Informe final de proyecto

Informe final de proyecto Determinación de perfiles genotípicos de resistencia en sementales mejorantes, tomando la paratuberculosis como modelo, para incrementar la ventaja competitiva de la industria ganadera local Centro: NEIKER Participantes: Joseba Garrido (jgarrido@neiker.net) Iker Sevilla, Marivi Guijo, Ramon Juste. Entidades participantes: ABEREKIN UPV/EHU Año 2006 1

Determinación de perfiles genotípicos de resistencia en sementales mejorantes, tomando la paratuberculosis como modelo, para incrementar la ventaja competitiva de la industria ganadera local 1.- Introducción La enfermedad de Johne o paratuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa que constituye una fuente de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera. Una vía para reducir el impacto de esta infección es aumentar la resistencia del animal a la misma. Para ello, resulta imprescindible la identificación de los genes causantes o reguladores de la paratuberculosis y determinar el papel que las variantes nucleotídicas de estos genes juegan en la predisposición del individuo a desarrollar la infección. La susceptibilidad/resistencia a infecciones está determinada por un número múltiple de genes que trabajan en conjunto y que interaccionan con el medio ambiente. En este sentido, los últimos estudios realizados en relación a la mayor o menor susceptibilidad/resistencia a la infección por Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), bien en humanos, modelos murinos o ganado, ponen en evidencia la implicación de genes que participan en la defensa innata contra patógenos intracelulares. Entre ellos encontramos los siguientes: Nramp1, Nod2/Card15, TLR2, TLR4, Ipr1,...La identificación de estos genes de resistencia permitiría realizar una selección genética basada en el genotipo resistente de los animales y con ello la difusión de la resistencia a toda la población. De este modo las explotaciones ganaderas verían incrementado el valor comercial de sus animales. A este respecto, en estudios previos realizados en nuestro laboratorio hemos encontrado una asociación genética significativa entre el microsatélite HORIN, localizado en el gen Nramp1 bovino, en concreto la variante o alelo 211 del microsatélite, y la resistencia a la paratuberculosis bovina. Existen trabajos previos en diversas especies de mamíferos que implican al gen Nramp1 en la resistencia a diferentes micobacterias, lo cual sostiene nuestra hipótesis. De todos modos, en estos momentos nuestro objetivo es profundizar en el tema para confirmar la asociación que hemos observado. Para ello, por un lado estamos ampliando la muestra a fin de obtener una réplica independiente del estudio de asociación previamente realizado, y por otro, estamos buscando nuevos polimorfismos SNPs en el gen Nramp1 para identificar la mutación o variante causal de la resistencia a la infección por MAP. 2.- Objetivo Identificar marcadores de resistencia a infecciones intracelulares en el ganado bovino para su aplicación en la determinación de los perfiles genotípicos de resistencia a paratuberculosis en sementales del programa de mejora genética de la CAPV. 3.- Fenotipado de los animales 3.1. Toma de muestras de sangre y heces: De cada animal se tomó una muestra de heces con guante de exploración y un tubo de 2

10 ml de sangre entera con EDTA. Una parte de la muestra de sangre recogida a cada animal se empleó para la obtención de plasma y la otra se envió congelada a -20ºC al Dpto de Genética de la UPV para la realización de los análisis genéticos. 3.2 Clasificación de los animales respecto a la paratuberculosis: La condición de los animales respecto a la paratuberculosis se estableció en función de la respuesta inmune humoral detectada mediante el kit de ELISA Pourquier ELISA de cribado, así como de la presencia o ausencia de micobacterias en heces en función de los resultados observados mediante PCR con el kit Adiavet Paratub, tras la extracción del ADN con el kit QIAamp DNA Blood minikit de Qiagen. Tanto la intermitencia de la excreción de micobacterias con las heces de los animales subclínicos como la variabilidad en la intensidad de la respuesta inmune desde el momento de la infección hasta las fases finales de la enfermedad hace aconsejable, si no imprescindible la combinación de técnicas de diagnóstico para la correcta clasificación de los animales 3.3.- Resultados El lote estaba formado por muestras de sangre y heces de 229 animales pertenecientes al plantel de Aberekin S.A. y que presentaron los siguientes resultados: PCR de heces ELISA de sangre Positivo Negativo Sin muestra Total Positivo 0 9 0 9 Negativo 0 220 0 220 Sin Muestra 0 0 0 0 Total 0 229 0 229 3.4.- Resultados análisis clínico-epidemiológico Ninguno de los animales investigados presentaba síntomas clínicos de la enfermedad 4.- Análisis Genéticos 4.1.- Materiales y métodos a) Sementales de Aberekin: Con fecha 19 de Junio de 2006, fueron remitidas desde Neiker un total de 228 muestras sanguíneas pertenecientes a sementales de Aberekin al laboratorio de Genética. Las 228 muestras se agrupan de la siguiente manera: 202 muestras del centro de Derio: 161 de ellas pertenecientes a individuos de raza bovina frisona. 26 muestras del centro de Torrelavega: 12 de ellas pertenecientes a individuos de raza bovina frisona. b) Población de referencia: Con el fin de comparar la población de sementales de raza frisona de Aberekin hemos creado una población representativa de raza frisona constituida por 33 individuos de 3

esta misma raza y procedentes de múltiples explotaciones, abarcando así toda la geografía de la Comunidad Autónoma Vasca Genotipado: A las 228 muestras recibidas de Aberekin se les practicó el protocolo habitual de alicuotado y almacenado. El ADN de todas las muestras analizadas fue extraido mediante el kit de extracción QIAamp 96 DNA Blood Kit, de Quiagen. Para la amplificación de los diversos loci microsatélite que han sido analizados, su posterior detección mediante electroforesis capilar, y las respectivas asignaciones alélicas para cada muestra se hizo uso de los equipos Gene Amp 9700, ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer y ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer, y de los shoftware Genotyper y GeneMapper (Applied Biosystems). Análisis estadísticos: Para los cálculos de frecuencias génicas y genotípicas y para realizar el test de equilibrio de Hardy-Weinberg se utilizó el programa estadístico Genepop 3.3. En lo que respecta a diversidad intrapoblacional, los valores de heterocigosidad esperada y observada (He y Ho) se calcularon mediante el programa Cervus 2.0. El estadístico FIS se obtuvo con el programa Fstat. 4.2.- Resultados Genotipos obtenidos para HORIN Los 228 sementales de Aberekin fueron genotipados para el microsatélite HORIN, objeto de nuestro estudio. Los genotipos obtenidos para cada animal, y su clasificación en base al número de alelos resistentes que portan se muestran en el Anexo 1. De igual manera, las 33 muestras de referencia pertenecientes a la población frisona también fueron genotipadas para este microsatelite. Una vez genotipados todos los animales se procedió a realizar un análisis estadístico del conjunto de muestras en cada población (poblacion de sementales de Aberekin y poblacion de raza frisona) con el objeto de ver cómo se combinan las diversas variantes del microsatélite en los individuos que las componen (frecuencias genotípicas) y calcular las proporciones de cada variante en la población(frecuencias génicas). En lo que respecta a la muestra de sementales de Aberekin, a excepción de la raza frisona en la que contábamos con un número elevado de animales, para el resto de razas el número de individuos era muy escaso, por lo que no se procedió al análisis poblacional de estas últimas. La razón de ello reside en que realizar una estima de las frecuencias génicas de la población en una muestra pequeña supondría un error estadístico demasiado elevado. Siendo así, sólo se trabajó con los genotipos obtenidos para los sementales de raza frisona, por lo que todos los resultados obtenidos y mostrados a continuación relativos a Aberekin se referiran únicamente a un total de 173 sementales de raza frisona. 4

RAZA N Frisona 173 Blanco Azul Belga 13 Limousin 12 Blonde Aquitania 8 Charolais 8 Pardo Alpina 4 Pirenaica 6 Jersey 3 Piamontesa 1 Caracterización genética de las poblaciones: Tabla 1: número de individuos por raza. En la Tabla 2 se reflejan las frecuencias de los genotipos obtenidos y en la Tabla 3 se indican las frecuencias génicas obtenidas a partir de los mismos genotipos por contaje directo. GENOTIPO 211/211 211/213 213/213 211/215 213/215 215/215 211/217 213/217 215/217 217/217 N ABEREKIN(abe) 0.063 0.06 0.85 0 0.005 0.011 0 0.011 0 0 173 FRECUENCIA FRISONA(fri) 0 0.2 0.8 0 0.03 0 0 0 0 0 33 Tabla 2: Frecuencias genotípicas del microsatélite HORIN en la poblacion de sementales de Aberekin y en la población frisona. ALELO 211 213 215 217 N ABEREKIN(abe) 0.092 0.887 0.014 0.006 346 FRECUENCIA FRISONA(fri) 0.091 0.894 0.015 0 66 Tabla 3: Frecuencias génicas del microsatélite HORIN en la poblacion de sementales de Aberekin y en la población frisona. Tal y como se aprecia en la Tabla 3, el alelo predominante del microsatélite HORIN en ambas poblaciones es el 213 (p>0.88), seguido por el alelo 211 (q<0.1). Los alelos 215 y 217 son raros tanto en una población como en otra. Comparando las frecuencias génicas y genotípicas de la población de sementales de Aberekin con las de la población frisona vemos que las dos poblaciones son muy semejantes. Análisis intrapoblacional A partir de las frecuencias génicas estimadas (Tabla 3) se calcularon valores referentes a la diversidad intrapoblacional para los dos grupos de animales (Tabla 4). Los valores obtenidos respecto a heterocigosidad esperada (He~0.2) nos indican que el microsatélite HORIN, en cuanto a variabilidad genética, a pesar de tener más de 2 alelos se comporta como un locus dialélico. Esto es debido a que en ambas muestras son dos los alelos 5

mayoritarios, el 211 y el 213, mientras que el 215 y 217 se consideran alelos raros debido a su baja frecuencia (p<0.05). K N H e H o SEMENTALES ABEREKIN 4 173 0.205 0.075 POBLACION FRISONA 3 33 0.195 0.212 Tabla 4: Valores referentes a diversidad intrapoblacional. K= número de alelos, N= número de individuos, He= heterocigosidad esperada, Ho= heterocigosidad observada. Equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W) y análisis de la Homocigosidad (FIS) POBLACIO N ABEREKIN H-W (p-val ± S.E.) 0.0000±0.000 0 Sign. Fis Sign. SIGN. +0.63 3 <0.00007 FRISONA 1±0.0000 NO SIGN. -0.087 NO SIGN. Tabla 5: Equilibrio Hardy-Weinberg y estadístico Fis para el microsatelite HORIN En la Tabla 5 se muestran los resultados del test de equilibrio de Hardy-Weinberg para cada población. Estos valores reflejan diferencias significativas respecto al equilibrio en la muestra de sementales de Aberekin, es decir, no cumple las condiciones de equilibrio H-W con un valor de p=0.0000. Por el contrario, la población de frisona no se desvía del equilibrio de H-W (p=1). El estadístico FIS, cuantifica el exceso o defecto de homocigotos observados en una población respecto a una población ideal en equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W). Tal y como se ve en la Tabla 4, la heterocigosidad observada en la población frisona (Ho=0.212) es algo mayor que la heterocigosidad esperada (He=0.195), aunque apenas difiere. Así, el valor de FIS obtenido para esta muestra es negativo pero no se aleja del cero (FIS=-0.087, p>0.05) (Tabla 5). Por el contrario, en el caso de los sementales de Aberekin la diferencia entre la heterocigosidad observada (Ho=0.075) y la esperada (He=0.205) es mayor, siendo la observada más baja que la esperada. Por ello, el valor de FIS para estos sementales fue positivo y muy alto, FIS=+0.633, desviándose del cero de forma significativa (p=0.00007). Estos datos reflejan que el motivo del desequilibrio de H-W observado en la muestra de sementales es debido a un exceso significativo de homocigotos en esta población. Este exceso de homocigotos observado en el microsatélite HORIN en la muestra de sementales de Aberekin, pero no en la población frisona, puede ser debido a varias causas. Una de ellas, obviamente, está relacionada con la selección artificial a la que está sometido cualquier semental, cuya consecuencia es un número de homocigotos superior al observado en la población general. Pero otra de las posibles causas para este exceso de homocigotos podría estar relacionada con la influencia que este marcador pudiera estar ejerciendo en la resistencia/susceptibilidad a la infección por MAP. En este sentido, el análisis del número de genotipos observados y esperados en equilibrio de H-W en la muestra de sementales (Tabla 6), nos indica que el exceso de homocigotos significativo en HORIN es atribuible, mayoritariamente, al genotipo 6

211/211. Se han hallado 11 individuos homocigotos para este alelo, cuando cabría esperar 1,4. GENOTIPO ABEREKIN 211/211 211/213 213/213 213/215 215/215 213/217 Otros N Observados 11 10 147 1 2 2 0 173 Esperados 1,4 28,5 136,2 4,4 0 1,8 0,7 173 Tabla 6: Número de genotipos observados y esperados en equilibrio H-W para el microsatélite HORIN en los sementales de Aberekin. Así las cosas, podríamos pensar que parte del exceso de homocigotos observado para el microsatélite HORIN en los sementales, podría atribuirse a una posible ventaja selectiva (resistencia) que la homocigosidad para el alelo 211 conferiría a estos animales frente a la infección por MAP y que sería superior a la de los sementales heterocigotos. En resumen, podría tratarse de un caso de selección a favor de los homocigotos 211 frente a la infección por MAP. Para contrastar esta hipótesis se procedió al análisis de un conjunto de 11 marcadores microsatélites, que conocemos que son selectivamente neutros, en 91 de los 173 sementales. Si el exceso de homocigotos hallado en HORIN se debiera a un caso de selección a favor de los homocigotos 211 de este locus, cabría esperar que el nivel de homocigosidad del resto de los microsatélites fuera menor al de HORIN y de un nivel similar entre ellos. Los resultados obtenidos en cuanto al equilibrio de Hardy-Weinberg y el estadístico FIS para los 11 microsatélites son los siguientes: LOCUS H-W (p-val ± S.E.) Fis (W&C) Sign. BM1824 0.1190 ± 0.0041 +0.067 0.06493-0.04687 BM2113 0.0003 ± 0.0002 +0.154 <0.00007 ETH10 0.5504 ± 0.0090 +0.029 0.25793-0.19907 ETH225 0.0508 ± 0.0029-0.002 0.55467-0.48567 ETH3 0.1636 ± 0.0073-0.057 0.93807-0.90980 INRA23 0.2705 ± 0.0104 +0.056 0.06953-0.04747 SPS115 0.0000 ± 0.0000 +0.294 <0.00007 TGLA122 0.0128 ± 0.0024 +0.062 0.02227-0.01320 TGLA126 0.2136 ± 0.0057 +0.062 0.10773-0.08080 TGLA227 0.1571 ± 0.0095 +0.053 0.05160-0.03307 TGLA53 0.0000 ± 0.0000 +0.289 <0.00007 ALL 0.095 ± 0.034 SIGN. Tabla 7: Equilibrio Hardy-Weinberg y estadístico Fis para el kit de 11 microsatelites neutrales en la muestra de sementales de Aberekin. El valor de FIS obtenido para el conjunto de los 11 marcadores es de +0.095, y su desviación respecto a lo esperado es significativa. El hecho de que para los microsatélites selectivamente neutros este valor sea positivo y significativo nos indica que el exceso de homocigotos no es algo exclusivo del microsatélite HORIN, sino que 7

parece ser un patrón generalizado en el genoma de estos animales, atribuible a la selección artificial a la que está sometido cualquier semental. De todas formas, si atendemos a los valores absolutos, el FIS encontrado para el microsatélite HORIN (0.633) es notablemente superior al valor medio que para este índice presentan los 11 microsatélites selectivamente neutros considerados en su conjunto (0.095). En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo no permiten descartar la hipótesis de que el exceso de homocigotos hallado para el microsatélite HORIN en los sementales de Aberekin sea atribuíble, además de a la selección artificial a la que está sometido cualquier semental, a una ventaja selectiva de los individuos homocigotos 211 HORIN frente a la infección por MAP. Sería deseable la realización de un estudio más amplio que permitiera confirmar esta última posibilidad. 8