Testosterone Saliva ELISA

Instrucciones de Uso Testosterone Saliva ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de testosterona libre en saliva humana. RE52631 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de testosterona libre en saliva humana. La medición de testosterona (una hormona masculina) es usada en el diagnóstico y tratamiento de desordenes relacionados con hormonas masculinas (andrógenos), incluyendo hipogonadismo primario y secundario, impotencia en hombres, hirsutismo (exceso de vello) en mujeres y virilización (masculinización) debido a tumores, ovarios policísticos y sindromes adrenogenitales. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La testosterona, un esteroide C19, es la hormona natural más efectiva de la familia de los andrógenos. En los hombres, se produce principalmente en las células de Leydig de los testículos, y sólo una pequeña cantidad se produce en la corteza suprarrenal. Por lo general, los hombres adultos tienen concentraciones de testosterona en plasma entre 10 y 20 veces más altas que las mujeres. En la circulación, la mayor parte de la testosterona está unida a proteínas de plasma como la globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG) y la albúmina. Sólo el 1% 2% de la testosterona no está unida y, por lo tanto, es biológicamente activa. La testosterona libre se libera a través de las glándulas salivales. En las células de estas glándulas, una gran parte de la hormona se transforma en 5q-dihidrotestosterona. Sin embargo, la concentración de testosterona en saliva indica el nivel de testosterona libre en plasma. Los niveles de testosterona en las mujeres deben medirse en pacientes que presenten síntomas clínicos de virilismo causado por el síndrome genitosuprarrenal, la poliquistosis ovárica o neoplasias de la corteza suprarrenal o de los ovarios. Debido a las variaciones, se recomienda realizar varias mediciones. Puede seguirse un tratamiento con medicamentos supresores de andrógenos mediante controles. En los hombres con indicios de hipogonadismo primario o secundario, pueden determinarse los niveles de confirmación de testosterona. La testosterona, junto con los niveles de cortisol, es un parámetro útil en la investigación del estrés y de la medicina deportiva. Debido a la cantidad de factores que pueden afectar los niveles de testosterona, en algunas situaciones es recomendable realizar una curva de los niveles. Por lo tanto, la medición de la testosterona libre en saliva es un método adecuado, debido a la posibilidad de obtención de muestras de manera más sencilla sin necesidad de realizar venopunciones reiteradas. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio de la competencia. Una cantidad desconocida de antígeno presente en la muestra y una cantidad fija de antígeno marcado enzimáticamente compiten por los sitios de unión de los anticuerpos que recubren los pozos. Tras la reacción del sustrato los pozos se lavan para detener la reacción de competencia. Después de la reacción del sustrato la intensidad del color desarrollado es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. Version 2016-08 1 / 6

9. Algunos reactivos contienen ProClin 300 como conservante. En caso de que se produzca el contacto con los ojos o la piel, lavar de inmediato con agua. Al desechar los reactivos, enjuagar todo con gran cantidad de agua para evitar acumulaciones. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de Parafilm. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge por 10 min a 2000 3000 x g para remover el material particulado. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien. (Color rojizo que indique contaminación sanguínea) Almacenamien to: 37 C 18-25 C 2-8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad: 1 semana > 2 semanas > 4 semanas 6 meses 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 13 ml ENZCONJ 1 x 6 x 1.0 ml CAL A-F 1 x 2 x 1.0 ml CONTROL 1+2 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Placa de Microtitulación Tiras separables. Recubierto con anticuerpo de ratón anti-testosterona (monoclonal). Conjugado Enzimático Listo para usar. Contenido: Testosterona conjugado con HRP, estabilizadores. Estándar A-F 0; 10; 30; 100; 300; 900 pg/ml Listo para usar. Contenido: Testosterona, Solución buffer, ProClin 300. Control 1+2 Listo para usar. Contenido: Testosterona, alto y bajo, Solución buffer, ProClin 300. Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas. Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween, NaCl. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores Solución de Parada TMB Listo para usar. 1 M H2SO4 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 50; 100; 1000 µl 1. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado. 2. Vortex 3. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 4. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 5. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia 600-650 nm) 6. Agua bidestilada o desionizada 7. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro Version 2016-08 2 / 6

9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Algunos componentes contienen 250 µl de solución. Asegúrese de que toda la solución esté en el fondo del vial antes de abrirlo. 5. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 6. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 7. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 8. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 9. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones). 10.1. Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas 20 ml WASHBUF CONC agregu e 200 ml agua bidest. 1:10 Mezcle vigorosamente. El viraje a un color amarillo amarronado no influye en los resultados del ensayo. Almacenam iento 2-8 C Estabilidad 4 semanas 10.2. Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con Diluente de Muestra (disponible en IBL REF KLZZ731). La dilución debe llevarse a cabo en tubos de vidrio. Para obtener los resultados correctos multiplique las mediciones obtenidas por el factor de dilución. Version 2016-08 3 / 6

11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 50 µl de cada Estándar, Control y muestra dentro de los respectivos pocillos en la placa de microtitulación. 2. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. Mezclar bien para 10 segundos. 3. Incube 2 h a TA (18-25 C). 4. Descargue la solución de incubación. Lavar a placa 3 x com 250 μl de Tampão de Lavagem diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 5. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 6. Incube 30 min a TA (18-25 C). 7. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Parada TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 8. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) durante 15 min después de pipetear la Solución de Parada. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, Aplique cada señal de los estándares (los duplicados con un valor obviamente fuera de límites debe omitirse y emplearse el valor único más plausible). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. En las muestras de saliva con valores marcadamente elevados deben revisarse la posibilidad de contaminación sanguínea. Conversión: Testosterona (pg/ml) x 3.47 = pmol/l Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar Testosterona (pg/ml) DOMedio DO/DOmax (%) A 0 2.068 100.0 B 10 1.809 87.5 C 30 1.605 77.6 D 100 1.204 58.2 E 300 0.683 33.0 F 900 0.299 14.5 Version 2016-08 4 / 6

14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: Testosterona (pg/ml) Tipo de Edad prueba (años) Intervalo Intervalo Mediana N Mediana (5-95%) (5-95%) N 20 29 19.0 5.5 49.0 40 78.8 41.4 142.5 55 30 39 17.3 5.2 49.0 39 58.8 31.8 100.4 35 Saliva 40 49 13.8 4.5 49.0 47 54.4 30.1 97.8 48 50 59 13.2 3.6 49.0 53 54.8 30.0 92.0 64 60 69 15.8 2.9 38.8 33 42.9 23.2 86.9 63 Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES. Los siguientes substancias no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas: Saliva Conc. Testosterona (pg/ml) Sangre 0.1% 32.6 70.8 Timerosal 0.1% 18.2 257.3 NaN 3 0.03% 0 231.4 Version 2016-08 5 / 6

16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) Substancia Reactividad Cruzada (%) Testosterona 100 11 -OH-Testosterona 3.09 11 -OH-Testosterona 2.53 Dihidrotestosterona 1.39 Androstediona 0.76 Metil- Testosterona 0.91 DHEA-S 0.03 Testosterona Sulfato 0.04 Progesterona 0.03 2.1 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2SD Sensibilidad Funcional 8.6 pg/ml Conc.Media < 20% CV Reactividad cruzada de otras substancias testeadas 0.01% Precisión Medio (pg/ml) DS (pg/ml) CV (%) N 12.8 1.56 12.2 20 Intra-Ensayo 63.2 2.46 3.9 20 196.5 6.64 3.4 20 363.8 10.05 2.8 20 14.7 2.44 16.6 10 Inter-Ensayo 58.0 4.57 7.9 10 172.9 11.0 6.4 10 328.1 12.80 3.9 10 Linearidad Intervalo (pg/ml) Dilución en Serie hasta Intervalo (%) 17.1 810.6 1:16 84-99 Recuperación Intervalo (pg/ml) Concentración añadida Recuperación después del enriquecimiento 14.8 614.3 28-450 96-114 Comparación de Métodos Saliva IBL-ELISA = 0.902 x LCMS + 4.08 r = 0.989; n = 90 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Lewis, J.G.: Steroid Analysis in Saliva: An overview. Clin Biochem Rev 2006, Volume 27:139-146 2. Martin A., Saathoff M., Kuhn F. et al.: A Functional ABCC11 Allele Is Essential in the Biochemical Formation of Human Axillary Odor, Journal of Investigative Dermatology 2010, Volume 130:529 540 3. Schulz K., Korz V.: Hippocampal testosterone relates to reference memory performance and synaptic plasticity in male rats, Frontiers in Behavioral Neuroscience, 2010, Volume 4:Article 187 Version 2016-08 6 / 6

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Symbols Version 4.5 / 2015-12-07