MEMORIA FINAL DEL PROYECTO : ESTUDIO DE LOS GENES SUPRESORES TUMORALES LKB1 Y BRG1 EN TUMORES DE MAMA DE ORIGEN ESPORADICO Y FAMILIAR. Montse Sanchez-Cespedes, Genes and Cancer Group, Cancer Epigenetics and Biology Program (PEBC), Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL). 08907, Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain El proyecto financiado por la Fundación Sandra Ibarra ha dado lugar a los siguientes resultados: 1.- Determinación de la presencia de mutaciones en BRG1, en línea germinal de pacientes con cáncer de mama familiar negativas para BRCA1 y BRCA2 Se ha determinado la presencia de mutaciones en BRG1 en sangre periférica de 15 pacientes con historial de cáncer de mama familiar, negativos para mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2. El material de análisis procedía de colaboraciones con el Dr Javier Benítez (del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas) y el Dr. Ignacio Blanco (del Institut Catala d'oncologia). Para ello se procedió a la secuenciación automática y directa del DNA: 33 exones codificantes (zonas codificantes y regiones intrónicas adyacentes) Resultados: No se identificó ninguna mutación germinal Se identificaron diversos SNPs (del inglés single nucleotide polymorphisms) Se identificaron variantes intrónicas de significado biológico desconocido que muy probablemente no estén asociadas a la enfermedad. Se adjunta una tabla con los resultados (Tabla 1). En la figura 1 se muestra uno de los polimorfismos identificados. Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 1
Tabla 1: Descripción de las variantes obtenidas en el análisis de mutaciones en BRG1 en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama familiar y negativas para mutaciones en BRCA1 y BRCA2. Figura 1: Cromatograma mostrando una de las variantes identificadas en una de las pacientes con cáncer de mama familiar. Este cambio constituye un polimorfismo sin relevancia funcional Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 2
2.- Evaluación de la frecuencia de inactivación bi-alelica en los genes supresores tumorales BRG1 y LKB1 en tumores de mama de origen esporádico. Se ha seleccionado un panel de 10 líneas celulares de cáncer de mama. Dada que la presencia de mutaciones en BRG1 y LKB1 origina ausencia de proteína en un 90% de los casos (Rodriguez- Nieto S, Sanchez Cespedes M. Carcinogenesis 2009) se procedió en primer lugar en realizar western-blot de los mencionados supresores tumorales en el panel de líneas celulares de cáncer de mama seleccionadas (BT-549, UACC3199, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-436, MDA- MB-453, SK-BR-3, Hs578T, ALAB, MCF7) (ver ejemplo en Figura 2). Además, y en paralelo, se realizó secuenciación automática de cada uno de los exones codificantes de las líneas celulares. Figura 2: Western-blot que muestra la presencia de proteína BRG1 en las líneas celulares de cáncer de mama indicadas. Como control de carga se utilizó GAPDH, tal y como se indica en la figura. Los resultados derivados del proceso de screening permitieron identificar mutaciones inactivadoras en dos de las líneas estudiadas. Las líneas Hs578T y ALAB. La línea Hs578 presentaba un cambio de nucleótido en el exón 4 tal y como se indica en la figura 2. Este cambio de aminoácido se presenta en una región altamente conservada. Por su parte la línea ALAB presentaba un cambio a un stop prematuro (exón 10) que originaba una proteína truncada (Fig.3). Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 3
Figura 3. Representación esquemática de los exones del gen BRG1 en la que se muestra la localización de las mutaciones en las líneas celulares de cáncer de mama Hs578T y ALAB No se identificaron mutaciones en el gen LKB1 en las líneas celulares estudiadas. 3.- Estudio funcional de las mutaciones en BRG1 Además del proyecto relacionado con la Fundación Sandra Ibarra, otro proyecto que llevamos a cabo en el laboratorio es el estudio funcional y significado biológico de la pérdida del gen BRG1 en el cáncer de pulmón. En relación a este estudio hemos llevado a cabo observaciones muy interesantes entre las cuales cabe destacar que la inactivacion de BRG1 en el cáncer de pulmón conlleva una pérdida de respuesta a la señalización por ácido retinoico. El ácido retinoico es una de las principales formas activas de la vitamina A y se considera una hormona esteroide ya que se une a receptores intracelulares específicos que posteriormente se unen al DNA y afectan a la síntesis de proteínas implicadas en la regulación del crecimiento y la diferenciación celular. El acido retinoico es fisiológicamente muy relevante, especialmente durante el desarrollo embrionario. En el organismo adulto juega también un papel muy importante en varios procesos fisiológicos relacionado con la diferenciación e inflamación, entre otros procesos. Teniendo en cuenta estas observaciones de nuestro grupo en cáncer de pulmón, y dentro del contexto del proyecto financiada por la Fundación Sandra Ibarra, nos propusimos comprobar si las mutaciones en BRG1 en cáncer de mama también conllevan una pérdida de respuesta al ácido retinoico. Para ellos seleccionamos la línea Hs578T y la transfectamos por una lado con un vector que contenía BRG1 salvaje y otro que tenía una mutación (E668-Q758 del.) (Medina et al. 2008). Posteriormente, tratamos a la línea con ATRA (acido trans-retinoico) a 0.1 y 0.5 micromolar. Con el objeto de evaluar la respuesta a ATRA se eligió un marcador CYP26A1, que es un enzima que metaboliza dicho compuesto y que está establecido como una diana muy general y especifica del tratamiento con ATRA. Es decir el Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 4
Relative levels of CYP26A1 tratamiento con acido retinoico aumenta los niveles del CYP26A1 (Rochette-Egly C et al. 2000). Los resultados mostraron claramente que las células sin BRG1 o transfectadas con la forma mutante de BRG1 eran refractarias al tratamiento con ATRA (es decir no aumentaban los niveles del CYP26A1) mientras que al restaurar la expresión de BRG1 salvaje las células recuperaban su capacidad de incrementar los niveles del CYP26A1, y por lo tanto, de responder al ácido retinoico (Fig.4). Hs578T Figura 4. Q-RT-PCR que muestra los niveles del marcador CYP26A1 en respuesta al tratamiento con ATRA en la línea de cáncer de mama Hs578T después de reintroducir la forma BRG1 wild type (wt) y mutante (Mut). Se observa que la forma wt, pero no la mutante es capaz de incrementar los niveles del CYP26A1 y, por lo tanto, recupera la capacidad de responder a ácido retinoico. 0 0.1 0.5 ATRA (micromolar) Los resultados de este trabajo constituyen una parte de un trabajo que estamos preparando para enviar a publicar (Romero et al.. In preparation) y en el que se agradece la contribución de la Fundación Sandra Ibarra. 4.- Estudiar el posible papel de BRG1, así como de otros miembros de la familia SWI/SNF (BRM principalmente), en la predisposición a cáncer de mama familiar. Teniendo en cuenta la presencia de mutaciones inactivadoras en el gen supresor BRG1, así como su relevancia funcional, otro de los objetivos que nos planteamos en el presente trabajo fue buscar otros genes de la familia SWI/SNF que pudieran estar genéticamente inactivados en cáncer de mama. En primer lugar seleccionamos los genes de interés mediante una búsqueda exhaustiva de deleciones homocigóticas en regiones que contuvieran miembros clave de la familia SWI/SNF. Para ellos buscamos en bases de datos públicas (Sanger, principalmente) y analizamos los datos procedentes de microarrays de SNPs en líneas celulares de cáncer de Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 5
mama. De este análisis varios genes se mostraban candidatos a estar alterados en cáncer de mama, de entre ellos seleccionamos el gen BRD7, ya que detectamos en la base de datos una delecion homocigótica en una línea celular de cáncer de mama (CAMA1). Para este análisis realizamos secuenciación automática de todos los exones codificantes (son 17) en el siguiente panel de células: BT-474, BT-549, COLO-824, HCC-1143, HCC-1937, UACC-812,Hs-578T HBL-100, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-453, UACC- 3199, SKBR-3, T47D,ZR-75-2. Se han detectado diversos polimorfismos, que posiblemente no tengan ninguna importancia funcional en el desarrollo del cáncer de mama, ya que o bien son intronicos, alejados de las zonas consenso para splicing o bien no cambian el aminoácido. Tan solo hemos identificado un cambio que de lugar a una sustitución (M548I). El cambio es heterocigoto, por lo que es improbable que constituya una mutación. Así pues, nuestros datos indican que el gen BRD7 es improbable que este genéticamente alterado en el cáncer de mama, al menos con una frecuencia elevada. Conclusiones En el presente trabajo hemos demostrado que las alteraciones en BRG1 no parecen contribuir de forma significativa al cáncer de mama familiar, aunque si que son relevante en el desarrollo del cáncer de mama de origen esporádico, ya que alrededor de un 20% de estos tumores presentan inactivación genética de BRG1. Además, hemos demostrado que la inactivación de BRG1 en el cáncer de mama, afecta a la respuesta de las células al tratamiento con ácido retinoico, volviendo a las células refractarias a la actividad de dicho compuesto. Asimismo, nuestros resultados muestran que la restitución de BRG1 en líneas deficientes revierte la resistencia a dicho tratamiento. Por otra parte, las mutaciones en otro gen supresor importante, LKB1, no son frecuentes en el cáncer de mama. En definitiva, BRG1 juega un papel importante en el desarrollo de cáncer de mama de origen esporádico, por lo que resulta de vital importancia caracterizar en profundidad el perfil mutacional y funcional de BRG1 en el cáncer de mama así como identificar otros miembros del complejo SWI/SNF que puedan contribuir al este tipo de cáncer. Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 6
Referencias -Medina PP, Romero OA, Kohno T, Montuenga LM, Pio R, Yokota J, Sanchez-Cespedes M. (2008). Frequent BRG1/SMARCA4-inactivating mutations in human lung cancer cell lines. Hum. Mut. 29, 617-622. -Rochette-Egly C, Plassat JL, Taneja R, Chambon P. (2000). The AF-1 and AF-2 activating domains of retinoic acid receptor-alpha (RARalpha) and their phosphorylation are differentially involved in parietal endodermal differentiation of F9 cells and retinoid-induced expression of target genes. Mol. Endocrinol. 14, 1398-1410. -Rodriguez-Nieto S, Sanchez-Cespedes M. (2009). LKB1 and BRG1, tales of two tumor suppressors on chromosome 19p. Carcinogenesis. -Romero OA et al. Gene inactivation of the tumor suppressor BRG1 in cancer prevents cell differentiation by disrupting MYC activity and nuclear receptor signalling. Manuscript in preparation. NOTA: EN ESTE MANUSCRITO SE AGRADECE LA FINANCIACION PROPORCIONADA POR LA FUNDACION SANDRA IBARRA. Barcelona 21 de Diciembre, 2010 Montse Sanchez-Cespedes, PhD Genes and Cancer Group Leader Programa Epigenetica i Biologia del Cancer-PEBC Hospital Duran i Reynals Av. Gran Via del'hospitalet, 199-203 08907-Hospitalet de Llobregat-Barcelona, Spain email: mscespedes@iconcologia.net Phone number: +34.93.260.71.32. Fax number: +34.93.260.72.19 Estudio de BRG1 y LKB1 en cáncer de mama 7