Contingut d etanol L etanol és el segon component principal de totes les begudes alcohòliques. Després de l aigua és una substància fàcil d obtenir a partir de fonts nombroses i diverses, i és capaç de modificarnos l estat d ànim i el comportament. L absorció d etanol comença immediatament després de la ingesta i es realitza principalment a l intestí prim. Un cop absorbit, travessa el fetge i passa a la circulació perifèrica. L etanol és eliminat principalment al fetge (75 %), tot i que també es dóna una eliminació extrahepàtica. L eliminació és principalment per oxidació mitjançant l alcohol deshidrogenasa (ADH), l enzim responsable de fer ho. L alcohol deshidrogenasa catalitza la interconversió de l etanol i altres alcohols als aldehids corresponents. A continuació, l acetaldehid és eliminat per acció de l aldehid deshidrogenasa. L activitat ADH ha estat detectada en tots els organismes en què s ha investigat, havent se aïllat l enzim en éssers vius de diferent nivell de complexitat: bacteris, fongs, llevats, insectes, plantes i animals. OBJECTIU Determinar la concentració d etanol d una beguda alcohòlica mitjançant la reacció catalitzada per l ADH, fent servir una tècnica espectrofotomètrica. REACTIUS I APARELLS Alcohol deshidrogenasa de llevat: 1.800 unitats/ml Dissolució de NAD + 30 mm Tampó de glicina 0,1 M, amb albúmina de sèrum boví (BSA) 0,1 %, ph 10,0 Mostra problema: beguda alcohòlica diluïda Espectrofotòmetre i bany d aigua a 37 o C 1 de 5
PROCEDIMENT Per a determinar la concentració d etanol s usarà un mètode espectrofotomètric que consisteix a determinar la concentració d etanol mitjançant la seva conversió en acetaldehid i NADH reduït (tal com indica la reacció anterior), catalitzada per l ADH en presència de NAD + oxidat. La mostra problema s incubarà en presència d excés de NAD + i de l enzim ADH fins que s arribi a l estabilitat. Finalment es mesurarà la quantitat de NADH produït mitjançant la determinació de la seva absorbància a l espectrofotòmetre (colorímetre, en aquest cas). Segons la llei de Lambert-Beer, l absorbància d un compost és proporcional a la seva concentració, per valors d absorbància iguals o inferiors a 1,0. D aquesta manera, l absorbància de NADH obtinguda, que serà proporcional a la concentració d etanol, s interpolarà en la recta de calibratge següent: 2 de 5
Protocol detallat 1) Prepareu en tubs d Eppendorf dues mescles de reacció amb la composició següent: 2 mm de coenzim NAD + 50 unitats/ml d ADH de llevat Volum final 0,9 ml 2) Afegiu 100 μl de la beguda problema (vodka diluït en un factor 1/5000) en un dels tubs, i 100 μl de tampó de glicina en l altre. Aquest segon tub és el blanc sense alcohol. 3) Incubeu els dos tubs en el bany a 37 o C durant 10 min. 4) Traieu les mostres del bany i transferiu el contingut a cubetes d espectrofotòmetre. 5) Amb la cubeta que conté el blanc, ajusteu l espectrofotòmetre al valor zero. Si en qualsevol moment les cubetes s entelen per fora, s han d eixugar amb paper assecant. 6) Llegiu l absorbància de la mescla problema en l espectrofotòmetre. QÜESTIONS Qüestió 1. [2 punts] Tenint en compte els següents espectres d absorció dels components de la reacció, justifiqueu quina longitud d ona és més adequada per a fer aquesta determinació. 3 de 5
Qüestió 2. [1 punt] Justifiqueu per què creieu que és important la barreja que anomenem blanc sense etanol. 4 de 5
Qüestió 3. [1,5 punts] Indiqueu en aquesta taula quin volum dels components següents heu utilitzat en el tub de reacció: Volum (μl) Tampó de glicina, ph 10 Coenzim NAD + ADH de llevat Qüestió 4. [1,5 punts] Indiqueu quin valor d absorbància heu obtingut per la mescla que conté la beguda problema, i quina és la concentració d etanol en la barreja de reacció. Absorbància obtinguda: Concentració d etanol en la barreja de reacció: Qüestió 5. [2 punts] Indiqueu en unitats M quina és la concentració d etanol a l ampolla de vodka original. Concentració d etanol a l ampolla de vodka original: Qüestió 6. [2 punts] Tenint en compte que l etanol absolut té una densitat de 0,790 g/cm 3 i un pes molecular de 46,07 g/mol, calculeu quin és el grau alcohòlic en % (v/v) del vodka a l ampolla original. Grau alcohòlic: 5 de 5