Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa Licenciatura en Biología Experimental Centro Médico Nacional Siglo XXI IMSS
Análisis de la expresión del complejo Sarcoglicano- Sarsocpan y de proteínas asociadas en pacientes que sufren Distrofia Muscular Dr. José Luis Gómez Olivares Dr. Fabio Salamanca Gómez Dr. Ramón M. Coral Vázquez (Tutor Principal) Alumna: K. Angélica Hernández Varela
Distrofias Musculares Son un grupo diverso de enfermedades, caracterizadas por debilidad y atrofia muscular progresiva. El defecto primario se hace evidente en el músculo esquelético, donde ocurren procesos de degeneración de fibras, núcleos centrales, necrosis muscular y reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposo.
A:Tipo Duchenne y Becker B: Emery- Dreifuss C: Cintura D: Facioescapulohumeral E: Distal F: Oculofaringea
Complejo de Proteínas Asociadas a distrofina
Criterios de clasificación Músculos involucrados Edad de inicio Progresión de la enfermedad Modelo de herencia Proteína(s) anómala(s) o deficiente(s)
Objetivo General Analizar la expresión génica y proteica del complejo distrofina-glicoproteínas en biopsias de pacientes diagnosticados con distrofia muscular
Objetivos Particulares a) Clasificar a un grupo de pacientes con distrofia muscular. b) Creación de un banco de muestras DNA y biopsias musculares. c) Análisis inmunohistoquímicos de biopsias musculares. d) Identificación de las mutaciones alguno(s) gene(s) que codifica(n) para proteínas ausentes o anómalas.
Estrategia Experimental
Diagnóstico clínico de distrofia muscular Biopsias de músculo esquelético Inmunodetección por flourescencia Detección de proteína de interés No detección de proteína de interés Preservación de la biopsia Análisis de DNA
Criterios de inclusión Exploración física por el médico-genetista: Fuerza Sensibilidad Historia clínica (antecedentes familiares) Examen de laboratorio Creatinina-fosfato cinasa (CPK 200-400 U/I) Electromiografía Electrocardiograma Biopsia Tinción de Hematoxilina y Eosina Fibras hipertróficas Núcleos centrales Reemplazo de tejido muscular por conjuntivo y adiposo
Inmunoflourescencia indirecta Biopsias Microscopio de Epi-fluorescencia Congelación Anticuerposprimarios conjugados con fluorocromos Portaobjetos C M 1 M 2 M 3 Criostato 7-10 µm Distrofina, α-, β-, γ-, y δ-sarcoglicanos, Laminina, Lamina A/C, Teletonina, Emerina
Resultados de inmunofluorescencia
92 pacientes estudiados Distribución según tipo de distrofia: 10 Pacientes con ausencia de distrofina 12 Pacientes con disminución de distrofina 4 Pacientes con disminución de Sarcoglicanos 56 Pacientes con presencia de todas las proteínas estudiadas 7 Pacientes sin fibras musculares. 2 Pacientes con ausencia de disferlina
Deficiencia en distrofina
Reducción en la expresión en distrofina
Positivo para todas las proteínas
Disminución en expresión de sarcoglicanos
Reducción en la expresión γ-sarcoglicano
Deficiencia en Laminina
Número de fibras musculares reducidas
Análisis de fenotipo y relación familiar
Pedigree familiar P-57 Músculos afectados distales Escápulas aladas Fatiga Camina de puntas Hiperlordosis I II Consanguinidad 25 22 20 Disferlina Dys-3 Dys-2 C P C P C P
Pedigree familiar P-77 I II CPK de 4600 22 años Debilidad Muscular H.E. Reemplazo de músculo por tejido conectivo y adiposo Edad de inicio 14 años Camina con fatiga Disferlina Dys-3 Dys-2 C P C P C P
Pedigree familiar P-24 Masculino 31 años CPK 3961 Se han aplicado otras proteínas, Lamina, Emerina,Teletonina + Progreso Lenta 6 años-31 años DX Cinturas, DMB I II III IV V VI
Pedigree familiar P-85 Femenino 3 años CPK 979 Caídas Hiperlordosis Gowers Electromiografía Normal Autosómica Dominante Probar Lamina A/C, caveolina I II III IV
Análisis de DNA Sangre DNA Amplificación por PCR Secuenciación del gen LAMA2 y comparación con base de datos Purificación Electroforesis
Conclusiones El análisis de inmunofluorescencia en las biopsias de 92 pacientes que sufrían con distrofia muscular mostró había una asociación entre la deficiencia y/o disminución en algunas proteínas del complejo de glucoproteínas asociadas a distrofina. El estudio permitió constituir un banco de biopsias musculares de un grupo de pacientes con éste tipo de sindromes. En una paciente se identificó una mutación en el gen que codifica para la proteína merosina (Lamma2) que permitió identificar a los portadores dentro de la familia. Se identificó deficiencia de γ sg para un paciente y de Disferlina para dos pacientes, siendo candidatos para análisis de DNA.
Perspectivas En algunos pacientes que resultaron positivos en las proteínas analizadas, se realizará análisis de inmunotransferencia de gel a membrana o inmunofluorescencia para otras proteínas. En los pacientes que resultaron con deficiencia o reducción en la expresión de distrofina se les podrá realizar análisis de deleciones.