Prácticas formativas (parte 1) MICROPROPAGACIÓN DE DIVERSAS ESPECIES VEGETALES Introducción Los tres procesos de micropropagación vegetal (proliferación de yemas axilares, organogénesis y embriogénesis asexual) tienen su origen en el rompimiento del programa determinativo organizacional de las células diferenciadas, las cuales se pueden llevar a un estado competente para que expresen secuencias génicas que originalmente no estaban en actividad o dejar de expresarlas. Es posible ocasionar que se puedan activar yemas latentes hasta entonces inhibidas por la dominancia apical, o que se generen nuevos meristemos donde antes no los había, así como la manifestación de algún tipo de embriogénesis asexual, como lo es la generación de embriones somáticos a partir de origen unicelular. El rompimiento de la dominancia apical repercute en la estimulación de las yemas laterales, ésta puede inducirse mediante la aplicación externa de reguladores de crecimiento del tipo citocininas en los medios de cultivo. Es una técnica que permite mantener la fidelidad genética de las plantas y es el método de propagación in vitro más aplicado y rentable. La organogénesis se refiere a la producción de órganos adventicios como brotes y raíces, que pueden ser inducidos sobre el tejido del explante original (organogénesis directa) o a partir de callo (organogénesis indirecta), en los que normalmente no se generan tales órganos. En general, para obtener plantas por esta vía se requiere la inducción de brotes, el desarrollo y multiplicación de los mismos, así como su enraizamiento y trasplante a tierra. Este proceso resulta muy atractivo, al obtenerse una propagación rápida con pequeñas secciones de tejido. En un callo dado solamente algunas células están implicadas en el proceso de iniciación, el cual es asíncrono y algo imprevisible. Los factores implicados en organogénesis no se conocen con claridad, porqué los estímulos pueden implicar los componentes del medio, los endógenos producidos por el cultivo y de las sustancias transportadas del explante original. Los embriones asexuales, como lo son los embriones somáticos, son individuos nuevos que proviene de una célula no cigótica, la cual presenta un eje con extremos definidos que le confiere una estructura bipolar. Esta polaridad está influenciada por varios factores, tales como la luz, gravedad e incluso las células adyacentes. Además los embriones somáticos no tienen conexión vascular con el tejido de origen (cuando se tiene organogénesis directa). Es precisamente por esta última característica que los embriones asexuales se pueden distinguir de los brotes y raíces producto de la organogénesis; también se pueden diferenciar de los brotes adventicios por presentar los polos definidos de crecimiento ya mencionados, uno hacia la raíz y otro hacia el brote aéreo. Objetivo Inducir los tres procesos de micropropagación en diversas especies de plantas mono y dicotiledóneas, principalmente mediante la aplicación de reguladores de crecimiento (auxinas y citocininas). Materiales y equipo Bisturí y pinzas de disección Cajas Petri de vidrio
Campana de flujo laminar Cintilla autoadherible Citocininas (BA, Kin u otras) Concentrados de HCl y NAOH (0.1 y 1.0 N) Concentrado congelado de medio nutritivo MS u otros Explantes con internodos de mono y/o dicotiledóneas Frascos para cultivo in vitro Marcador permanente Matraz Erlenmeyer de 10 a 1000 ml Vaso de precipitado de 100 a 1000 ml Estereocopio Procedimiento Elaborar medios de cultivo en frascos y cajas Petri desechables de acuerdo a lo determinado en clase, cada uno de ellos deberá contener una combinación diferente de dosis de auxinas y citocininas, ejemplo: 0, 1, 3, 5 y 10 mg/l de alguna citocinina, en interacción con 0.2, 0.4, 0.8 y 1.6 mg/l de una auxina. Cada equipo trabajará con una especie en particular, para ello elaborará un experimento factorial simple, de doble o triple interacción. Los explantes se colocarán con o sin yemas en cada frasco o caja Petri (tratar de homogenizar el origen del explante). Haga uso de cajas Petri de cristal, pinzas y bisturí para realizar el manejo y cortes de los explantes de acuerdo a lo indicado en clase (trabaje en forma de herradura). Rotular la procedencia del explante, fecha y datos extras que ayuden a seguir su desarrollo, así como los tratamientos, nombre del experimento y proceso de micropropagación que se busca. Durante seis semanas se deberá seguir el desarrollo de los explantes y se anotarán las diferencias observadas. Recuerde que cada tratamiento tendrá una inducción diferente. Compare los resultados de su experimento con los del resto de los compañeros y generen discusiones con retroalimentación y con base en literatura. Se reportará el número de brotes, raíces, callos, vigor, etcétera y concluya de manera concreta de acuerdo a su criterio, pero con base en la revisión de literatura y en la comparación realizada con los experimentos de otros compañeros.
Prácticas formativas (parte 2) TINCIÓN DE NÚCLEOS, CITOPLASMAS Y EMBRIONES SOMÁTICOS VEGETALES INTRODUCCIÓN Las diferentes estructuras celulares muchas veces no son visibles sin la adición de algún agente contrastante, por ello el uso de colorantes es indispensable para apoyar las observaciones al microscopio. Existen diversos pigmentos que son usados con este objetivo, algunos de ellos son novedosos y otros son de uso ancestral, como lo es la grana cochinilla del nopal, cuyo principio activo, ácido carmínico, se destina al teñido de textiles, alimentos fármacos y cosméticos. Su uso también abarca el área de las tinciones histológicas y de cariotipos. Recién se desarrollan otros usos para los cuales la coloración no es el interés, sino la estructura química del principio activo, el cual es una antraquinona que posee diversas funciones como antioxidante, antibacteriano, entre otras aplicaciones más que necesitan ser estudiadas. En la presente práctica se utiliza el ácido carmínico como agente de tinción del material genético de células vegetales y embriones somáticos en sus primeras etapas. Este pigmento es necesario utilizarlo en forma precipitada con un metal, que da como origen un carmín, mismo que al unirlo al ácido acético produce acetocarmín. La nueva polaridad de este compuesto permite que se una con los ácidos del núcleo presentes en cromosomas. Para determinar la presencia de callo embriogénico (mitosis asimétricas) en diversos experimentos de inducción de embriogénesis somática, a menudo es necesario llevar a cabo un proceso de tinción doble o diferencial, que permita hacer visible al microscopio las estructuras de interés. Los embriones somáticos pueden ser detectados con facilidad al microscopio si son teñidos diferencialmente, esto es posible gracias a que las células embriogénicas tienen altas concentraciones de proteínas y ácido ribonucleico, pero también a la presencia de células basales que poseen material principalmente básico. El proceso de tinción diferencial se logra mediante una tinción doble, con un colorante afín hacia sustancias ácidas y otro colorante con afinidad hacia materiales básicos, generalmente el azul de Evans. OBJETIVOS 1. Teñir cromosomas condensados visibles durante la mitosis proliferativa en algún meristemo 2. Teñir diferencialmente células con presencia de mitosis cuántica o asimétrica, durante el proceso de embriogénesis somática. METODOLOGÍA Equipo y materiales Meristemos de raíz u otro punto en crecimiento Cubre y portaobjetos Aceite de inmersión Gotero de 25 ml Trozos de papel filtro de 10 x 10 cm Bisturí y Pinzas Cajas Petri Centrifuga Agua estéril 1 ml de etanol 1 embudo pequeño Viales de 1.5 ml con tapa
Solución para arrestar mitosis Pipetas Pasteur Azul de Evans Agujas de disección Muestras de callo embriogénico Solución Carnoy Acetocarmín Mecheros y pipetas Microscopios Procedimiento para teñir cromosomas 1. Tome los meristemos y deposítelos en un vial que contenga solución para detener la mitosis (colchicina al 0.2% u otra solución) durante 2 h. 2. Pase las muestras a solución Carnoy (etanol y ácido acético en proporción 3:1) por 24 h. 3. Traslade las puntas meristemáticas a etanol al 70 % v/v para conservarlas en refrigeración hasta su preparación y observación al microscopio. 4. Para el teñido y observación de cromosomas, corte con el bisturí la punta de un meristemo y colóquela sobre un portaobjetos. 5. Deposite una o dos gotas de acetocarmín sobre la muestra en el portaobjetos y macere con ayuda de una aguja, posteriormente el macerado se tapa con un cubreobjetos. 6. Pase la muestra rápidamente sobre una flama y de inmediato toque su piel, si no molesta, repita la acción hasta que comience a molestar. Envuelva la muestra en papel secante y presiónela sobre una superficie plana para extraer el exceso de tinte. 7. Observe la muestra con objetivos de 10, 20, 40 y finalmente con el 100 (si fuera necesario), éste último con aceite de inmersión. Procedimiento para teñir embriones somáticos 1. Se toma una muestra diminuta del grupo de células a analizar (de preferencia células provenientes de callo en medios de inducción y/o expresión embriogénica), ésta se coloca en un vial. Agregar una o dos gotas de acetocarmín y dejar en baño María hasta observar un ligero vire (sucede regularmente luego de un par de minutos). 2. Lavar la muestra dos veces como se indica a continuación: Se añade agua tibia, luego si es necesario, la muestra se lleva a centrifugación de 1,500 a 2,000 rpm por un par de segundos, con esto se facilitará retirar el exceso de tinte y agua con ayuda de una pipeta Pasteur. 3. Con guantes y careta sobre una superficie alejada cubierta de papel secante, se añade a la muestra una microgota de azul de Evans (para la doble tinción o tinte diferencial) e inmediatamente se repite el proceso de lavado como en el caso del acetocarmín. Reserve con precaución todo el desecho teñido con azul de Evans para su posterior eliminación, ya que es cancerígeno). 4. La muestra se deposita en una caja Petri desechable y se observa al microscopio para identificar las células teñidas. Registre (fotos, dibujos, etcétera) las formas teñidas diferencialmente y discuta sobre las observaciones con sus compañeros y con la literatura revisada.
Anexo Proceso típico para elaborar acetocarmín 1. En campana de extracción o un área ventilada, se mezcla 9 ml de ácido acético glacial con 11 ml de agua destilada o desionizada, lo anterior para tener una solución de ácido acético al 45%. 2. Calentar la solución de ácido acético hasta ebullición, use vidrio de reloj para cubrir. 3. Agregar despacio 0.1 g de carmín a la solución de ácido acético que debe estar en ebullición. Agitar y continuar hervor lento hasta que el colorante se disuelva y enfríe a temperatura ambiente. 4. Filtre y guarde la tintura en envase gotero en refrigerador. El acetocarmín puede conservarse en buen estado por al menos un año.