con él en uno de sus proyectos. Agradezco también a Ismael Guzmán Valdivieso, así como también a los chicos de estancia, tanto de Ciudad Juárez (Astrid Lucero Villa Bernal y Gustavo Ernesto Valencia Camacho) como de Puebla (Luis Muñoz), por haberme apoyado y ayudado en mí trabajo recepcional. Al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical El Clarín por brindarme el material biológico indispensable para este trabajo. ii
ÍNDICE DEDICATORIA.......i AGRADECIMIENTOS.......ii I. INTRODUCCIÓN...1 II. III. ANTECEDENTES..3 DIAGNOSTICO DEL HOSPEDERO....6 a. Clasificación taxonómica....6 b. Generalidades de Oreochromis sp. (Günther, 1889)... 7 IV. DIAGNOSTICO DEL PARÁSITO 9 a. Clasificación taxonómica 9 b. Generalidades de Cichlidogyrus sp (Paperna, 1960).10 V. OBJETIVOS.. 12 VI. MATERIAL Y MÉTODO 13 a. Campo 13 b. Laboratorio 14 A. ADMINISTRACIÓN DE ANTIHELMÍNTICOS..14 B. VACUNACIÓN DE TILAPIAS. 15 C. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INFECCIÓN SOBRE EL HOSPEDERO.....15 D. SELECCIÓN DEL MICROHÁBITAT..16 c. Gabinete.16 iii
VII. RESULTADOS.18 A. ADMINISTRACIÓN DE ANTIHELMÍNTICOS.....18 B. VACUNACIÓN DE TILAPIAS....20 C. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INFECCIÓN SOBRE EL HOSPEDERO.....26 D. SELECCIÓN DEL MICROHÁBITAT..27 VIII. IX. DISCUSIÓN..28 CONCLUSION.30 X. BIBLIOGRAFÍA...31 iv
I. INTRODUCCION La producción de peces a nivel mundial ha ido en aumento gracias a la acuacultura principalmente, superando a la producción de carne y a otros sectores de producción de alimentos de origen animal. La acuacultura en México es de gran importancia para la economía. En los años 1990 s México fue uno de los principales productores y consumidores en el mundo, especialmente de tilapia. El estado de Veracruz ocupó el primer lugar en producción de tilapia a nivel nacional en el 2008 con 13,142 toneladas de tilapias (CONAPESCA, 2008). Las tilapias (peces de los géneros Tilapia y Oreochromis) pertenecen a la familia Cichlidae, son organismos de origen africano, dulceacuícolas, que peculiarmente se encuentran en hábitats tropicales. Fueron introducidos a México en 1964 y tienen la característica de adaptarse a varias condiciones del medio. La especie de tilapia más ampliamente cultivada en México es la tilapia del Nilo o nilótica, Oreochromis niloticus. A pesar de que gracias a la acuacultura la producción de tilapias ha aumentado, en muchas granjas piscícolas el tamaño de los tanques en donde se encuentran es pequeño para la cantidad de peces que contiene, provocando una mala higiene y con ello facilitando la presencia de agentes causantes de enfermedades. Para evitar la baja en la producción de tilapias a causa de enfermedades producidas tanto por bacterias como por parásitos, científicos han realizado investigaciones para prevenir y/o controlar dichas enfermedades a base de baños de inmersión, antihelmínticos y vacunas, teniendo en cuenta las condiciones del medio, el sistema inmune de los peces y la vía adecuada de aplicación de los distintos tratamientos. El uso de vacunas, en parasitología, tiene como objetivo prevenir o reducir la infección en el hospedero (Meeusen & Piedrafita, 2003), pues a la fecha no existe ni una sola formulación que controle efectivamente a ningún parásito (helminto o protozoario). En peces, la ruta intraperitoneal es la ruta más efectiva para inducir protección contra el parásito, pues asegura una dosis idéntica en todos los individuos y permite la adición de adyuvantes que estimulan al sistema inmunitario e inducen protección por más tiempo (Midtlyng, 1996; Gudding et al., 1999; Klesius et al., 2000; Bowden et al., 2003 a; Evans et al., 2004). 1
Uno de los parásitos que ataca a la tilapia es el platelminto Cichlidogyrus sclerosus, parásito branquial hematófago perteneciente a la clase Monogenea. En México, se ha reportado su presencia en peces cultivados y ferales (Flores Crespo & Flores Crespo, 2003; Pérez Ponce de León & Choudhury, 2005; Aguirre Fey, 2009), así como su transferencia a cíclidos nativos (Jiménez García et al., 2001). No obstante que Sandoval Gío et al. (2007) sugieren una respuesta inmune en el pez, no hay antecedentes específicos de cómo proteger a la tilapia contra éste parásito. El presente estudio aportará información para productores e investigadores interesados en el tema. Éste consistió en dos partes, la primera de ellas en tratar a la tilapia con 4 antihelmínticos para intentar reducir la carga parasitaria del monogéneo C. sclerosus. En la segunda parte se aplicó de una vacuna experimental, preparada con gusanos colectados y adyuvante completo de Freund (FCA), para intentar reducir la infección en la tilapia parasitada; y la aplicación de 2 tratamientos controles, que permitan comparar los niveles de infección tanto de los peces vacunados experimentalmente como de los controles. 2
II. ANTECEDENTES Antihelmínticos en peces Los antihelmínticos utilizados principalmente de manera ingerida para contrarrestar la carga parasitaria de monogéneos han sido el praziquantel (PZQ) y mebendazol, tanto solos como en mezcla con otros antihelmínticos. Kim & Choi (1998) administraron los antihelmínticos mebendazol y bitionol vía oral en los peces roca coreanos Sebastes schlegeli (Sebastidae) contra del monogéneo Microcotyle sebastis (Monogenea), dando como resultado un 100% de eficacia en los tratamientos con bitionol en ambas dosis (50 y 100mg/Kg) y una reducción en la carga parasitaria con mebendazol en 100mg/Kg. Otra investigación realizada por Kim et al. (2000) consistió en la administración de PZQ, tanto solo como en combinación, con cimetidina en peces S. schlegeli por vía oral contra M. sebastis, teniendo un mejor resultado en la combinación de ambos antihelmínticos en dosis de 200mg/Kg de peso cada uno. Williams et al. (2007), en el trabajo realizado en el jurel Seriola lalandi (Carangidae) contra los monogéneos Zeuxapta seriolae y Benedenia seriolae obtuvieron una reducción en la carga parasitaria utilizando el antihelmíntico PZQ en dosis de 50 y 70mg/kg por 6 días y 100 y 150mg/kg por 3 días. Rubio-Godoy & Tinsley (2004) también usaron PZQ para matar Discocotyle sagittata en truchas arcoíris Oncorhynchus mykiss. Utilizaron una solución de PZQ en etanol (5:95 partes), utilizando de 2 3 ml por 1% peso sobre volumen, siendo 100% efectivo. Aplicación de vacunas en peces. Si bien el mejor mercado de vacunas es para salmónidos y truchas, también se encuentran en el mercado vacunas disponibles para peces como el bagre de canal, robalo, besugo y tilapia (Sommerset et al, 2005). Midtlyng en 1996 vacunó Salmónidos contra la Furunculosis. La primera vacuna comercial fue producida en Colorado, Estados Unidos en 1976 para proteger a los peces de la enfermedad entérica de la boca roja y contra vibriosis a través de 3
una vacunación por inmersión (Bowden et al, 2003). También hay varias vacunas efectivas contra virus. Referente a vacunas contra helmintos, científicos rusos fueron los primeros en producir vacunas experimentales en peces contra monogéneos. Vladimirov (1971), aplicó en la cavidad peritoneal de la carpa Cyprinus carpio la preparación homogénea de Dactylogyrus vastator demostrando una relativa protección en los peces vacunados comparado con los peces controles. Kim et al. (2000) aplicaron una vacuna en peces S. schlegeli contra el monogéneo Microcotyle sebastis utilizando como antígeno al gusano entero emulsificado con adyuvante completo de Freund. La inmunización produjo una disminución significativa de la carga parasitaria en los peces vacunados comparados con los peces control. Otra vacuna desarrollada en peces contra monogéneos fue la realizada por Rubio-Godoy, et al. (2003), quienes inyectaron intraperitonealmente a truchas arcoíris O. mykiss utilizando dos extractos diferentes del monogéneo D. sagittata disueltos en PBS y en FCA, dando como resultado una reducción mayor del 50% en la carga parasitaria en peces vacunados. En particular, para especies de agua cálida como la tilapia, la vacunación es aún reducida y todas las vacunas son experimentales (Klesius et al., 2000; Swain, 2002; Evans et al., 2004). En la investigación realizada por Sandoval-Gío et al. (2007) relativa a la respuesta de anticuerpo de la tilapia contra Cichlidogyrus spp., en donde se inoculó a la tilapia intraperitionalmente con el parásito, se sugiere que la tilapia es capaz de producir una respuesta inmune humoral contra el monogéneo. Relación hospedero parásito. En cuanto a relación hospedero-parásito, se ha asociado el número de parásitos presentes en branquias de peces en relación con el tamaño de éstos (Herrera-Cubilla & Amalia, 1986), así, entre más grande sea el pez mayor cantidad de parásitos tendrá. Poulin & George-Nascimento (2007), analizaron en distintos taxas, con diferentes helmintos, la relación entre la masa corporal del hospedero y la carga parasitaria, encontrando una relación directa. 4
Una investigación realizada sobre patologías asociadas a monogéneos branquiales en Cachama (Colossoma macropomum) bajo cultivo, señala una relación directa entre longitud, peso del pez y la carga parasitaria total. En este sistema se determinó además que el hematocrito del hospedero disminuye al aumentar la carga parasitaria (Aragort et al., 2002). Rubio Godoy & Tinsley (2008), en su trabajo sobre los efectos de la infección de D. sagittata en trucha arcoíris, muestran una correlación negativa entre la carga parasitaria y la condición corporal del pez; además, presentan evidencia de que el parásito ocasiona mortalidad del hospedero. Selección del microhábitat. Los Factores que se postula influyen en la selección de microhábitat de los monogéneos branquiales son: Flujo de agua y oxígeno. Paling (1968); Raymond, et al. (2006); Gutiérrez & Martorelli (1999); Rubio Godoy & Tinsley (2002); Turgut et al. (2006); Hafidi et al. (1998) sugieren que los monogéneos prefieren un microhábitat en donde el flujo de la corriente del agua y la cantidad de oxigeno son altas, esto es, en los arcos branquiales internos (II y III). Área de las branquias. Gutiérrez & Martorelli (1999), sugieren que los monogéneos seleccionan arcos con una mayor área (arcos I y II). Disponibilidad de alimento. Geets et al. (1997), sugieren que la distribución de los monogéneos se debe a la disponibilidad de su alimentación (sangre o moco). Competencia inter e intraespecífica (migraciones para evitar competencia). La competencia interespecífica es baja, sin embargo, factores intraespecíficos podrían jugar un papel importante en la selección del microhábitat de los monogéneos (Geets et al., 1997; Hafidi et al., 1998; Iannacone et al, 2003; Soylu et al, 2010). Fenotipos haptoriales (el haptor es un órgano de fijación característico de los monogéneos, generalmente armado con espinas, ganchos, ventosas, pinzas). Jeannette et al. (2010), menciona que factores intrínsecos como fenotipos haptoriales juegan un papel importante en la selección del microhábitat. 5
III. DIAGNOSTICO DEL HOSPEDERO a. Clasificación taxonómica Reino Animalia Phylum Clase Infraclase Orden Familia Chordata Actinopterygii Teleostei Perciformes Cichlidae Genero Oreochromis (Günther, 1889) (Fig. 1) Fig.1. Imagen de Pargo-UNAM. Fuente: Grecia E. Benítez Villa. 6
b. Generalidades de Oreochromis sp (Günther, 1889) Las tilapias son peces de la familia Cichlidae, provenientes de África, habitando peculiarmente en regiones tropicales (Fitzsimmons, 2000). Se encuentran distribuidas por América Central, sur del Caribe, sur de Norteamérica y el sudeste asiático; a México fueron introducidas en 1964 (Pullin et al. 1997). Los peces presentan un par de branquias con las cuales realizan el intercambio gaseoso para respirar. Estas están divididas en 4 arcos branquiales, numerados en forma descendiente desde el más anterior hasta el más posterior (Fig. 2). Cada uno de los arcos está formado por filamentos branquiales, los cuales están llenos de sangre. Fig. 2. Esquema mostrando la disposición de los arcos branquiales. Fuente Petracini, 2001. Las tilapias se adaptan fácilmente a las condiciones de diversos cuerpos de agua a los que son introducidos, tales como arroyos, ríos, lagos, lagunas, presas, estanques, estuarios e incluso hábitats marinos (Stickney, 1993). Son especies eurihalinas (5 a 30 ppm) y euritérmicas (12 a 42 o C). Sus hábitos reproductivos le permiten una sobrevivencia no alcanzada en aquellos peces que ponen decenas o cientos de miles de huevecillos. Una hembra de entre los 150 y 300 grs desova entre 800 y 1600 huevos con una frecuencia de desove de 10 veces por año. Los huevos fertilizados por el macho (de 100 a 500) son recogidos por la hembra depositándolos en la cavidad inferior de la mandíbula y los conserva en ella durante el tiempo que dura el desarrollo embrionario (Nandlal & Pickering, 2004). 7
Debido a cualidades como son su crecimiento acelerado, tolerancia a altas densidades, adaptación al cautiverio, aceptación de una amplia gama de alimentos, resistencia a enfermedades, carne blanca de calidad y con amplia aceptación por parte de los consumidores, las tilapias, han despertado gran interés comercial en la acuicultura mundial (Stickney, 1993). A pesar de ser parcialmente resistentes a enfermedades y ser capaces de alimentarse de bacterias del cieno, las tilapias mexicanas son infestadas por parásitos como lo son: protozoarios (Ichthyophthirius multifilis, Trichodina y Chitodonella, Ichthyobodo necatrix, Costia necatrix, Sporozoa, Myxosporidia); monogéneos (Cichlidogyrus, Gyrodactylus), céstodos, nemátodos (Contracaecum); y crustáceos parásitos (Argulus, Ergasitus y Lernea) ( Jimenez Guzman et al., 1988). Los peces afectados por monogéneos presentan retardo en el crecimiento, disminución de peso y una marcada reducción de la tasa de fertilidad, que provoca un descenso general en los volúmenes de producción, poniendo en riesgo la rentabilidad económica del cultivo (Flores Crespo & Flores Crespo, 2003). La biodiversidad de helmintos en peces dulceacuícolas de México está determinado por la biogeografía histórica y contemporánea de sus hospederos (Pérez Ponce de León & Choudhury, 2005). La tilapia es parasitada en Veracruz por el monogéneo Cichlidogyrus sp. Aguirre-Fey (2009) en un estudio de un año de duración siguiendo a variedades de tilapia cultivadas en el estado, registró los siguientes rangos de valores máximos de intensidad de infección para O. niloticus gris de 112.05 + 12.9 gusanos/ hospedero a 105 + 35.8 gusanos/hospedero, O. niloticus rosa de 356 + 80.3 gusanos/hospedero a 352.9 + 80.4 gusnos/hospedero, O. mossambicus de 174.4 + 39 gusanos/hospedero a 177.2 + 39.1 gusanos/hospedero y Pargo UNAM de 373.4 + 87.5 gusanos/ hospedero a 371.2 + 87.4 gusanos/hospedero. El Pargo UNAM, pez en el cual se realizaron los tratamientos en este trabajo, presenta una composición genética de 50% tilapia roja de Florida, 25% de tilapia Rocky Mountain y 25% de O. niluticus rosa (Aguirre-Fey, 2009). 8
IV. DIAGNOSTICO DEL PARÁSITO a. Clasificación taxonómica Reino Animalia Phylum Clase Orden Familia Platyhelminthes Monogenea Dactylogyroidea Ancyrocephalinae Género Cichlidogyrus (Paperna, 1960) Especie C. sclerosus. (Fig. 3) a) b) Fig. 3. Imagen de Cichlidogyrus sclerosus. a) Fuente: Daniel Aguirre Fey. b) Fuente: Grecia E. Benítez Villa 9
b. Generalidades de Cichlidogyrus (Paperna, 1960) Los Cichlidogyrus son parásitos branquiales de agua dulce, de la clase Monogenea, pertenecientes al phylum Platyhelminthes. Son gusanos planos triblásticos, pequeños, miden entre 0.5 a 6mm de largo. Se diferencian por presentar el extremo posterior del cuerpo modificado en un órgano de fijación característico, que recibe el nombre de opistohaptor (también conocido como haptor), generalmente armado como espinas, ganchos, ventosas, pinzas, etc. Carecen, en estado adulto, de epidermis, pero presentan una cutícula. Son hermafroditas y su ciclo de vida es directo. La fecundación es cruzada y durante la cópula los espermatozoides son introducidos en la vagina. Los óvulos son fertilizados en el ootipo o antes de entrar a éste. El número de huevos es pequeño (1-12) éstos quedan en el útero y salen al exterior por el poro genital. Suelen ser operculados, la mayoría de los huevos pueden desprenderse y ser arrastrados fuera de las branquias cayendo al fondo del estanque, en donde completarán su desarrollo. En el huevo se desarrolla una larva ciliada (oncomiracidio), que es libre nadador. Cuando el oncomiracidio encuentra un nuevo hospedero se instala en él y gradualmente se transforma en adulto. Los parásitos pueden provocar anemia debido a que son hematófagos. Por otro lado, las heridas producidas por monogéneos provocan infecciones secundarias como la instalación de bacterias, hongos y virus. Los efectos provocados dependen también de la carga parasitaria, si la carga es mínima hay tanto alteraciones en la fertilidad del pez así como en su crecimiento; por lo contrario, si la carga parasitaria es elevada provoca desde pérdida de peso hasta la mortalidad del pez, como en el caso de la trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss (Buchmann, 1998 y Lindenstrom, 2000). Otros efectos producidos por monogéneos son coloraciones grisáceas de las branquias, las cuales se encuentran recubiertas de moco abundante y algunas veces se observan hipertrofias (aumento anormal de las lamelas). En algunas ocasiones la hinchazón branquial impide a los peces cerrar la cavidad branquial. 10
En cuanto a especificidad hospedatoria, en general los monogéneos presentan una alta especificidad hospedatoria debido a caracteres fisiológicos, genéticos y ecológicos. Este es el caso de Cichlidogyrus, los cuales son parásitos exclusivos de los cíclidos de ahí su nombre-. Se reconocen dos diferentes líneas en los monogéneos: los monopisthocotyleos y los polyopisthocotyleos. La diferencia alimentaria es que los polyopisthocotyleos se alimentan de sangre, mientras que los monopisthocotyleos se alimentan de epitelio superficial e intestinal, moco y en limitadas ocasiones de heridas hemorrágicas (Buchmann & Bresciani, 2006). 11
V. OBJETIVOS General: Reducir la carga parasitaria de Cichlidogyrus sclerosus en las tilapias Oreochromis spp (Pargo-UNAM). Particulares: Determinar la efectividad de cada uno de los antihelmínticos administrados a la tilapia Oreochromis spp. Evaluar si la aplicación de una vacuna disminuye la carga parasitaria de Cichlidogyrus sclerosus en las tilapias Oreochromis spp. Evaluar el efecto en la tilapia Oreochromis spp. de la infección por Cichlidogyrus sclerosus. Determinar la selección del microhábitat del monogéneo Cichlidogyrus sclerosus en las branquias de Oreochromis spp. 12
VI. MATERIAL Y MÉTODO Para la realización del presente proyecto, se consideró dividir las actividades en tres fases: de campo, de laboratorio y de gabinete. a) Campo La colecta de peces se realizó en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical El Clarín (CEIEGT) localizada en el Km 5.5 de la Carretera Federal Martínez de la Torre-Tlapacoyan (Fig. 4). Fig. 4. Mapa del Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical El Clarín (CEIEGT). Fuente: Domínguez Guadarrama, 2009. En mayo y julio del 2010, se colectaron 2 lotes de 150 Pargo-UNAM del mismo lote, las cuales se transportaron en bolsas de plástico al laboratorio. NOTA: Los peces nacieron el 30 de abril de 2010. Por lo tanto, en mayo tendrían 1 mes de edad y en julio 2 meses. 13
b) Laboratorio Los peces se colocaron en peceras previamente equipadas. La parte experimental duró 4 meses (junio de 2010 hasta septiembre de 2010) y se dividió en dos partes: la primera fue la administración de antihelmínticos a los peces, y la segunda fue la vacunación de las tilapias. Para cuantificar los parásitos branquiales, cada uno de los peces se sacrificó haciendo una incisión profunda entre la cabeza y el cuerpo. Cada uno de los peces sacrificados fue pesado y medido (talla patrón). Se continuó con la extracción de branquias. Para una buena observación se dividieron los arcos branquiales en distintas cajas de Petri con agua (para evitar que se secara la muestra). Utilizando un microscopio de disección, se procedió a peinar cada arco con la ayuda de pinceles de 8 cerdas y se contabilizaron los C. sclerosus. Para tener un estimado de la carga parasitaria basal de los peces experimentales, antes de iniciar los tratamientos, se sacrificaron algunos peces y se realizó el conteo de parásitos siguiendo la metodología recién explicada. A. ADMINISTRACIÓN DE ANTIHELMÍNTICOS Para conocer el antihelmíntico adecuado que garantizara la desparasitación de las tilapias, con un porcentaje alto de eficacia del tratamiento, se administraron 4 antihelmínticos diferentes y combinaciones entre ellos a las dosis indicadas en la Tabla 1. Para la dosis administrada de cada antihelmíntico se tomó en cuenta el peso del pez (promedio 5g cada pez); sin embargo la dosificación empleada fue mayor que la recomendada para cada una de las sustancias, debido al posible escape del fármaco por la boca. Tabla 1. Relación de los antihelmínticos con la dosis administrada en los peces. Antihelmíntico Pirantel 0.015 Dosis recomendada mg/g Dosis administrada mg/g 1.5 0.1 3 0.2 Dosis volumen (ml) Mebendazol 0.02 0.2 0.1 0.4 0.2 Praziquantel 0.005 0.01 0.1 14
Praziquantel / 0.005 Albendazol 0.02 Albendazol / 0.02 Mebendazol 0.02 Praziquantel / 0.005 Albendazol / 0.02 Mebendazol 0.02 0.025 0.5 0.5 0.5 0.0125 0.25 0.5 0.1 0.1 0.1 Para administrar los fármacos se anestesió al pez colocándolo en una pecera de 20 litros con benzocaína (2ml). Una vez anestesiado el animal, se intubó y se le administró el antihelmíntico por el tubo insertado hasta la tráquea. Enseguida se colocó el pez en una pecera con agua limpia, y se observó hasta que se recuperó de la anestesia. Para evaluar el efecto del tratamiento antihelmíntico, se sacrificaron peces tratados después de 1 y 24 horas, y se determinaron los niveles de infección. B. VACUNACIÓN DE TILAPIAS. Los tratamientos aplicados se realizaron de la siguiente manera: La vacuna experimental consistió en inyectar a cada uno de los peces tratados, 2 C. sclerosus fijados en alcohol etílico al 70%, lavados con agua inyectable, utilizando como vehículo 0.06ml de adyuvante completo de Freund (FCA). Para el experimento utilizamos 2 controles. El control I consistió en la aplicación de adyuvante completo de Freund (.06ml) sin parásitos, ésto para determinar si el adyuvante en la vacuna ocasionaba algún tipo de protección en los peces; y el control II consistió en la inoculación con agua inyectable (0.06ml) sola, con el fin de someter a los peces a la misma manipulación que a los otros grupos experimentales. Posteriormente, se sacrificó a la primera mitad de peces de cada tratamiento a las dos semanas de aplicarlo. La otra mitad se sacrificó al mes de aplicación. C. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INFECCIÓN SOBRE EL HOSPEDERO Para evaluar el efecto de la infección por C. sclerosus en las tilapias, se estudió la correlación entre dos parámetros en cada uno de los animales sacrificados (el hematocrito y el índice de condición corporal) y sus cargas parasitarias. 15
Hematocrito: Una vez hecha la incisión en la cabeza del pez sacrificado, se tomó un tubo para hematocrito y se colocó en la incisión; de este modo la sangre recorrió el tubo. Se selló el tubo con plastilina una vez obtenida la muestra y se colocó en la centrifuga a 3000rpm por 3 minutos. Después de la centrifugación se midió con regla vernier la cantidad total de sangre (plasma y células, lo cual correspondía al 100%), y posteriormente se midió la fracción correspondiente de las células únicamente. El hematocrito consiste en la proporción porcentual de glóbulos rojos presente en la muestra. NOTA: El hematocrito ayuda a determinar si hay presencia o no de anemia en los peces con respecto a la cantidad de parásitos presentes. El valor normal para las tilapias, según Bittencourt et al. (2003), es de 31.85% ± 8.45. Una vez cuantificado el hematocrito se midieron la talla patrón y peso del pez. D. SELECCIÓN DE MICROHÁBITAT En cuanto a la selección del microhábitat, se anotó el número de parásitos encontrados en cada uno de los arcos branquiales (I, II, III y IV). c) Gabinete Los parámetros ecológicos de la infección que utilizamos en este trabajo son los definidos por Bush, et al. (1997): abundancia conocida (número de individuos de una especie de parásitos en un hospedero infectado o no) y prevalencia (número de hospederos infectados con una o más especies de parásito). En cuanto a la determinación de la efectividad de cada uno de los fármacos, se llevó a cabo por medio de una relación porcentual de parásitos muertos comparado con el total de parásitos encontrados. La mortalidad de peces asociada al tratamiento, se realizó por medio de una tabla indicando el porcentaje de peces que se murieron después de la aplicación de cada uno de los fármacos. Con referente a la abundancia de la infección por especie se utilizaron intervalos de confianza al 95% calculadas con una prueba de Bootstrap (BCa) con 2000 repeticiones; para evaluar si 16
hubo diferencias significativas entre las cargas parasitarias de los peces experimentales vacunados y los peces controles, se compararon las abundancias de ambos grupos usando pruebas t-bootstrap con 2000 repeticiones; los tratamientos con abundancia significativamente diferentes presentaron un valor de P< 0.05% (probabilidad de que dos tratamientos sean iguales). Ambos análisis estadísticos se realizaron con el programa Quantitative Parasitology (QP) 3.0. El coeficiente de condición corporal (K) es una forma de evaluar el estado de salud del pez y se calcula por medio de la fórmula (Lemly & Esch, 1984): K= 100 x peso (g). Talla patrón (cm)3 Para evaluar si la infección afecta al hospedero, se estudió la asociación entre la cantidad de parásitos presentes en cada pez y tanto su hematocrito como su índice de condición corporal. Ambas asociaciones fueron evaluadas con correlaciones de Pearson calculadas con Minitab 15. La selección del microhábitat se describe por medio de una tabla indicando el porcentaje de la población de gusanos que se encontró en cada uno de los arcos branquiales. 17
VII. RESULTADOS A. ADMINISTRACIÓN DE ANTIHELMÍNTICOS En el nivel basal, esto es la carga parasitaria de los peces antes de los tratamientos, las tilapias presentaron una prevalencia del 90% y una abundancia de 27.75 gusanos/hospedero. Los niveles de infección después de cada tratamiento fueron altos, por lo que no se puede hablar de efectividad del tratamiento según la definición habitual de efectividad (que consistiría en la capacidad de eliminar completamente las infecciones de los sujetos tratados). Una vez definida la palabra efectividad, en este trabajo los resultados obtenidos de cada tratamiento se manejaron como capacidad de matar al parásito, puesto que no hubo efectividad alguna. Para efectos de esta tesis, evaluamos el efecto de la administración de antihelmínticos como pirantel, mebendazol, PZQ, PZQ con albendazol, albendazol con mebendazol y PZQ con albendazol y mebendazol en C. sclerosus. Los datos son presentados en la Tabla 2. Tabla 2. Relación de los antihelmínticos administrados con la capacidad de matar al monogéneo C. sclerosus. Antihelmíntico Pirantel Mebendazol Dosis administrada mg/g 1.5 3 0.2 0.4 Capacidad de Tiempo (hr) matar a C. sclerosus 1 12.50% 24 47.91% 1 14.80% 24 39.81% 1 6.80% 24 21.38% 1 12.12% 24 37.39% Praziquantel 0.01 24 33.78% Praziquantel / albendazol Albendazol / mebendazol 0.025 0.5 0.5 0.5 Praziquantel / 0.0125 albendazol / 0.25 mebendazol 0.5 24 53.76% 24 48.05% 24 22.22% 18
Por otro lado hubo mortalidad de peces asociada al tratamiento, teniendo así que los fármacos pirantel en dosis de 3mg/g, mebendazol en 0.4mg/g y praziquantel 0.01mg/g a 24 hr. provocaron un alto porcentaje de mortalidad en los peces (Tabla 3). Tabla 3. Relación de los antihelmínticos con la mortalidad de peces asociada al tratamiento. Dosis Mortalidad Antihelmíntico administrada Tiempo (hr) peces mg/g 1 0 1.5 24 0 Pirantel 1 0 3 24 33.30% 1 0 0.2 24 25% Mebendazol 1 0 0.4 24 50% Praziquantel 0.01 24 44.21% Praziquantel / albendazol Albendazol / mebendazol 0.025 0.5 0.5 0.5 Praziquantel / 0.0125 albendazol / 0.25 mebendazol 0.5 24 0 24 25% 24 2.38% en 19
Prevalencia B. VACUNACIÓN DE TILAPIAS Con respecto a los resultados adquiridos en los tratamientos en donde se aplicó una vacuna fueron interesantes. Para poder evaluar los resultados, se tomó en cuenta el nivel basal tanto de prevalencia como de abundancia de los peces sin tratamiento. En cuanto a prevalencia, se obtuvo que para los 15 días después de la aplicación de tratamientos, los peces tratados con la vacuna tuvieron una prevalencia menor que el resto de los tratamientos, teniendo en cuenta que el 90% de los peces sin tratamiento presentaron parásitos (Fig. 5). Prevalencia a los 15 días 100.00% 90.00% 80.00% 70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% Tratamiento Tratamiento (Tx) Sin Tx Vacuna FCA (Control I) Agua inyectable (Control II) Fig. 5. Prevalencias de Cichlidogyrus sclerosus en los distintos grupos experimentales de tilapias a los 15 días de la aplicación del tratamiento. Para los 30 días, la prevalencia de los tratamientos es significativamente diferente, ya que la prevalencia en la vacuna fue significativamente menor (0%) en comparación con el resto de los tratamientos. Por otro lado, las prevalencias de los grupos control I, FCA y II, agua inyectable fueron interesantes, ya que la prevalencia del grupo control II, agua inyectable, es menor (41.17%) que el grupo control I, FCA, (100%); como se puede observar en la Fig. 6. 20
Prevalencia Prevalencia 120.00% Prevalencia a los 30 días 100.00% 80.00% 60.00% 40.00% 20.00% Tratamiento (Tx) Sin Tx Vacuna FCA (Control I) Agua inyectable (Control II) 0.00% Tratamiento Fig. 6. Prevalencia de C. sclerosus en los distintos grupos experimentales de tilapias a los 30 días de la aplicación del tratamiento. Para resumir, se juntaron los datos obtenidos a los 15 y 30 días de tratamiento. Esto indica que la prevalencia de la vacuna es significativamente menor que el resto de los tratamientos con 19.04%, mientras que la prevalencia más alta fue la de los peces tratados con FCA (96.87%). Esto se puede ver en la Fig. 7. 120.00% 100.00% 80.00% 60.00% Prevalencia Tratamiento (Tx) Sin Tx Vacuna 40.00% 20.00% 0.00% Tratamiento FCA (Control I) Agua inyectable (Control II) Fig. 7. Prevalencia de C. sclerosus en los distintos grupos experimentales de tilapias con los tratamientos de 15 y 30 días juntos. 21
En cuanto a la abundancia de infección, se presentan los datos obtenidos a los 15días, a los 30 días y la suma de los datos anteriores, como resumen del efecto de la vacunación sobre las cargas parasitarias. En Fig. 8 se presentan las abundancias calculadas para cada grupo experimental; mientras que en la Fig. 9 se presentan los contrastes pareados entre todos ellos. En la gráfica de abundancia por tratamiento a los 15 días (Fig. 8), se observa una diferencia significativa de abundancia entre los peces vacunados y los tratados tanto con FCA como los peces sin tratamiento; también se observa una diferencia significativa entre los peces sin tratamiento y los peces control II, agua inyectable. A pesar de esto, estadísticamente los tratamientos significativamente diferentes en cuanto a la abundancia fueron los peces sin tratamiento contra los vacunados, así como los bichos sin tratamiento contra los del grupo control II, agua inyectable (Fig. 9). Fig. 8. Gusanos por pez de cada uno de los tratamientos a los 15 días después de su aplicación. Se presentan los intervalos de confianza de la abundancia al 95%. Las barras con diferente letra son abundancias significativas distintas. 22
Fig. 9. Comparación de abundancias de cada uno de los tratamientos a los 15 días y valores de P. En los resultados obtenidos en la abundancia a los 30 días (Fig. 10), a pesar de que hay una diferencia notable entre la abundancia del grupo vacunado y todos los demás tratamientos, las diferencias de abundancia sólo fueron estadísticamente significativas entre los vacunados y sin tratamiento y entre los peces no tratados y el control II, agua inyectable. (Fig. 11). Fig. 10. Gusanos por pez de los tratamientos a los 30 días después de la aplicación. Se presentan los intervalos de confianza de la abundancia al 95%. Las barras con distinta letra son abundancia estadísticamente significativas. 23
Fig. 11. Comparación de abundancias de cada uno de los tratamientos y valores de P. Debido a que en ninguno de los grupos experimentales se encontraron diferencias significativas entre las abundancias determinadas a los 15 y 30 días después de la aplicación de los tratamientos (Fig. 12), se sumaron los datos de las dos fechas de muestreo. Fig. 12. Comparación de abundancias entre tratamientos y valores de P. En resumen, el efecto de la vacunación se presenta en la Fig. 13. Las abundancias estadísticamente significativas se observaron entre los peces vacunados y los peces sin tratar (P=0.0285); entre el grupo control II, agua inyectable, y vacunados (P=0420); así como también entre el grupo control II, agua inyectable y los peces sin tratamiento (P=0.039) (Fig. 14). 24
Fig. 13. Gusanos por pez de cada tratamiento. Se presentan los intervalos de confianza de la abundancia al 95%. Las barras con distinta letra son abundancias estadísticamente significativas. Fig. 14. Comparación de abundancias de los tratamientos y valores de P. 25
C. EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA INFECCIÓN SOBRE EL HOSPEDERO En lo que respecta a la correlación entre la carga parasitaria y el hematocrito, esta fue negativa, con un valor de P = 0.041 (Fig. 15). H e m a t o c r i t o 60 50 40 30 20 10 0 Parásitos vs hematocrito 0 20 40 60 Gusanos/pez y = -0.270x + 36.35 R² = 0.066 Series1 Lineal (Series1) Fig. 15. Correlación de Pearson entre carga parasitaria y hematocrito. Se presenta la línea de tendencia. Por otro lado, no se obtuvo una correlación significativa entre la carga parasitaria y el índice corporal K (P= 0.794; Fig. 16). Parásitos vs Índice corporal K Í. c o r p o r a l K 7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 250 y = 0.000x + 3.346 R² = 0.000 Series1 Lineal (Series1) Gusanos/pez Fig. 16. Correlación de Pearson entre la carga parasitaria y el índice corporal K. Se presenta la línea de tendencia. 26
D. SELECCIÓN DEL MICROHÁBITAT En cuanto a la selección del microhábitat, se encontraron un total de 975 parásitos, los cuales tuvieron una preferencia para los arcos laterales (I y IV), siendo el arco I el que presentó la mayoría de C. sclerosus con un total de 332 gusanos (34.05%), como se puede ver en la tabla 4. Tabla 4. Relación porcentual de la carga parasitaria en cada uno de los arcos branquiales. Arcos branquiales I II III IV Parásitos 332 208 179 252 Porcentaje 34.05% 21.33% 18.35% 25.84% 27
VIII. DISCUSION Nuestros resultados indican que ninguno de los antihelmínticos que probamos es efectivo para eliminar a C. sclerosus: ninguno de los compuestos fue eficaz para reducir significativamente las cargas parasitarias. A pesar de haber usado dosis más altas que Kim & Choi (1998) del antihelmíntico mebendazol, no obtuvimos resultados positivos. Ellos en cambio al utilizar una dosis menor obtuvieron una baja en la carga parasitaria. Respecto al antihelmíntico praziquantel, no redujo la carga parasitaria. Los autores Kim et al. (2000) y Williams, et al. (2007) administraron una dosis mayor. Kim et al (2000) combinó praziquantel con cimetidina, mientras que nosotros combinamos con albendazol y mebendazol. En cuanto a la vacuna, ésta si bajó significativamente las cargas parasitarias. Se encontraron abundancias estadísticamente significativas entre el grupo vacunado y los grupos control II y sin tratamiento. Con los datos obtenidos del tratamiento de Freund, se puede concluir que no ayudó en la vacuna a los peces para su inmunidad, ya que no hubo una reducción en su carga parasitaria en comparación con los otros tratamientos, sin embargo los resultados son similares a los obtenidos en la revisión de peces que no presentaban tratamiento, lo que refuerza que la vacuna funcionó. A pesar de que en este trabajo no se evaluaron parámetros inmunológicos, sería interesante hacerlo considerando que Sandoval-Gío et al. (2007) demostraron que la inyección intraperitoneal de tilapias con Cichlidogyrus spp., induce la producción de anticuerpos y probablemente estos efectores inmunológicos podrían estar involucrados en la reducción de la carga parasitaria que observamos. De manera similar, aunque la vacunación de trucha arcoíris con Discocotyle sagittata no produjo inmunidad estéril, Rubio-Godoy et al. (2003) observaron una asociación negativa entre los títulos de anticuerpos específicos contra el gusano y las cargas parasitarias. Con respecto al efecto producido por la carga parasitaria de C. sclerosus en la tilapia, se determinó una correlación negativa significativa entre la carga parasitaria y el hematocrito. No obstante, la correlación entre la carga parasitaria y la condición corporal K no fue 28
significativa, al contrario de los trabajos de Rubio Godoy & Tinsley (2008) y Aragort et al. (2002). En cuanto a la selección del microhábitat, C. sclerosus tuvo una mayor preferencia por el arco I, seguido del IV. En los resultados obtenidos por Geets et al. (1997), el monogéneo Tetrancistrum sigani presentó una distribución similar por el arco I y IV de S. sutor. Hafidi et al. (1998) obtuvieron que los monogéneos Metamicrocotyla cephalus y Microcotyle mugilis tienen una mayor preferencia por el arco I. 29
IX. CONCLUSION Este trabajo indica que ninguno de los tratamientos antihelmínticos evaluados (pirantel, mebendazol, PZQ, albendazol con mebendazol, PZQ con albendazol, PZQ con albendazol y mebendazol) funcionó para reducir significativamente las cargas de C. sclerosus, a pesar de que se les administraron a las tilapias dosis superiores a las recomendadas por otros autores. Es importante citar que los compuestos antihelmínticos evaluados produjeron mortalidad significativa de peces. También se concluye que la vacunación experimental con gusanos enteros administrados con FCA induce una reducción significativa de la carga parasitaria. En contraste, la administración de, FCA solo no redujo significativamente los niveles de infección. Se determinó que la infección con C. sclerosus induce daño en el hospedero, pues se encontró una correlación negativa significativa entre la carga parasitaria y el hematocrito. No hubo una correlación significativa entre la carga parasitaria y la condición corporal. El parásito C. sclerosus mostró una preferencia por el arco branquial I. 30
X. BIBLIOGRAFÍA Aragort W., et al. 2002. Patologías asociadas a Monogéneos Branquiales en Cachama bajo cultivo. Veterinaria Trop. 27 (2). 75-85. Aguirre-Fey D. 2009. Parásitos branquiales de cuatro grupos genéticos de tilapias, cultivados en la zona centro-norte del estado de Veracruz. Tesis de Maestría en Ciencias, Instituto de Ecología. A.C. Bittencourt R. N.L., et al. 2003. Haematological and biochemical values for Nile tilapia Oreochromis niloticus cultured in semi-intensive system. Maringá. 25 (2). 385-389. Bowden T, Bricknell I, Ellis A. E. 2003a. Fish Vaccination, an overview. Industry report IntraFish.;40. 5-20. Buchmann K. 1998. Biding and lethal effect of complement from Oncorhynchus mykiss on Gyrodactylus derjavini (Platyhelminthes: Monogenea). Dis Aquat Organ. 32(3). 195-200. Buchmann K. & Bresciani J. 2006. Monogenea (Phylum Platyhelminthes) In: fish diseases and disorders, Vol. 1: Protozoan and Metazoan infection. Edited by P.T.K. Woo CAB International, UK. 800p. Bush A. O. et al. 1997. Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al. revisited. J. Parasitol. 83 (4). 575-583. Chaves I. S., et al. 2006. Immune adaptive response induced by Bicotylophora trachinoti (Monogenea: Diclidophoridae) infestation in pampano Trachinotus marginatus (Perciformes: Carangidae). Fish & Shellfish Immunology. 21. 242-250. CONAPESCA. 2008. Anuario estadístico de acuacultura y pesca. Domínguez Guadarrama Marco A. 2009. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (en línea). UNAM. Disponible en http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/centros/ceiegt/ceiegt.html#. Consultado el 21 de octubre de 2010. Evans J. J., Klesius P. H., Shoemaker C. A. 2004. Efficacy of Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus) by intraperitoneal and bath immersion administration. Vaccine. 22. 3769-3773. Fitzsimmons K. 2000. Tilapia aquaculture in Mexico. The World Aquaculture Society. 2. 171-183. Flores-Crespo J. & Flores-Crespo R. 2003. Monogéneos, parásitos de peces en México: estudio recapitulativo. Técnica Pecuaria en México. 41. 175-192. Geets A. et al. 1997. Ectoparasites of the whitespotted rabbitfish, Siganus sutor (Valenciennes, 1835) off the Kenyan Coast: distribution within the host population and site selection on the gills. Parasitology. 115. 69-79. Gudding R., Lillehaug A., Evensen Ø. 1999. Recent developments in fish vaccinology. Vet Immunol Immunopathol. 72. 203-212. Gutiérrez P. A. & Martorelli S. R. 1999. Hemibranch preference by freshwater monogeneans a fuction of gill area, wáter current, or both?. Foli Parasitol. 46. 263-266. 31
Hafidi, et al. 1998. Microhabitat distribution and coexistence of Microtylidae (Monogenea) on the gills of the striped mullet Mugil cephalus: chance or competition?. Parasitology Research. 84. 315-320. Herrera Cubilla A. & Amalia. 1986. The host-parasite relation: Study of the incidence of various biologicals characters on the parasitism. Scientia (Panamá). 1(1). 31-36. Iannacone J., et al., 2003. Comunidades ectoparásitas branquiales de la pintadilla Cheilodactylus variegatus Valenciennes 1833 (Pisces: Cheilodactylidae). Parasitologica Latinoamericana. 58. 59-67. Jeannette T., et al. 2010. Spatial distribution of Monogenean and Myxosporidian gill parasites of Barbus Martorelli Roman, 1971 (Teleostei: Cyprinid): The role of intrinsic factors. African Journal of Agricultural Research. 5(13). 1662-1669. Jiménez-García MI., et al., 2001. Monogeneans in introduced and native cichlids in Mexico: evidence for transfer. Journal of Parasitology. 87. 907-909. Jiménez Guzmán F., et al. 1988. Parásitos y enfermedades de la tilapia. Fondepesca y Publicación técnica No. 3. Universidad Autónoma de Nuevo León, N. L., México. 109p. Kim K. H. & Choi E. S. 1998. Treatment of Microcotyle sebastis (Monogenea) on the gills of cultured rockfish (Sebastes schelegeli) with oral administration of mebendazole and bithionol. Aquaculture.167. 115-121. Kim K. H, et al. 2000. Immunization of cultured rockfish Sebastes schlegeli against Microcotyle sebastis (Monogenea). Dis. Aquat. Org. 40. 29-32. Kim K. H, et al. 2001. Treatment of Microcotyle sebastis infestation in cultured rockfish Sebasties schlegeli by oral administration of praziquantel in combination with cimetidine. Dis. Aquat Org. 44. 133-136. Klesius P., Shoemaker A., Evans J. 2000. Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture. 188. 237-246. Lemly A. D., Esch G. W. 1984. Effects of the trematode Uvulifer ambloplitis on juvenile bluegill sunfish, Lepomis macrochirus: ecological implications. J. Parasitol. 70(4). 475-492. Lindenstrom T., Buchmann K. 2000. Acquired resistance in rainbow trout against Gyrodactylus derjavini. J Helminthol. 74(2). 155-160. Meeusen E.N.T., Piedrafita D. 2003. Exploiting natural immunity to helminth parasites for the development of veterinary vaccines. International Journal for Parasitology. 33. 1285 1290. Midtlyng P. J. 1996. A field study on intraperitoneal vaccination of Atlantic salmon (Salmo salar L.) against furunculosis. Fish Shellfish Immunol. 6(8). 553-565. Nandlal S. & Pickering T. 2004. Tilapia fish farming in Pacific island countries. Volume 1. Tilapia hatchery operation. Noumea, New Caledonia: Secretariat of the Pacific community. 33p. 32
Ohhashi Y., et al. 2007. Involvement of host recognition by oncomiracidia and post-larval survivability in the host specificity of Heterobothrium okamotoi (Monogenea: Diclidophoridae). International Journal for Parasitology. 37. 53-60. Paling J. E. 1968. A method of estimating the relative volumes of water flowing over the different gills of a freshwater fish. Journal of Experimental Biology. 48. 533-544. Penagos L., Figueroa J., Iregui C. 2005. Estudios preliminares para la elaboración de una vacuna, evaluación de su eficacia y diseño de un plan de vacunación contra la estreptococcosis. Proyecto Proceal Ltda. -Federación Nacional de Cafeteros-Universidad Nacional de Colombia. Pérez-Ponce de León G & Choudhury A. 2005. Biogeography of helminth parasites of freswater in Mexico: the search for patterns and processes. Journal of Biogeography. 32. 645-659. Petracini Roberto. 2001. La respiración de los peces (en línea). Disponible en http://www.elacuarista.com/secciones/biologia4.htm. Consultada el 8 de octubre de 2010. Poulin R., George- Nascimento M. 2007. The scaling of total parasite biomass with host body mass. International Journal for Parasitology. 37. 359-364. Pullin, R.S.V., et al. 1997. Environmental impacts of Tilapias. In Fitzsimmons, K. ed. Tilapia Aquaculture: Proceedings of the Fourth International symposium on Tilapia in Aquaculture. Northeast Regional Agricultural Engineering Service. Ithaca, NY, USA. 554-570. Raymond K. M. N., Chapman L. L., Lanciani C. A. 2006. Host, macrohabitat, and microhabitat specificity in the gill parasite Afrodiplozoon polycotyleus (Monogenea). The Journal Parasitology. 92 (6). 1211-1217. Rubio-Godoy M. & Tinsley R. C. 2002. Trickle and single infection with Discocotyle sagittata (Monogenea: Polyopisthocotylea): effect of exposure mode on parasite abundance and development. Folia Parasitol. 49. 269-278. Rubio-Godoy M., et al. 2003. Immunization of rainbow trout Oncorhynchus mykiss against Discocotyle sagittata (Monogenea). Dis Aquat Org. 55. 23-30. Rubio-Godoy, M. & Tinsley R.C. 2004. Immunity in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, against the monogenean Discocotyle sagittata following primary infection. Parasitology Research, Vol. 92, p. 367-374. Rubio-Godoy M. & Tinsley R. C. 2008. Recruitment and effects od Discocotyle sagittata (Monogenea) infection on farmed trout. Aquaculture. 274. 15-23. Sandoval Gío J. J., Rodríguez Canul R., Vidal Martínez V. M. 2007. Humoral Antibody Response of the Tilapia Oreochromis niloticus Against Cichlidogyrus spp. (Monogenea). Journal of Parasitology. 94 (2). 404-409. Sommerset, et al., 2005. Vaccines for fish in aquaculture. Expert Review of Vaccine. 4(1). 89-101. 33
Soylu E., et al., 2010. Seasonal dynamics and spatial distribution of Dactylogyrus crucifer Wagener, 1857 on the gills of roach (Rutilus rutilus L.) from Lake Spanca, Turkey. Turk journal of Zoology. 34. 393-398. Stickney R. R. 1993. Tilapia. In Stickney RR (Ed) Culture of non-salmonid freshwater fishes. CRC Press. Boca Raton. Florida. 81-115p. Swain P., Nayak S. K., Sahu A., Mohapatra B. C., Meher P. K. 2002. Bath immunisation of spawn, fry and fingerlings of Indian major carps using a particulate bacterial antigen. Fish Shellfish Immunol. 13. 133-140. Turgut E., Shinn A., Wootten R. 2006. Spatial distribution of Dactylogyrus (Monogenea) on the gills of the host fish. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 6. 93-98. Vladimirov V. L. 1971. The immunity of fishes in the case of dactylogyrosis (in Russian). Parasitologiya. 5. 51-58. English translation: Parasitology (Riverdale). 1. 58-68. Williams R. E., et al. 2007. Efficacy of orally administered Praziquantel against Zeuxapta seriolae and Benedenia seriolae (Monogenea) in yellowtail kingfish Seriola lalandi. Diseases of aquatic organisms. 77. 199-205. Yasuzaki M., Ogawa K., Yoshinaga T. 2004. Early Development of the Monogenean Heterobothrium okamotoi on the gills of Tiger Puffer Takifugu rubripes. Fish Pathology. 39 (3). 153-158. 34