PRÁCTICAS DE GENÓMICA E INGENIERÍA GENÉTICA BLOQUE I 1
PRÁCTICAS DE GENÓMICA E INGENIERÍA GENÉTICA BLOQUE I Recuerda venir a las prácticas con: ü Identificación (DNI/pasaporte) para presentarlo en caso de ser requerido a la hora de pasar lista. ü Bata de laboratorio. ü Rotulador que pinte en plástico para marcar los tubos. ü Libreta y bolígrafo. ü Calculadora / Cámara de fotos (o en su defecto Smartphone), el uso del móvil en las prácticas para otras opciones a la descrita está prohibido y será sancionado. ü Buena predisposición para aprender. Ten en cuenta que: ü Las prácticas son importantes para aprobar la asignatura. ü La asistencia a las prácticas son obligatorias. ü El examen puede contener cuestiones referente a estas prácticas. ü Existen 3 bloques de prácticas (cada una de dos sesiones). 2
I. DETECCIÓN DE VARIANTES POLIMÓRFICAS. MEDIANTE PCR MARCO TEÓRICO Los genomas presentan regiones altamente variables entre los individuos de una especie, llamadas secuencias polimórficas o polimorfismos. Estos cambios pueden deberse a variaciones en el contenido de la secuencia de nucleótidos o pueden deberse a inserciones, o deleciones. En el caso de polimorfismos que generan un cambio significativo en número de nucleótidos se puede usar directamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectarlos. Para polimorfismos que produzcan un cambio en la secuencia de nucleótidos (pero no en su número) puede usarse una técnica que combina PCR y enzimas de restricción llamada (PCR-RFLP) que hemos estudiado en clase. En nuestro genoma existe una secuencia polimórfica llamada Alu TPA-25. Esta secuencia polimórfica se encuentra en el cromosoma 8 y se sitúa en el intrón del gen que codifica el activador tisular del plasminógeno (TPA). Se conocen dos formas de esta secuencia, y una de ellas presenta una inserción de una secuencia de 300 pb llamada Alu. Las regiones Alu forman parte de las regiones repetitivas del genoma, se derivan de elementos móviles llamados retrotransposones y son responsables de muchas de las regiones polimórficas del genoma humano. En esta práctica amplificaremos esta región polimórfica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos (también llamados oligonucleótidos o primers) que flanquean la secuencia. En caso de presentar la secuencia Alu insertada, se obtendrá por PCR un fragmento de 400 pb. Si no se tiene dicha secuencia el tamaño del producto amplificado será de 100 pb. De esta forma, si el individuo es heterozigótico para este carácter, mostrará los dos fragmentos, de 100 y 400 pb y si es homocigo sólo uno de los mismos. Cebador aguas arriba "5-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3" Cebador aguas abajo "5-CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT-3. 3
PROBLEMA 1: Se ha cometido un crimen en el cual tú eres el principal sospechoso. La policía, ha obtenido un pelo del agresor en la escena del crimen. Pruebas preliminares han determinado la información sobre un marcador polimórfico Alu-TPA-25, siendo el criminal homocigoto para la inserción de la secuencia Alu. Tal y como estás en un laboratorio de biología molecular: sabrías exculparte del delito? PROTOCOLO EXPERIMENTAL Sesión 1 I. AISLAMIENTO DEL DNA DE LAS CÉLULAS EPITELIALES DE LA CAVIDAD BUCAL DE LOS CARRILLOS (30 MINUTOS) 1. Poner 10 ml de solución salina (NaCL 0,9%) en tubos 30 ml (aproximadamente 1/3 del tubo), introducirse en la boca todo el volumen y enjuagarse vigorosamente (raspar los carrillos con la lengua con el fin de que se arrastre células descamadas) con ella durante 30 seg. 2. Expulsar la solución procedente del lavado bucal en el vaso y verterlo con cuidado en un tubo de 30 ml. Agitar la solución y tomar 1 ml de esta y pasarla a un tubo eppendorf de 1.5 ml que será rotulado con nuestro nombre. 3. Centrifugar la solución en una microcentrífuga a 10.000 rpm durante 2 minutos. 4. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no despegar el sedimento celular blanquecino visible en el fondo del tubo. 5. Añadir, 200 µl de la solución de Chelex 10% homogenizada al sedimento celular. Agítala bien antes de coger la solución de Chelex porque las bolitas caerán al fondo rápidamente, usa la punta azul (la más gruesa, porque con la amarilla la punta se obturará). Resuspender el pelet celular con la micropipeta. Asegurarse, mirando a la luz, que no quedan acúmulos de células. 6. Calentar la muestra en un termobloque a 95-100º C, durante 10 minutos. 7. Enfriar los tubos en hielo durante 1 minuto. Centrifugar 30 segundos en una microcentrífuga, con objeto de sedimentar la resina de Chelex, y proteínas. 8. Transferir 100 µl del sobrenadante teniendo cuidado de no tomar nada del sedimento (que contiene Chelex y proteínas) a un tubo limpio marcado con un nombre que lo identifique. 4
REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN DEL DNA (PCR). 1. Se nos dará un tubo de PCR de 0.2ml con un volumen de 12 µl que la Mezcla Maestra (master mix) RedTaq que contiene todo el material necesario para la reacción con la excepción de nuestro ADN (Taq Polimerasa, Buffer, dntps, primers, además de tampón de carga y colorantes aniónicos). Tomaremos 8µl de muestra de solución de ADN y lo añadiremos al tubo para completar los 20µl. No te olvides de marcar el tubo para identificarlo. 2. Tapar bien el tubo e introducirlo en el termociclador automático. Asegúrate que el termociclador seguirá el programa correcto para realizar la reacción en cadena de la polimerasa. Añadir un muestra de control positivo (ADN proveniente del individuo problema) y negativo a la reacción global. Ciclos Proceso y temperatura tiempo 1 Desnaturalización 94 ºC 2 min Desnaturalización 94 ºC 30 seg 40 Hibridación 55 ºC 30 seg Elongación 72 ºC 30 seg 1 Elongación 72 ºC 10 min 5
Sesión 2 PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA AL 2% Preparar el gel de agarosa de forma similar a la descrita anteriormente pero a un porcentaje del 2% en TAE (2gr de agarosa por cada 100ml de TAE). Debido a que la manipulación de los genes de agarosa tiene cierto riesgo esta parte será realizada por el profesor o bajo supervisión directa del mismo. Se utilizarán 2 gr de agarosa por cada 100 ml de tampón TAE. Se necesitan 50 ml de gel por cada cubeta pequeña de electroforesis del sistema de Biorad. Una vez pesada la agarosa, se añade junto con el tampón TAE a una botella termo-resistente. Se enrosca la botella de forma que no quede completamente cerrada (importante!). Se calienta en el microondas a máxima potencia hasta que se disuelva la agarosa y la solución se vuelva totalmente transparente, parando cada 20 segundos para agitar el contenido. Δ! Utilizar un protector para coger la botella, quemará!. Al agitar la botella para disolver la agarosa, la presión hace que la solución pueda salir de la botella de forma brusca y existe peligro de quemarse (a nosotros o a nuestros compañeros). Al agitar apuntar con la botella hacia el fregadero. Verter 50ml de gel en un matraz termorresistente dentro de la campana de extracción de vapores y esperar unos minutos hasta que dejen de salir vapores del mismo. A continuación se añade 1µl de BrEt (concentración final 0,5 µg/ml) y se agita con cuidado. Posteriormente se vierte en una bandeja de electroforesis (pequeña Biorad), se incorpora a la misma un peine adecuado y se deja gelificar (20 minutos aproximadamente). Δ! Usa guantes para la manipulación del BrEt, y de los productos que entren en contacto directo con él. Recuerda que el BrEt es potencialmente cancerígeno. 1. Centrifugar 30 segundos a máxima velocidad cada uno de los tubos de 1.5ml donde habíamos incubado la digestión. Añadir 4µl de tampón de carga de electroforesis (x6). 2. Añadir con la micropipeta 5µl de marcador de peso molecular con la micropipeta en la pista 1 del gel. 3. Añadir con la micropipeta todo el producto de la PCR a la pista 2, el siguiente a la pista 3 y así sucesivamente (no olvidar anotar el orden de carga de muestras, se puede usar la plantilla de al final del documento). 4. Orientar los polos de la cubeta de electroforesis negativo arriba, y positivo abajo. Encender la fuente de alimentación con un voltaje de 100V y empezar la carrera. Observa que cuando se inicia la corriente saldrán burbujas del polo negativo de la cubeta. El ADN se desplazará del polo negativo al positivo. Dejar correr la electroforesis hasta que la banda del azul de bromofenol haya migrado los 2/3 del tamaño del gel. 5. Visualizar en un transiluminador de luz ultravioleta y fotografiar el gel. Δ! Cuidado con la irradiación UV, es tóxica. 6
II. MAPAS DE RESTRICCIÓN MARCO TEÓRICO Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de reconocer secuencias específicas de ADN y cortarlas. Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan como parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas). Existen tres tipos de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción de tipo II cortan en una posición específica del ADN dentro de su secuencia de reconocimiento, denominada sitio de restricción, en él la enzima rompe un enlace fosfodiéster en una de las hebras de ADN y otro enlace fosfodiéster en la hebra complementaria. Las secuencias reconocidas son en su gran mayoría palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones) y tienen un tamaño de entre 4-12 pb en ADNs. Los cortes generarán extremos romos (si cada una de las dos hebras del ADN se cortan en al mismo nivel) o protuberantes (cuando las dos hebras de ADN no se cortan en el mismo nivel). La existencia de extremos romos o protuberantes tiene importancia en ingeniería genética a la hora de unir diferentes fragmentos de ADN como estudiaremos en clase. Sin embargo no tiene una importancia relevante a la hora de confeccionar mapas de restricción, ya que mediante electroforesis no se pueden diferenciar entre ambos cortes. 7
Nomenclatura: Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ejemplo: Eco RI E = género Escherichia co = especie R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa Aplicaciones de las enzimas de restricción a la identificación de secuencias de ADN: Mapa de restricción La especificidad de corte de los enzimas de restricción tiene diversos usos para la identificación de secuencias de ADN. La representación de una molécula de ADN donde se indiquen los sitios de restricción de diferentes enzimas se denomina mapa de restricción y puede servir para identificar secuencias de ADN una vez resueltas durante la electroforesis en geles de agarosa. PROBLEMA 1: Un paciente se ha infectado de una bacteria patógena que presenta una toxina codificada por un plásmido. Se necesita saber que tipo de toxina presenta la bacteria para administrarle al paciente la antitoxina (antitoxina A, B o C). Para tal fin se han aislado los plásmidos de la bacteria. Cómo podrías saber de que toxina se trata si solo dispones de los siguientes mapas de restricción (próxima página)? 8
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PROTOCOLO EXPERIMENTAL Sesión 2. Tomar 500 ng de plásmido extraído de la bacteria aislada del paciente (dado por el profesor a cada grupo, no se te olvide apuntar el nombre que identifica al paciente!) y llevarlo a un volumen final de 17 µl con agua estéril. Añadir 2 µl de Fast Digest Green Buffer (x10), agitar mediante vórtex y añadir 1 µl de enzima FastDisgest (1U/µl). Cada grupo de alumnos seleccionará una sóla enzima de restricción de las disponibles (que puede ser Eco RI, Pvu II, HindIII) para digerir el plásmido. Esta digestión se trata de una nueva formulación de digestión enzimática rápida (10 minutos frente a 60 minutos) que se combina con tampón de carga, la que encuentre más apropiada para discriminar entre las diferentes toxinas. Incubar a 37ºC durante 10 minutos a 37ºC (en estufa o termobloque). Preparar un gel de agarosa al 0,8% en tampón de electroforesis (TAE) de forma similar a la indicada anteriormente en la página 7, aunque utilizando 0.8 gr de agarosa por cada 100 ml de tampón TAE. Una vez gelificado, cargar las muestras en el gel y realizar la electroforesis. 10
APÉNDICE: MARCADORES DE PESO MOLECULAR En la electroforesis de ADN en geles de agarosa se utilizan marcadores de peso molecular que constan de un patrón de fragmentos de ADN de tamaño conocido, que sirven como referencia para determinar el tamaño de muestras problema durante la electroforesis. Existen muchos marcadores de peso molecular, algunos de diferente rango, nosotros durante estas prácticas utilizaremos uno de los siguientes: D7058 (Sigma) D9793 (Sigma) D9780 (Sigma) X174(NEB) VIII (Roche) 11
REACTIVOS UTILIZADOS EN PRÁCTICAS ü Agarosa (Sigma A5093). ü Bromuro de Etidio (sol. 1 mg/ml) ü Agua destilada ü Patrón de tamaño de ácidos nucleicos. ü Tampón de electroforesis: Tris/Acetato/EDTA (TAE). 40mM Tris, 20mM acetic acid, and 1mM EDTA. ü ADN Plásmídico extraído de la bacteria patógena: (PRL, PSI, NEO, pcdna4neoluc, B-pRL-TK, C-psicheck2-MCS-UTR-BRG1long) ü Enzimas de restricción. ü Tampón de reacción para enzimas de restricción. ü Agua destilada estéril ü Bromuro de Etidio (sol. 1 mg/ml). ü Tampón de carga (6x): 0,25 % de azul de bromofenol y glicerol. ü Solución Salina estéril NaCl 0,9 %. ü Chelex (Chelating Ion Exchange Resin) 10 % en Tris, ajustar ph=11. Resina aniónica que capta iones divalentes. ü PCR Master Mix x2 (RedTaq Catalog Number R2523): Contiene Taq Polimerasa, Buffer x2, dntps, loading buffer. ü Cebadores con una concentración de 10uM. MATERIALES ü Microondas. ü Cubeta de hielo. ü Botella 500ml termoresistente. ü Guantes. ü Micropipetas de 100-1000, 10-100 y 0,5-10 µl. ü Puntas de micropipetas estériles. ü Tubos de 30 ml (tapón rosca blanco). ü Tubos de microcentrífuga 1,5 ml estériles (para la digestión). ü Tubos de 0,2 ml para PCR ü Centrífuga tubos 1.5ml. ü Sistema de Electroforesis (cubetas, fuente de alimentación y pines). ü Botella y matraz termoresitente. ü Campana de extracción de gases. ü Termobloque de tubos 1.5ml a 95ºC. ü Termociclador ü Estufa a 37ºC. 12
PLANTILLA CARGA DE GELES DE AGAROSA PARA ELECTROFORESIS 13