INSTITUTO DE TECNOLOGÍA ORT

Transcripción

1 INSTITUTO DE TECNOLOGÍA ORT DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA ó í GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS 2016 PROFESORA MARISA TURCO Trabajo Práctico Nº 1

2 Microscopía Objetivos Describir cada una de las partes del microscopio y comenzar a relacionarse con el mismo. Adquirir entrenamiento en la técnica de enfoque con en el microscopio óptico de distintos tipos de preparados: coloreados y sin colorear. Observar protozoos de vida libre y otras células (eritrocitos) para poder establecer comparaciones en lo que se refiere a tamaño celular. Materiales Porta objetos Cubreobjetos Preparados coloreados Pipetas Pasteur Microscopios Centrífuga Tubos de centrífuga Procedimiento -Centrifugar aproximadamente entre 3 y 7 ml de agua estancada durante 5 minutos a RPM. Descartar el sobrenadante, observar el sedimento en el microscopio óptico, colocándolo entre porta y cubreobjetos. -Colocar una gota de sangre entera entre porta y cubreobjetos y observar en el microscopio óptico. -A partir de una muestra coloreada en un portaobjeto, entregada por el docente, observar en el microscopio óptico. Resultados Realizar un informe detallado, dibujando todo lo observado en cada uno de los preparados.

3 Cuestionario Realice un esquema alineando microorganismos de menor a mayor tamaño. Comenzar con los virus hasta llegar a las células eucariotas colocando las dimensiones en micrones. - Trabajo Práctico Nº 2 Distribución de los microorganismos en el medio ambiente Objetivos: Demostrar la presencia de microorganismos en el medio ambiente Describir las características morfológicas que presenta un cultivo microbiano a simple vista Clasificar los diversos caracteres culturales de los microorganismos

4 Materiales: 3 placas de petri Agar nutritivo estéril y/o CLDE Hisopos de algodón Mechero Ansa rulo 1 Exposición al aire: Dejar expuesta al aire libre durante 30 minutos una caja de Petri destapada conteniendo el medio. Tapar e incubar la placa invertida en estufa a 37º C por 24 / 48 Hs. 2 Siembra con hisopo: Tomar el hisopo, humedecerlo con agua y pasarlo sobre la piel o dientes o mesa del laboratorio, etc. Abrir la caja de Petri y con el hisopo en posición oblicua, depositarlo muy suavemente sobre la superficie del medio en forma de zig-zag. Tapar la caja e incubarla invertida en estufa a 37º C por 24 / 48 Hs. 3 Siembra con ansa: Sobre el agar de una placa estriar con el ansa suavemente en forma de zig-zag el material de una muestra bacteriana entregada por el docente. Tapar la caja e incubarla invertida en estufa a 37º C por 24 / 48 Hs. Resultados: Al cabo de la incubación, elegir distintos tipos de colonia de cada placa y describirlas. Para examinarlas, es conveniente utilizar una lupa (si se trabaja con bacterias patógenas, las cajas deben permanecer cerradas). Describir y dibujar las colonias elegidas, de acuerdo con la guía de reconocimiento.

5 Guía de reconocimiento: 1 Forma Circular Puntiforme Irregular Filamentosa Rizoide 2 Superficie Se llama superficie a la parte superior de la colonia en contacto con la atmósfera. Pulida: lisa y regular Áspera: pequeñas irregularidades Anillos concéntricos Radiada 3 Elevación Es la diferencia de nivel entre la superficie de la colonia y el medio de cultivo. Difusa Plana Elevada Convexa Umbilicada Mamelonar 4 Borde Es la periferia de la colonia Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentoso Enrulado 5 Cromogénesis Refiere al color de la colonia. Se clasifican en pigmentadas o no pigmentadas. 6 Olor El olor de las colonias puede ser frutal, ácido, etc.

6 7 Diámetro Es el diámetro aproximado en mm Cuestionario: 1 Cuál es la fuente de los microorganismos encontrados en el aire y en la superficie del laboratorio? 2 Qué es una colonia bacteriana? 3 Una colonia bacteriana continúa incrementando su diámetro por incubación prolongada? Explique. 4 Qué importancia práctica tienen los microorganismos del aire para la persona que trabaja en un laboratorio de bacteriología? 5 Cuál es la finalidad de incubar con la placa invertida?

7 Trabajo práctico Nº 3 Aislamiento de cultivos puros. Método por estría Objetivo: Obtener colonias puras a partir de una mezcla de dos tipos de bacterias. Materiales: Suspensión de mezcla bacteriana entregada por el docente. 3 placas de Petri. Medio CLDE. Ansa rulo. Preparar tres cajas de Petri con medio CLDE. Estriar la mezcla bacteriana con un ansa esterilizada a la llama del mechero, en las placas conteniendo el medio sólido de acuerdo al siguiente esquema y sin re cargar el ansa: Incubar las cajas invertidas en estufa a 37º C 24 / 48 Hs. Examen del crecimiento bacteriano: Examinar las colonias obtenidas después del período de incubación sin abrir la caja, y describirlas según la Guía de Reconocimiento del práctico Nº 1.

8 Seleccionar colonias morfológicamente diferentes de las placas examinadas. Las cajas deben conservarse para su utilización en el práctico siguiente. En caso de no obtener colonias aisladas, o una sola variedad de ellas, se procederá a un nuevo re aislamiento. Cuestionario: 1 De qué se origina cada colonia visible en el agar? 2 Establezca la diferencia entre célula bacteriana y colonia. 3 Cuál es la forma más común de las colonias separadas? 4 Cuál es la ventaja de los medios sólidos sobre los líquidos en el aislamiento de los microorganismos? 5 Cuál es la ventaja del medio CLDE con respecto al agar nutritivo? 6 Cuál es la importancia de cada uno de los componentes en el agar nutritivo y en el medio CLDE? 7 Es el agar agar un nutriente? Lo reemplazaría por gelatina? Explique.

9 Trabajo Práctico Nº 4 Tinción de Gram Objetivo: Observar microscópicamente una célula bacteriana. Materiales: Portaobjetos Colorantes Ansa rulo Aceite de inmersión Microscopio óptico Se realizará la tinción de Gram a cada uno de los distintos tipos de colonias aisladas en el trabajo práctico Nº 2, según la siguiente técnica: Lavar cuidadosamente un portaobjetos con agua y detergente, enjuagar con alcohol y dejar secar. En caso de partir de una colonia proveniente de un medio sólido, colocar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos, tomar con un ansa parte del material y homogeneizarlo en la gota de agua. Si se trata de un cultivo en medio líquido, agitar el caldo y tomar una gota del mismo con un ansa rulo y extenderlo directamente sobre el portaobjeto seco. Dejar secar el extendido al aire Fijarlo pasando el mismo tres veces por la llama del mechero (con el extendido hacia arriba). Cubrir el portaobjeto con el colorante Violeta de Gram. Dejar actuar 2 minutos. Eliminar el exceso de colorante, sacudiendo ligeramente el portaobjeto. Cubrir el portaobjeto con lugol. Dejar actuar 1 minuto. Enjuagar con decolorante (alcohol : acetona 1+1), hasta decoloración. Lavar con agua. Cubrir el portaobjeto con safranina. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua corriente. Secar al aire. Observar los distintos preparados al microscopio, con el objetivo de inmersión a 100 X. Relacionar lo observado al microscopio con la descripción morfológica hecha en el Trabajo Nº 2

10 Resultados: Los resultados se deben expresar según la siguiente clasificación: Morfología: Cocos Diplococos (de a 2) Streptococos (en cadena) Stafilococos (en racimos) Bacilos Cocobacilos Retención del colorante por la célula: Violeta = Gram (+) Rosa intenso = Gram (-)

11 Cuestionario: 1 Por qué se fijan los extendidos bacterianos? 2 Qué cambios químicos se producen durante el proceso de fijado? 3 Cuál es la naturaleza química de los colorantes empleados? 4 Describa un objetivo de inmersión y su importancia práctica. 5 Qué sucede en cada paso de la coloración de Gram, tanto en bacterias Gram (+) como en Gram (-)? 6 Qué factor puede influir en los resultados de esta tinción? 7 Qué importancia práctica tiene la coloración de Gram para el bacteriólogo?

12 Trabajo Práctico Nº 5 Integratorio Objetivo: Aplicar los conocimientos adquiridos en los trabajos prácticos realizados hasta el momento. Cada alumno recibirá muestras incógnitas aisladas de materiales clínicos previamente sembradas en distintos medios sólidos. Clasificar los distintos tipos de colonias encontradas, de acuerdo a lo realizado en el Trabajo Nº 1. Realizar a cada tipo de colonia la Tinción de Gram Resultados: Para la expresión de los resultados, deben relacionarse los aspectos macroscópicos de las diferentes colonias con su observación microscópica. Cuestionario: 1 De acuerdo a lo observado en la Tinción de Gram, qué tipo de bacterias predominan en las muestras? 2 La Tinción de Gram, sirvió para identificar la presencia de patógenos en las muestras clínicas? 3 Cuál es la utilidad de los distintos medios sólidos que fueron utilizados, en función de la muestra recibida?

13 Trabajo Práctico Nº 5 Recuento de bacterias viables aerobias mesófilas en placa Introducción: Este método cuantifica el número de bacterias vivas (viables) que posee una muestra a investigar, ya que se basa en el recuento de colonias de microorganismos que crecen en un medio de cultivo sólido apropiado. El recuento de bacterias aeróbicas no mide necesariamente el número total de bacterias viables por gramo de muestra analizada, puesto que las células bacterianas se encuentran aisladas en pares, cadenas o racimos. Por este motivo, el conteo debe expresarse como colonias por gramo o mililitro, o UFC (Unidades Formadoras de Colonia) por gramo o mililitro. Cuando se cuentan colonias debe recordarse que no todos los microorganismos crecen en las mismas condiciones. Esto es debido a los requerimientos especiales de nutrientes, oxígeno, temperatura de incubación, presencia de células dañadas, etc. Recordemos que, en contraposición, al método de recuento microscópico lo denominamos Recuento Total Directo, ya que allí cuantificamos tanto los microorganismos vivos como los muertos. En este método se trabaja con diluciones de la muestra. El objeto de diluir reside en la necesidad de transportar la carga microbiana de la muestra a número de microorganismos aproximadamente ubicados entre 30 y 300 colonias por placa. Valores menores de 30 no son representativos estadísticamente, y valores mayores de 300 pueden estar influenciados por problemas de inhibición en el crecimiento a raíz de la competencia que se genera al encontrarse las colonias muy cerca unas de las otras (antagonismo). Una vez listas las diluciones, se pueden realizar dos tipos de siembras: por extensión en superficie y en profundidad. Objetivo: Conocer el manejo de la técnica de recuento de bacterias viables en una muestra incógnita (aguas, alimentos, etc) y poder evaluar así el grado de contaminación de las mismas. Materiales: Caldo con bacterias entregado por el docente Tubos de ensayo estériles con tapa Placas de Petri estériles Agua destilada estéril Erlenmeyer conteniendo agar nutritivo o para recuento estéril

14 Espátulas de Drigalsky 1 Preparación de las diluciones: Le será entregado al alumno una muestra de caldo conteniendo aproximadamente 10 8 bacterias / ml. Las diluciones se realizan según lo indica el siguiente esquema: 100 l 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l Mc. Farland 9,9 ml H 2O 9 ml H 2O 9 ml H 2O 9 ml H 2O 9 ml H 2O 9 ml H 2O /10 2 1/10 3 1/10 4 1/10 5 1/10 6 1/10 7

15 Las diluciones se realizan junto al mechero, utilizando pipetas estériles con filtro de algodón. El agua utilizada debe ser estéril. Para homogeneizar el contenido del tubo, debe agitarse luego de cada adición. Es importante enjuagar bien la pipeta después de cada dilución, para no alterar las concentraciones. Esto se logra aspirando y soplando el líquido dentro del tubo varias veces, produciendo un burbujeo. El filtro de algodón de las pipetas impedirá que la muestra se contamine. 2 Siembra por extensión en superficie Los erlenmeyers conteniendo el medio de cultivo sólido se calientan en baño de agua o microondas hasta que el mismo funda completamente. Una vez fundido el medio, se plaquean 5 cajas de Petri estériles y se deja solidificar. Se secan las placas en la estufa hasta la completa eliminación de las gotas que haya en la superficie del agar. Este paso es de extrema importancia debido a que el agua remanente sobre la superficie de la placa puede arruinar o distorsionar todo el trabajo. Transcurrido el período de secado de la superficie, las placas se tapan y retiran de la estufa y se dejan enfriar. Comenzando por el tubo más diluido (1/10 7 ), se inocula en forma aséptica un volumen conocido de entre 0,1 y 0,2 ml en el centro de una de las placas de Petri. Se procede de igual manera con los tubos más concentrados hasta la dilución 1/10 3. Como se utiliza la misma pipeta, es importante seguir el orden que se indica, para evitar alteraciones en las concentraciones. Las placas se rotulan. El inóculo se distribuye por toda la superficie del medio utilizando una espátula de Drigalsky. Se dejan las placas unos minutos en el lugar, cerradas, para que la muestra sea absorbida por el medio. Luego se llevan a la estufa de incubación durante 48 Hs a 37º C (temperatura y tiempo requeridos por los microorganismos mesófilos) Se procede al recuento de las colonias. Este método tiene ciertas ventajas sobre el método en profundidad: No es esencial el uso de medios traslúcidos. Se puede observar la morfología de las colonias. Los microorganismos no están expuestos al calor del medio fundido, que puede dar lugar a recuentos más bajos en algunos casos. Tiene como desventaja la necesidad de usar volúmenes pequeños (0,1 / 0,5 ml) que lo hacen perder exactitud en muestras que contienen microorganismos. 3 Siembra en profundidad Se funde el medio nutritivo al igual que en el método anterior. Con una pipeta estéril de 1ml, se toma exactamente ese volumen de la muestra más diluida y se vierte en el centro de una placa de Petri estéril. Se repite la misma operación utilizando la misma pipeta, siempre del tubo más diluido al más concentrado. Se inoculan cinco placas (no se trabaja con las dos diluciones más concentradas). Es importante rotular la base de las placas con las diluciones realizadas para evitar confusiones. El próximo paso debe realizarse antes de que transcurran 15 minutos. Una vez fundido el medio de cultivo, se deja enfriar hasta los 45º C aproximadamente y se vierte sobre las placas anteriormente inoculadas en forma totalmente aséptica. El agregado del medio a mayor temperatura puede provocar la muerte de microorganismos, induciendo a errores por defecto en el recuento. Debe cuidarse también que la temperatura del agar no baje a menos de 45º C, puesto que comenzaría a solidificarse. En las placas de Petri normales se agregan entre 15 y 20 ml de medio de cultivo. Una vez agregado el medio de cultivo sobre la siembra, se debe homogeneizar. Para esto se apoya la palma de la mano sobre la placa y suavemente se realizan varios movimientos en forma de ocho. Se deja solidificar en el lugar y se incuban las placas invertidas en la estufa.

16 Resultados: a) Recuento de colonias Después de la incubación se procede al recuento de colonias. Si las colonias son pocas, se cuentan directamente. Si no, se divide la caja en cuadrantes y se cuentan las colonias de cada uno de ellos. Si son numerosas, se cuentan con la ayuda de una lupa. Se aconseja tomar en cuenta las cajas que contienen no más de 300 colonias y no menos de 30, por los errores que se cometen. Si las placas de todas la diluciones dan menos de 30 colonias cada una, se registra el número de colonias sobre la dilución más baja y se informa el valor estimado. Si las placas de todas las diluciones no presentan colonias, se informa que el recuento de colonias estimado es menor a 1 x 1 / dilución por gr o ml, según corresponda. Si todas las placas presentan más de 300 colonias, se cuentan las colonias en aquellas porciones que sean representativas de la distribución de colonias en la placa más diluida, y se informa el valor estimado. Como el número de colonias que desarrollan en el medio de cultivo a la temperatura indicada es sólo una porción reducida de la cantidad de bacterias de la muestra en examen, es más correcto expresar el resultado como colonias / ml en vez de bacterias / ml. Se expresará así que la muestra tiene tantas colonias / ml que desarrollan aeróbicamente en agar nutritivo, incubado a 37º C. El error cometido por este método es relativamente considerable, por lo tanto, no deben expresarse los resultados de manera que den una exactitud que pueda garantizar el método, pero de todas maneras se obtiene así un índice de contaminación del agua o de la muestra en estudio. b) Cálculos: El número de microorganismos se obtiene según la siguiente fórmula: Nº de microorganismos viables / ml = Nº de colonias contadas x factor de dilución Volumen de siembra Donde factor de dilución es 1/dilución. Es conveniente redondear los resultados para no dar una idea equívoca de exactitud. Si el último dígito es mayor o igual a 5 se aproxima a la decena siguiente, si es menor a la decena anterior.

17 Cuestionario: 1 Discuta brevemente la ventajas y desventajas de los dos métodos utilizados. 2 En base a esto, explique cuál método elegiría para el trabajo en el laboratorio. 3 Describa otros métodos de recuento. 4 En una placa se cuentan 200 colonias proveniente de una dilución de la muestra incógnita 10-4 (1/10.000). Se habían sembrado 0,2 ml por el método de superficie. Qué concentración de bacterias tiene el cultivo original?. 5 Proponga un esquema en el laboratorio aplicando el método de recuento aprendido para realizar una curva de crecimiento de un determinado microorganismo.

18 Trabajo Práctico Nº 6 Análisis bacteriológico de aguas Introducción: La búsqueda directa de los microorganismos patógenos causantes de enfermedades hídricas no se realiza con frecuencia en los exámenes bacteriológicos de aguas. Estas bacterias son de vida precaria fuera del organismo animal; casi siempre llegan a los cursos de agua en forma intermitente y en reducido número. Esto provoca que su investigación, ya de por sí laboriosa, pocas veces de resultados satisfactorios. La corriente es determinar la calidad higiénica del agua en una forma directa, como es la investigación de bacterias típicas del intestino humano o animal. Este es un método seguro, relativamente rápido y de extrema sensibilidad. Una muestra de agua que contenga bacterias de origen intestinal indica la existencia de una contaminación fecal, y por lo tanto la posibilidad de contener bacterias patógenas intestinales, lo cual es potencialmente peligroso. Entre las bacterias de origen intestinal se han elegido como indicadores de contaminación las que integran el grupo coliforme, es decir, bastones Gram (-) no esporulados que fermentan lactosa con producción de ácido y gas, Parte1: Análisis cuantitativo Determinación de bacterias aerobias totales Objetivo: Determinar cuantitativamente la cantidad de bacterias aerobias totales mediante el método de recuento en profundidad. Materiales: 3 cajas de Petri Agar nutritivo o agar recuento estéril

19 3 tubos estériles Pipetas de 1 y 10 ml estériles Agua destilada estéril Muestra de agua Se efectúan tres diluciones a partir de una muestra de agua contaminada empleando agua destilada estéril. Deben utilizarse tubos de ensayo y pipetas estériles. Si se trata de aguas poco contaminadas, se utilizará la muestra original y dos diluciones de 1/5 y 1/10. Si se trata de aguas muy contaminadas, se realizarán 3 diluciones sucesivas de 1/10 cada una, para obtener tres muestras cuyas concentraciones finales sean 1/10, 1/100 y 1/1000. Se funde el medio y se enfría a 45 50º C. Se coloca asépticamente 1 ml de cada dilución en cada una de las cajas de Petri, previamente marcadas con las diluciones a sembrar. Se vierte en cada una de las cajas de Petri el medio fundido. Se mezcla con suaves movimientos de rotación y se deja solidificar. Las cajas se incuban invertidas en estufa a 37º C durante 48 Hs. El tiempo transcurrido desde que se efectúa la dilución hasta el agregado del medio de cultivo no debe ser superior a los 15 minutos. Resultados: Después de la incubación se procede al recuento de colonias, al igual que se realizó en el práctico anterior. El valor normal admitido es de 50 colonias de bacterias aerobias totales / ml.

20 Parte 2: Investigación de coliformes Determinación del número más probable de microorganismos coliformes totales: METODO DE WILSON Objetivo: Determinar el grado de contaminación a través de la búsqueda de bacterias coliformes en la muestra de agua en estudio. Materiales: Muestras de agua 3 tubos de crioscopia conteniendo caldo Mac Conkey doble concentración y campanita Durham. 6 tubos de ensayo con caldo Mac Conkey simple concentración y campanita Durham. Erlenmeyer conteniendo 90 o 99 ml de agua destilada estéril según la dilución a realizar Pipetas de 10, 1 y 0,1 ml estériles. Tubos con caldo Mac Conkey simple concentración y campanita Durham. * Tubos con caldo Citrato de Koser. * * Cantidad variable según los resultados obtenidos en la primera parte de la experiencia. Según el origen de la muestra se realizará la dilución correspondiente. En tres tubos con 10 ml de caldo Mac Conkey doble concentración sembrar 10 ml de agua muestra. En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentración sembrar 1 ml de agua muestra.

21 En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentración sembrar 0,1 ml de agua muestra. Llevar todos los tubos a incubar a 37º C Hs. Resultados: Se considera positivo todo tubo que presenta ácido y gas, lo que indica que el agua posee bacterias coliformes. El número más probable (NMP) de bacterias coliformes por 100 ml se calcula mediante una tabla estadística teniendo en cuenta la combinación de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de agua y la combinación de tubos positivos. Diferenciación de las bacterias coliformes Determinación del NMP de bacterias colifecales De cada uno de los tubos Mac Conkey positivo, se repica con ansa rulo a tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey concentración simple. Se incuba a 44º C durante 48 Hs. A esta temperatura dan ácido y gas las bacterias colifecales. Mediante el empleo de esta tabla y usando la combinación original sembrada y la combinación de tubos positivos, tendremos un valor * a que mediante la aplicación de una fórmula convencional permitirá determinar el NMP de bacterias colifecales por 100 ml. Determinación del NMP de bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC). De todos los tubos positivos del caldo Mac Conkey incubado a 37º C hacer repiques con ansa recta a tubos con medio Citrato de Koser e incubar a 37º C durante 48 Hs. Se utiliza ansa recta con el objeto de no llevar a los tubos con citrato, material nutritivo del cultivo original. Esto es importante, pues pequeñas cantidades de peptona son suficientes para permitir el desarrollo de E. coli fecal y modificar por lo tanto los resultados del ensayo. Se consideran como positivos los tubos que presenten coloración azul. Si el medio permanece verde, el ensayo se considera negativo. Si la coloración es dudosa, pueden agregarse unas gotas de solución de azul de bromotimol. El citrato es utilizado por las bacterias como única fuente de carbono produciendo amoníaco; esto hace que el ph aumente junto con el desarrollo microbiano y produce el viraje del indicador, lo que es originado únicamente por las bacterias del grupo IAC.

22 Mediante el empleo de la tabla y usando la combinación original sembrada y la combinación de tubos positivos obtendremos un valor ** b que mediante la aplicación de una fórmula convencional permite determinar el NMP de las bacterias del grupo IAC por 100 ml. NMP colifecales por 100 ml = X a a+b NMP bacterias IAC por 100 ml = X b a+b Siendo: X = NMP coliformes por 100 ml *a y **b ya se explicó como se obtienen Determinación de Pseudomonas aeruginosa: Pasar 100 ml de muestra por filtro Millipore y colocar sobre Agar Cetrimida. Utilizar otra placa como control de esterilidad del medio. Incubar a 37º por 24 horas. Para confirmar, observar las placas de Agar Cetrimida con exposición a lámpara de luz UV (longitud de onda larga). Las colonias de Pseudomonas aeruginoasa se ven fluorescentes. Informar como Presencia o Ausencia. Cuestionario: 1 Qué significado tienen las bacterias coliformes en un agua de bebida? 2 Existen otras bacterias normalmente en el intestino humano? Cuáles recuerda? 3 Qué bacterias patógenas pueden transmitirse por el agua y ocasionar infecciones intestinales? 4 Qué características definen al grupo coliforme

23 5 Qué límite de bacterias coliformes se ha adoptado como máximo para una agua de bebida 6 Qué volumen tienen las porciones que se acostumbra sembrar cuando se trata de agua de bebida 7 Describa el método usado en clase para el examen bacteriológico de aguas. 8 Una muestra de agua de río dio los siguientes resultados: Análisis cuantitativo: se realiza una dilución 1/100 y se siembra 1,0 ml de la misma en profundidad. Se cuentan 50 colonias. NMP por esquema de Wilson: Tubos positivos por 10 ml 1,0 ml 0,1 ml Mac Conkey 37º C Mac Conkey 44º C Citrato de Koser 37º C Cómo informaría dicha muestra?

24 TABLA PARA LA DETERMINACIÓN DEL NMP NMP por 100 ml usando tres tubos inoculados con 10, 1 y 0,1 ml de muestra Tubos Positivos Tubos Positivos NMP 10 ml 1 ml 0,1 ml 10 ml 1 ml 0,1 ml NMP

25 >

26 Trabajo Práctico Nº 7 Pruebas Bioquímicas Bacilos Gram (-) Objetivo: Estudiar un grupo de bacterias pertenecientes a la familia de las Enterobacteriaceae, que son: bacilos Gram (-), no esporulados, mesófilos, fermentadores de glucosa, oxidasa (-), nitrato reductasa (+). Introducción: Las pruebas bioquímicas son muy importantes para la clasificación bacteriana. Estas pruebas se basan en diferentes reacciones químicas que se realizan con el fin de clasificar las bacterias. Estas utilizan los catalizadores biológicos conocidos con el nombre de enzimas. Equipo enzimático bacteriano: a pesar de su tamaño microscópico las bacterias poseen innumerables enzimas que aseguran sus funciones metabólicas. El equipo enzimático y la cantidad de cada una de las enzimas presentes en un momento dado en la bacteria, están determinados por un sistema genético de control. Localización: la mayoría de las enzimas están contenidas en la estructura celular bacteriana: intracelulares. También están aquellas que las bacterias excretan al exterior: extracelulares. Desarrollo de las diferentes pruebas bioquímicas para la tipificación de este grupo: 1 Acción de los microorganismos sobre los hidratos de carbono: Materiales: Cultivos puros entregados por el docente Medios: Caldo glucosa 1% con indicador púrpura de bromocresol y campanita Durham Caldo lactosa 1% con indicador púrpura de bromocresol y campanita Durham Caldo sacarosa 1% con indicador púrpura de bromocresol y campanita Durham Rotular cada uno de los tubos. Inocular con los microorganismos puros los tubos con caldo glucosa, lactosa y sacarosa. Incubar a 37º C y observar a las 48 Hs. Resultado: El ataque al azúcar se evidencia por: Acidificación del medio, visualizada por el viraje del indicador al amarillo (originalmente púrpura). Formación de gas, evidenciada por la presencia del mismo dentro de la campanita. Si no se visualizan cambios significa que el microorganismo no ataca ese azúcar. 2 Metabolismo de proteínas y aminoácidos - Ataque de la gelatina: Materiales: Tubos con gelatina nutritiva. Mantener gelatina en cámara fría hasta el momento del uso.

27 Inocular por punción el tubo con el microorganismo aislado. Dejar un tubo como control sin inocular. Incubar el tubo inoculado a 37º C. Examinar diariamente los tubos incubados a 37º C y durante 7 días. Para ello al retirarlos de la estufa colocarlos verticalmente en un baño frío o heladera durante 10 minutos, para poder así determinar si hay licuación por acción bacteriana o solo fusión por acción del calor. Resultados: Observan ausencia o presencia de licuación. La prueba se tomará como positiva en este último caso.

28 Interpretación: La formación de proteasas extracelulares se detecta generalmente por la licuación de la gelatina, la cual es susceptible de ser hidrolizada por una variedad de proteasas (la gelatina es una proteína desnaturalizada, no posee estructura terciaria ni cuaternaria). Peptidasas (exoenzimas) Carboxipeptidasas atacan enlaces peptídicos terminales Proteasas Aminopeptidasas (extracelulares) Proteinasas (endoenzimas) atacan enlaces peptídicos no terminales Esta prueba, salvo algunas excepciones, es generalmente negativa en esta familia. 3 Metabolismo de proteínas y aminoácidos - Ataque de bacterias sobre la leche: Materiales: Leche en polvo descremada al 10% adicionada con púrpura de bromocresol con campanita Durham. Inocular un tubo de leche con el microorganismo aislado. Guardar un tubo como control. Incubar a 37º C durante 1 semana practicando lecturas cada 48 Hs. Resultados: Expresar el cambio de ph del medio por el viraje del indicador. Indicar la presencia o ausencia de gas. Indicar la producción de coágulo. Indicar la redisolución o no del coágulo (peptonización). Interpretación: La leche es un excelente medio de cultivo porque contiene hidratos de carbono (lactosa), proteínas (caseína), grasas (fosfolípidos), vitaminas y sales minerales. Existen dos tipos de reacciones sobre la leche, según el microorganismo: Coagulación ácida: los microorganismos fermentan la lactosa con producción de ácido y gas. Al producir ácido, bajan el ph y coagulan las proteínas de la leche. En este tipo de coagulación se debe observar viraje del indicador, formación de coágulo y producción de gas. Coagulación dulce: se produce por la acción de una enzima llamada renina, que es capaz de hidrolizar caseína a p-caseína. La p-caseína, que es soluble, reacciona con sales cálcicas para precipitar p-caseinato de calcio. El líquido claro que rodea al precipitado, es suero. Esta coagulación es usualmente seguida de una proteólisis, dependiendo del microorganismo usado. En la proteólisis o peptonización, se produce acumulación de compuestos nitrogenados solubles, que implican disolución del coágulo, cambio de ph y el consecuente viraje del indicador a púrpura. 4 Rojo de Metilo: Introducción:

29 El rojo de metilo es un indicador de ph con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo). El ph al cual el rojo de metilo detecta ácido es considerablemente menor que el de otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por ende, a fin de provocar un cambio de color, el organismo en estudio debe producir grandes cantidades de ácido a partir del sustrato hidrocarbonado que emplea. Principio: La prueba del rojo de metilo es cuantitativa para la producción de ácido y requiere microorganismos positivos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa, por la vía de la fermentación ácida mixta. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de ácidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubación, sólo se consideran positivos aquellos microorganismos que pueden mantener el ph bajo luego de una incubación prolongada de entre 48 a 72 Hs. contrarrestando el sistema estabilizador del ph del medio. El medio utilizado más comúnmente es el caldo RM/VP (rojo de metilo Voges-Proskauer). Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 37º C durante 48 a 72 Hs. Luego de la incubación agregar directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo. Resultado: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción de ácido es suficiente como para bajar el ph a 4,4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de ácido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva. 5 Voges Proskauer: Introducción: La reacción de Voges Proskauer recibe el nombre de dos microbiólogos que trabajaron a comienzos del siglo XX, siendo los primeros en observar la reacción de color roja producida en medio de cultivo apropiado por tratamiento con hidróxido de potasio. Posteriormente se descubrió que el principio activo formado en el medio por metabolismo bacteriano es el acetilmetilcarbinol, un producto de la vía del butilenglicol. Principio: El ácido pirúvico, componente fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a través de varias vías, de acuerdo con los sistemas enzimáticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vías lleva a la producción de acetoína (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reacción neutra. En presencia de oxígeno atmosférico y de hidróxido de potasio al 40%, la acetoína se convierte en diacetilo y el -naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo. Inocular un tubo de caldo RM / VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 37º C durante 24 Hs. Luego de la incubación transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Añadir 0,6 ml de -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40% (relación 3:1). Es esencial agregar los reactivos en ese orden. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar de 10 a 15 minutos. Resultado: Una prueba positiva está indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de añadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. La prueba no debe leerse luego de más de una hora.

30 6 Citrato: Introducción: El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energía por vía distinta de la de fermentación de hidratos de carbono, utilizando citrato como única fuente de carbono. El medio empleado para esta prueba debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono como fuentes de carbono. Principio: La utilización de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato mediante la formación de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anión, como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco (NH3 + ), llevando a la alcalinización del medio por conversión del NH3 + en hidróxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol, amarillo a ph menor de 6,0 y azul a ph mayor de 7,6 es el indicador. Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento e inocularla en el medio con citrato. Incubar a 37º C durante 24 a 48 Hs. Luego de la incubación proceder a la lectura. Resultados: El desarrollo de un color intenso indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. 7 Fenilalanina desaminasa: Introducción: La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación mediante la enzima desaminasa forma un cetoácido, el ácido fenilpirúvico. Principio: La prueba de fenilalanina se basa en la detección de ácido fenilpirúvico en el medio, tras el desarrollo del organismo en estudio, mediante la adición de cloruro férrico. Inocular el agar en pico de flauta con una colonia de cultivo puro. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Luego de la incubación añadir 4 o 5 gotas de reactivo cloruro férrico al 10%, directamente sobre la superficie del agar. Resultado: La inmediata aparición de un color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y por ende una prueba positiva. 8 Ureasa (BAM): Introducción: La urea es una diamida del ácido carbónico. Todas las amidas son fácilmente hidrolizadas con liberación de amoníaco y dióxido de carbono. Principio: La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar urea. El amoníaco resultante de esta hidrólisis reacciona en solución para formar

31 carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del ph del medio. El medio utilizado es el BAM (Buenos Aires Modificado). Inocular el medio mediante ansa recta con el microorganismo aislado en cultivo puro. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Luego de la incubación proceder a la lectura. Interpretación: Los microorganismos que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 Hs, mientras que las especies menos activas pueden requerir 3 o más días. 9 SIM: Introducción: Este medio es usado para determinar la producción de sulfuro, indol y movilidad. Principio: Producción de sulfuro de hidrógeno: La capacidad de ciertas especies bacterianas para liberar azufre de aminoácidos y otros compuestos que lo contienen, en forma de H2S, constituye una característica importante para su identificación. Para que el H2S pueda ser detectado, el medio debe contener: una fuente de azufre, un indicador de H2S y debe promover el desarrollo de la bacteria en estudio. Los medios más comúnmente usados a tales fines son TSI y SIM. Movilidad: Las bacterias se mueven por medio de flagelos cuyo número y ubicación varía en las diferentes especies. Los medios para detectar movilidad contienen concentraciones de agar al 0,4 % o menos. Los medios combinados, tales como SIM y MIO sirven para tales fines. Indol: El indol, un bencilpirrol, es uno de los productos de degradación metabólica del triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de Kovac. Se debe utilizar un medio rico en triptofano. En la práctica se emplean medios combinados tales como SIM (sulfuro indol movilidad) o MIO (movilidad indol ornitina). Realizar una única punción en el centro del tubo, utilizando ansa recta. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Interpretación: La producción de H2S se visualiza por la presencia de un precipitado negro. El indol se revela con el reactivo de Kovacs. Se debe agregar luego de la incubación 5 gotas por la pared del tubo. El desarrollo de un color rojo fucsia vivo en la interfase segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva. La movilidad se visualiza, observando si la bacteria invade todo el agar (se observa presencia de turbidez en todo el medio) o solamente crece en la zona de la estría. 10 TSI Triple Azúcar Hierro: Introducción: Este medio sirve para la detección de ácido y gas a partir de la glucosa, lactosa y sacarosa. También se detecta la producción de H2S. La lactosa y la sacarosa están presentes a una concentración 10 veces mayor que la glucosa. Se utiliza sulfato ferroso como detector de H2S.

32 Sembrar con ansa recta el pico del tubo. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Proceder a la interpretación. Resultados: Si no hay cambio en el medio, significa que el microorganismo en estudio es no fermentador, o sea, que es incapaz de producir ácido por fermentación de glucosa o lactosa. Una fermentación inicial del fondo y del pico del medio con posterior retorno del pico al color original (ya que se forman aminas alcalinas por descarboxilación oxidativa de proteínas cerca de la superficie), indica la presencia de bacterias que fermentan la glucosa. Una acidificación completa permanente del fondo y del pico revelan la presencia de bacterias fermentadoras de lactosa.

33 11 LIA (Agar Lisina Hierro) Introducción: Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato específicas, capaces de actuar sobre la porción carboxilo (COOH) de los aminoácidos, con formación de aminas de reacción alcalina. Cada una de las descarboxilasas es específica para un aminoácido. Este medio se basa en la descarboxilación de la lisina, la formación de sulfuros y la fermentación de la glucosa. Estriar con un ansa recta pico y fondo del medio. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Luego de la incubación, proceder a la lectura. Interpretación: Se debe leer pico y fondo: Pico y fondo color violeta indican prueba positiva. Pico violeta y fondo amarillo, no hay descarboxilación. Pico color rojo intenso y fondo amarillo, implica desaminación. Fondo con precipitado negro, indica producción de H2S. 12 MIO (Movilidad Indol Ornitina): Introducción: Esta prueba se utiliza para ver movilidad, producción de indol y actividad de la enzima ornitina descarboxilasa. Con un ansa recta, realizar una única punción en el centro del medio. Incubar a 37º C durante 24 Hs. Proceder a la lectura Interpretación: Fondo amarillo, indica reacción negativa. Todo el tubo de color violeta igual al original, indica descarboxilación positiva. La movilidad y la producción de indol se interpretan igual que en la prueba SIM. Identificación de la bacteria de acuerdo a las pruebas bioquímicas: Una vez realizadas todas las pruebas bioquímicas, se procede a la identificación de la bacteria en estudio, haciendo coincidir los resultados obtenidos en la siguiente tabla.

34 Trabajo Práctico Nº 8 Pruebas Bioquímicas - Cocos Gram (+) Objetivo: Estudiar un grupo de cocos gram (+), llamados Estafilococos (cocos en racimo) y su diferencia con los Estreptococos (cocos en cadena). Introducción: En el grupo de los cocos gram (+) existen dos familias importantes: MICROCOCCACEAE: cocos gram (+), catalasa (+) Se dividen en tres géneros: Estafilococos: aerobios facultativos Micrococos: aerobios estrictos, inmóviles Planococos: aerobios estrictos, móviles STREPTOCOCCACEAE: cocos gram (+), catalasa (-) Desarrollo de las diferentes pruebas bioquímicas para la tipificación de este grupo: 1 Prueba de la catalasa: Introducción: La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. Químicamente la catalasa es una hemoproteína, de estructura similar a la hemoglobina, excepto que los cuatro átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe 3+ ). Excluyendo los Estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayoría de las bacterias anaerobias descompone el H2O2 con peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo que cada molécula contiene un solo ion férrico. Principio: El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, como lo demuestra la siguiente reacción: H2O > H2O + O2 catalasa Esta prueba es muy comúnmente utilizada para diferenciar Estreptococos (-) de Estafilococos (+) o de especies de bacilos Gram (+) y Micobacterias. Con un palillo aplicador con la punta aguzada transferir células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos limpio. Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% y observar si hay burbujeo. Se recomienda no añadir el microorganismo al reactivo, especialmente si se utilizan agujas o ansas que contienen hierro, ya que se pueden producir resultados falsos positivos. Interpretación: La rápida aparición sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una reacción positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces también de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 o 30 segundos no se consideran una prueba positiva.

35 2 Prueba de la coagulasa: Introducción: La coagulasa es una enzima proteica de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina provocando por lo tanto la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de un cultivo puro de 24 hs en caldo del organismo en estudio. Mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido. Incubar el tubo a 37º C y observar la formación o no de un coágulo visible. Interpretación: La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. 3 Fermentación del manitol: Introducción: El S. aureus en contraste con el S. epidermiris, fermenta el manitol con producción de ácido. El agar manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos en cultivos mixtos. Este medio aprovecha la capacidad de los estafilococos de desarrollar en presencia de cloruro de sodio al 7,5 % y la del S. aureus de fermentar el manitol. Estriar la muestra con un ansa esterilizada a la llama del mechero, en las placas conteniendo el medio agar manitol salado. Debe sembrarse masivamente debido al potente efecto inhibidor de este medio. Incubar a 37º C durante 24 a 48 Hs. Interpretación: Colonias con halo amarillo luminoso y crecimiento intenso corresponden a microorganismos manitol positivos (S. aureus). Colonias sin cambio de color y con crecimiento débil, corresponden a microorganismos manitol negativos (S. epidermiris y otros). 4 Prueba de la DNAsa: La prueba consiste en crecer la bacteria en un medio nutritivo que contenga DNA para observar si la bacteria en estudio tiene la enzima DNAsa. La enzima DNAsa depolimeriza el DNA y alrededor de la colonia se forma un halo transparente. El medio contiene un indicador, si no lo posee debe ser visualizado con HCl 1 N.

36 5 Prueba de oxidación / fermentación (OF): Introducción: Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativa u oxidativamente Los productos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa de la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere un medio de oxidofermentación más sensible. Principio: El medio OF difiere de los medios de fermentación de hidratos de carbono en lo siguiente: la concentración de peptona es más baja, la concentración de hidratos de carbono es más alta y la concentración de agar es más baja (semisólido). La menor relación de proteína a hidratos de carbono reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamente mayor de hidratos de carbono sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido, mientas que la consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de ph. Este medio es también apto para determinar movilidad. Se requieren dos tubos para esta prueba, inoculados con el microorganismo en estudio con un ansa de punción. Uno de los tubos debe ser cubierto con una capa de 1 cm de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 37º C durante 48 Hs. Interpretación: La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos, la producción de color se pueden notar primero cerca de la superficie del medio. El siguiente cuadro indica los patrones de reacción: Tubo abierto Tubo cerrado Tipo de metabolismo Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo Ácido (amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacarolítico 6 Prueba de la Bacitracina:

37 Sobre un medio sólido con agar nutritivo, se coloca una suspensión homogénea del germen. Se coloca un disco de Bacitracina, antibiótico que inhibe la presencia de los micrococos, a diferencia de los estafilococos que son resistentes y pueden crecer alrededor del disco de antibiótico.