Examen Departamental 28 de marzo de 2014, 14:00 a 16:00 horas. SICA 1, 2, 3 y SI 1, 2 Comprenderá las Unidades 1, 2 completas y la Unidad 3 solo Medios de Cultivo y Grupos Nutricionales (clasificación) http://amyd.quimica.unam.mx/course/view. php?id=30
Pruebas Bioquímicas Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificación y clasificación de bacterias y hongos.
Pruebas Bioquímicas E + S ES E + P Se pueden resumir en los siguientes puntos: Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo) Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean) Los fundamentos completos de estas pruebas y demás información pueden encontrarlos en el libro: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica de Jean F. MacFaddin, Editorial Médica Panamericana.
Hidrólisis del Almidón Prueba negativa Prueba positiva El almidón es producido principalmente por plantas superiores, está compuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilolíticas hidrolizan almidón y sus productos. Agar Almidón Sustrato: Almidón (polímero de glucosa). Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto: Glucosa. Revelador: Lugol. El lugol con el almidón forman un complejo color azul o cafépúrpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado.
Degradación de la caseína Agar Leche Descremada Sustrato: Caseína (proteína). Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere. Prueba negativa Prueba positiva Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano.
Hidrólisis de la lecitina y reducción del telurito Agar yema de huevo/agar Baird Parker Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa. Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere. Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la lecitina (fosfolípido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor. El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificación de estafilococos coagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias típicas de S. aureus son oscuras por la reducción del telurito, además presentan el halo de hidrólisis de la lecitina.
Licuefacción de la gelatina Prueba negativa Prueba positiva Gelatina Nutritiva Sustrato: Gelatina (proteína). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbón activado en polvo. La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la componen pierde su característica de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la visualización macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado.
Agar Gelatina OBJ. Determinar si el microorganismo es capaz de degradar la gelatina. Inocular el medio mediante estría recta incubar a 37 C durante 24 h Agregar HgCl 2 para revelar Prueba +: no pp alrededor de la siembra Prueba -: pp alrededor de la siembra
HIDRÓLISIS DE GELATINA Gelatina + H2O polipéptidos + H2O aa. individuales Gelatinasas y proteasas *La siembra se realiza por picadura Se incuba 24-48 h a 37 C Gelatinasas y proteasas Refrigerar 30 min y registrar resultado (-) Medio sólido (+) Licuefacción del medio
Fermentación de carbohidratos Medio base rojo de fenol más carbohidrato o polialcohol, con campana de fermentación (Durham). Sustrato: Carbohidrato o polialcohol. Vía: Fermentativa. Producto: Ácidos orgánicos. Indicador: Cualquier indicador de ph. Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG) Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados en monómeros y transportados a la célula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto orgánico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formación de gas capturado en la campana de fermentación.
Oxidación/Fermentación Hugh and Leifson Sustrato: Carbohidratos. Vías: Fermentativa y/u Oxidativa. Producto: Acido pirúvico. Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador ácido/base. Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno. La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza principalmente la vía de la Glucólisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), aunque también puede utilizar las vías de las Pentosas fosfato o Entner-Doudoroff en combinación con EMP.
Oxidación/Fermentación La oxidación de la glucosa produce ácido pirúvico por la vía de Entner-Doudoroff (ED) o por una derivación. Ambas se han encontrado en procariotes. La vía de ED ocurre en condiciones aerobias. La vía de derivación no requiere de fosforilación inicial. Glucosa Glucosa Deshidrogenasa Ácido glucónico Gluconato dehidratasa Ácido2-ceto-glucónico Cinasa Ácido 2-ceto-6-fosfoglucónico (KDPG) Reacciones ED 2 Moles de ácido pirúvico En la derivación se forma el intermediario KDPG que se incorpora a la vía de ED para formar piruvato.
Oxidación/Fermentación La producción de ácido se observa por el vire del indicador al amarillo. En los tubos positivos puede haber generación de gas. Reacción Tubo con reacción positiva Tubo abierto Tubo sellado Oxidación Abierto Amarillo (+) Verde (-) Fermentación Sellado Amarillo (+) Amarillo Ni fermentación, ni oxidación Fermentación y oxidación Ninguno Azul o verde Verde Ambos Amarillo Amarillo
Rojo de Metilo/Voges Proskauer Caldo RM/VP Sustrato: Glucosa. Vías: Fermentación ácida o neutra. Producto: Acido orgánicos o acetoína. Reveladores: Solución de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%. Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos orgánicos que provocan un descenso brusco del ph inicial del medio (viraje del indicador de amarillo ph por encima de 5,1) y rojo (ph por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO 2 y H 2 en cantidades iguales.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer Fermentación butilenglicólica: en ésta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son neutros. Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de α-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le añade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración).
Utilización de citrato Prueba negativa Prueba positiva Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Vía: Varias dependientes del ph del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO 2, lactato/acetoína y CO 2 en condiciones ácidas. Indicador: Azul de bromotimol. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Agar Hierro de Kligler (KIA) Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos SH de la cisteína. Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa- Productos: Ácidos mixtos y H 2 S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe 2+. En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2 S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H 2 S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Agar Hierro de Kligler (KIA) No fermentadores No fermenta ph = 7.4 No fermentadores de lactosa Glucosa Ácidos Mixtos Glucosa Ácidos Mixtos Péptidos Aminas Péptidos Aminas Fermentadores de lactosa Glucosa + Lactosa Ácidos Mixtos Péptidos Aminas Péptidos Aminas O 2 O 2 O 2 O 2 Pico de flauta alcalino y fondo alcalino Reacción inicial: Pico de flauta ácido y fondo ácido Reacción final: Pico de flauta alcalino y fondo ácido Pico de flauta ácido y fondo ácido Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio.
Agar Hierro de Kligler (KIA) El medio de Kligler está diseñado para la identificación de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. Interpretación: Tubo C 1 2 3 4 4A 5 Fermentación de Glucosa - - + + + + + Producción de gas de la fermentación - - - + + + + Fermentación de Lactosa - - - - + + + Producción de H 2 S - - - + - - +
Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad) Medio SIM (medio semisólido) Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cisteína y triptófano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa. Producto: H 2 S e Indol. Revelador: Sales de Fe 2+ y p-dimetilaminobenzaldehído (DMABA). Prueba positiva Prueba negativa En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2 S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H 2 S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Medio SIM (Sulfhídrico Indol Movilidad) Prueba positiva Prueba negativa Prueba negativa Prueba positiva Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del medio. El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.
1.- Medio sin inocular 2.- S -, I -, M + 3.- S -, I +, M - 4.- S +, I -, M + 1 2 3 4
Ureasa Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa. Producto: Amoníaco. Indicador: Rojo de fenol. La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de ph, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia. Prueba negativa Prueba positiva
Reducción de Nitratos Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio. Enzima: Nitrato reductasa. Producto: Nitritos. Revelador: Reactivos de Griess. N0 3- NO 2- NO N 2 O N 2 Nitrato reductasa (NAR). Nitrito reductasa (NIR). NO reductasa (NOR). N 2 O reductasa (N 2 OR).
Reducción de Nitratos El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reacción de color se debe a la formación de un compuesto diazonio, p- sulfobenceno-azoα-naftilamina. NH 2 SO 3 H Acido sulfanílico (incoloro) Acoplamiento + HNO 2 Acido nitroso SO 3 H N N SO3H Acido sulfanílico diazotizado (sal de diazonio) N N NH 2 + H 2 O + p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina (colorante rojo azo hidrosoluble) + H2O NH 2 α-naftilamina (incolora) Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.
Descarboxilasas Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA o MIO. Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Lisina descarboxilasa. Producto: Aminas Indicador: Púrpura de bromocresol. Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el ph del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.
Prueba de la coagulasa Plasma de conejo Sustrato: Factores de la coagulación. Enzima: Coagulasa (estafilocoagulasa). Producto: Coágulo. Revelador: No requiere. Prueba positiva Prueba negativa La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y formar un coagulo visible.
Oxidasa Cultivo de medio nutritivo Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto oxidado. Revelador: Reactivo de Kovacs, diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%, solución incolora. Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto colorido.
TABLAS DE IDENTIFICACIÓN Indol VP H2S Urea Movilidad Ácido de lactosa Ácido de glucosa E. coli 98 0 1 1 95 100 95 Proteus mirabilis 2 50 98 98 95 96 2 % de cepas probadas que dan positiva la prueba
Tiras API
MALDI-Biotyper Matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI Espectrometría de masas para identificación de proteínas ribosomales bacterianas. Ventaja: menor tiempo de identificación y muy buena precisión. http://www.bruker.com/products/mass-spectrometry-and-separations/maldibiotyper/overview.html
Chips para la detección de microorganismos patógenos. IFC, UNAM. http://www.dgcs.unam.mx/boletin/bdboleti n/2013_764.html http://ciber-genetica.blogspot.mx/2012/01/microarreglos-de-dna.html http://www.dgcs.unam.mx/gacetaweb/2014/140127/gaceta.pdf