Progesterone Luminescence Immunoassay

Transcripción

1 Instrucciones de Uso Progesterone Luminescence Immunoassay Inmunoensayo de luminiscencia de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de progesterona en saliva humana. RE62021 RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo de luminiscencia de diagnóstico in-vitro para la determinación cuantitativa de progesterona activa libre, una hormona femenina, en saliva humana. Las mediciones obtenidas a través de este método pueden ser usadas en el diagnótico y tratamiento de disordenes en los ovarios y como ayuda para la confirmación de la ovulaxión. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS Progesterona, un esteroide C21, es una hormona sexual femenina y precursora en el metabolismo de otros esteroides. La progesterona se sintetiza principalmente en el cuerpo lúteo de los ovarios, durante la etapa más importante del embarazo, en la placenta, y en muy pequeñas cantidades para la producción de otros esteroides en la corteza suprarrenal y en los testículos. Y, por último, la progesterona es importante para la síntesis de aldoesterona, cortisol, testosterona y 17-β-estradiol. En la circulación, la principal parte de la progesterona se une a la globulina fijadora de corticoides (CBG, transcortina), a la globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG) y a la albúmina. 1 a 2 % de la progesterona circula como hormona libre en plasma. Sólo esta porción representa la parte activa en la regulación endocrina. Iguales cantidades de hormona libre se liberan en la saliva. Se presume una metabolización enzimática de porciones de esta hormona en las glándulas salivales. La progesterona es una hormona importante para la regulación endocrina del ciclo mestrual. Después de la ovulación, el cuerpo lúteo segrega progesterona que se desarrolla del folículo ovulatorio en los ovarios. Aumenta el nivel de progesterona entre el 6 to y el 8 vo día después de la ovulación a una meseta. Junto con el estradiol, inhibe la liberación de hormona luteinizante (LH) y hormona folículo-estimulante (FSH) en la hipófisis mediante un mecanismo de autoregulación negativo. La progesterona es segregada en la circulación de manera pulsátil. Debido a la lisis del cuerpo lúteo, disminuye el nivel de progesterona en los últimos 3 días del ciclo a un nivel preovulatorio. En el embarazo, al comienzo de la 8 va semana de gestación, la placenta se convierte en la fuente principal de producción de progesterona durante el 2 do y el 3 er trimestre. La evolución de los niveles de progesterona en la circulación se refleja en su concentración en saliva. La función más importante de la progesterona es preparar a los órganos genitales femeninos para una potencial implantación y poder mantener el embarazo. Los efectos principales de la progesterona consisten en iniciar la fase de secreción del endometrio, suprimir las contracciones del útero y estimular el crecimiento del tejido mamario, así como también otros efectos sobre el metabolismo y el sistema endocrino en las mujeres. Con respecto a la fisiología, la medición de progesterona en saliva es útil para monitorear el ciclo menstrual en las mujeres, a fin de determinar el momento en que se produce la ovulación y evaluar la función del cuerpo lúteo, que es muy importante en las etapas iniciales del embarazo. Como las fluctuaciones en los niveles de progesterona dependen también de situaciones individuales, es conveniente confeccionar un perfil hormonal mediante la toma repetitiva de muestras de saliva. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo de luminiscencia está basado en el principio de competencia. Una cantidad desconocida de antígeno y una cantidad fija de antígeno marcado enzimáticamente compiten por los sitios de unión de los anticuerpos que recubren los pocillos. Luego de la incubación y para detener la reacción de competencia los pocillos son lavados. Después de adicionar la solución del sustrato de luminiscencia, la intensidad de luminiscencia medida es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Los resultados se pueden determinar directamente usando una curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. V2013_02 1 / 6

3 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de Parafilm. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge por 10 min a x g para remover el material particulado. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien. (Color rojizo que indique contaminación sanguínea) Almacenamiento: 37 C C 2-8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad: 1 semana > 2 semanas > 4 semanas 6 meses 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad RE62021 Cantidad RE62029 Símbolo 1 x 12x8 10 x 12x8 MTP 1 x 0.15 ml 1 x 1.5 ml ENZCONJ CONC 1 x 9 ml 1 x 90 ml ANTISERUM 1 x 10 ml 1 x 100 ml ASSAYBUF 7 x 1.0 ml 7 x 3.5 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml 2 x 3.5 ml CONTROL x 9 ml 1 x 90 ml LUMINREAG AP 1 x 100 ml 5 x 100 ml WASHBUF CONC Componente Placa de Microtitulación revestido con anticuerpos de conejo anti-ratón Conjugado Enzimático Concentrado (101x) Contenido: fosfatasa conjugada alcalina, 0.1 % NaN 3. Progesterona Antisuero Coloreado en rojo. Listo para usar. Contenido: anti-progesterona anticuerpos (ratón). Buffer de Ensayo Coloreado en rojo. Listo para usar. Contenido: Solución Buffer Tris, BSA, 0.1 % NaN 3. Estándar A-G 0; 10; 25; 50; 100; 300; 1000 pg/ml Listo para usar. Contenido: Progesterona, Solución buffer, BSA, 0.1 % NaN 3. Control 1+2 Listo para usar. Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas. Reactivo de Quimioluminiscencia AP Listo para usar. Contenido: sustrato basado en acridan. Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) Contenido: Solución Buffer Tris, Tween, NaN 3. V2013_02 2 / 6

4 Cantidad RE62021 Cantidad RE62029 Símbolo Componente 3 x 12 x FOIL Folio Adhesivo 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 50; 1000 µl 2. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado (puede ser ordenado en IBL bajo el número de referencia REF RE69991) 3. Agitador orbital ( rpm) 4. Vortex 5. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 6. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 7. Fotómetro para inmunoensayo de luminisciencia (ej. Berthold luminómetro de placas de microtitración) 8. Agua bidestilada o desionizada 9. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Algunos componentes contienen 250 µl de solución. Asegúrese de que toda la solución esté en el fondo del vial antes de abrirlo. 5. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 6. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 7. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 8. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 9. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. V2013_02 3 / 6

5 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del juego de reactivos para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos independientes. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones) Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 10 ml WASHBUF CONC 20 µl ENZCONJ CONC agregue 100 ml con 2 ml agua bidest. 1:10 ASSAYBUF 1:101 Mezcle vigorosamente. Mezcle sin formar espuma. 2-8 C 4 semanas Prepare fresco y use sólo una vez Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con el Diluyente de Muestras (disponible en IBL bajo la referencia REF KLZZ731). La dilución debe llevarse a cabo en tubos de vidrio. Los resultados obtenidos deben ser multiplicados por el factor de dilución correspondiente para obtener los resultados correctos. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 20 µl de cada Estándar, Control y muestra dentro de los respectivos pocillos en la placa de microtitulación. 2. Pipetee 50 µl de Conjugado Enzimático preparada al momento en cada pocillo. 3. Pipetee 50 µl de Antisuero Progesterona en cada pocillo. Cubra la placa con un folio adhesivo. 4. Incube 4 h a TA (18-25 C) sobre un agitador orbital ( rpm). 5. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x con 250 µl de Solución Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 6. Pipetee 50 µl de Agente de Quimioluminiscencia AP en cada pocillo en los mismos intervalos de tiempo que necesitará el luminometro para medir posteriormente (Luminometro Berthold tarda, por ejemplo, 2 segundo por pocillo). 7. Mida las unidades de luminiscencia relativa con un luminometro después de los 10 minutos. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS El RLU de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logisitcs or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, utilice todos los valores obtenidos de los estándares (los valores que se encuentran fuera de rango en forma obvia pueden ser omitidos). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. V2013_02 4 / 6

6 En las muestras de saliva con valores marcadamente elevados deben revisarse la posibilidad de contaminación sanguínea. Conversión: Progesterona x 3.17 = pmol/l Rango de Medición: Saliva: pg/ml Progesterona Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar Progesterona Medio RLU RLU / RLU max A B C D E F G RLU Progesterone pg/ml 14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: Premenopausico (n = 27 perfiles mensuales) Progesterona Fase folicular Fase luteal pg/ml pg/ml Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. Postmenopausico (n = 6) pg/ml n = 49 < 51 pg/ml Para establecer un rango de valores normales en saliva, se realizó un studio en mujeres pre-menopausicas. Se recolectaron 3 muestras diarias de saliva (mañana, mediodia y tarde). Para obtener un valor promedio diario de progesterona durante el ciclo menstrual, las 3 muestras diarias fueron mezcladas y la concentración de progesterone fue determinada. Se observaron 4 profiles atípicos. Ciclo menstrual de 27 mujeres (edades años) sin anticonceptivos Saliva de Progesterona Bleeding Día del ciclo menstrual 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES. Contaminaciones con sangre en saliva mayores al 25 % pueden afectar los resultados, éstas son fácilmente visibles. Concentraciones de NaN 3 > 1.0 % y de timerosal > 0.25 % interfieren en el ensayo y conducen a resultados erróneos. V2013_02 5 / 6

7 16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Sustancia Reactividad Cruzada 17α-OH-Progesterona α-Metil-17α-OH-Progesterona 1.41 Pregnenolona 0.41 desoxi-corticosterona 0.28 Androsterona Sulfato 0.25 Androstenediona 0.20 Androsterona 0.20 DHEA-S 0.11 Corticosterona 0.06 Reactividad cruzada de otras substancias testeadas 0.1 % Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) 2.6 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2DS Sensibilidad Funcional 8.0 pg/ml Conc.Media < 20 % CV Medio DS CV Medio DS CV Precisión Intra-Ensayo (10x) Inter-Ensayo (10x) Dilución Medido Recuperación Dilución Medido : : : : : : : : Linearidad 1: : : : : : : : : : : Recuperación Comparación del Método versus RIA Agregado Recuperación 1: Medido Recuperación Medido Recuperación Ensayo IBL = 0.89 x RIA pg/ml RIA Intervalo = pg/ml r 2 = 0.94; n = 97 LUM Intervalo = pg/ml 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Lewis, J.G Steroid Analysis in Saliva: An overview. Clin Biochem Rev Vol Wood, P Salivary steroid assays research or routine? Ann Clin Biochem 46: V2013_02 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /