Microbiología General

Transcripción

1 Microbiología General Seminario Nro. 4 Aislamiento e identificación de Microorganismos

2 Para qué aislar microorganismos i? Para qué identificar un microorganismo? Caracterización vs. Identificación 1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva 2. Pruebas Moleculares Identificación final

3 Aislamiento e identificación de microorganismos Procedencia Características Expectativas Métodos convencionales Métodos moleculares Tratamiento inicial Siembra Aislamientol i t Identificación

4 Tratamiento inicial Enriquecimiento (selectivo o no) Calentamiento Filtraciónió Homogeneización, etc Selección de medios de cultivo Siembra Inóculo Observación microscópica

5 Aislamiento Agotamiento por estrías, dils seriadas, etc Subcultivo Criterios de pureza Macroscópicos Microscópicos Cultivo puro Identificación

6 Muestras Agua Microorganismos indicadores Coliformes P. aeruginosa Detección de B. cereus en leche en polvo, miel, arroz Alimentos Detección de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados

7 Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo Selección de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estrías Mossel Colonias aisladas Man (-), Lecitinasa (+) Cultivo puro Repique Tinciones

8 Morfología de las colonias Forma y tamaño de las colonias Irregular, puntiforme Bordes liso, rugoso. Elevación Convexo, elevado, umbonado, liso. Color Pigmento, opaca, translucida, brillante. Textura Textura Mojada, mucosa, seca.

9 Bacillus subtilis Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Forma de la colonia y tamaño: irregular Bordes: ondulado Típico movimiento sobre la caja de petri Elevación: umbonada Color: Blanca crema Textura : seca

10 Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

11 Catalasa Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática de radicales superóxido. Micrococcaceae, Staphylococcus catalasa (+) Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus catalasa (-) Catalasa + 2H 2 O 2 2H 2 O+ O + 2 -

12 Oxidasa Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa c (respiración). Oxidasa negativaoxidasa positiva. La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor de electrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo oxidasa. oxidasa (+) Pseudomonas oxidasa (-) E. coli Neisseria

13 I M Vi C Indol Rojo de Metilo Vohes Proskauer Citrato

14 Indol Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la molécula de triptofano triptofanasa Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio HCl Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo) Alcohol isoamilico Reactivo de Kovacs

15 Indol El triptofano se adiciona al medio en una concentración 1%. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

16 Rojo de metilo Voges Proskauer Glucosa Piruvato Lactato CO 2 Acetil-CoA + Succinato Etanol Acetato t Formiato CO 2 H 2 Glucosa Piruvato 2.3Butanodiol + CO 2 Etanol Lactato Succinato Acetato CO 2 + H 2

17 Voges-Proskauer (VP) Daniel Voges Bernhard Proskauer Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3-butanediol como resultado de la degradación de glucosa. Glucosa Piruvato Acetoina 2.3-butanediol + α -naphtol O 2 40% KOH Alcohol Barritt's A Barritt's B Diacetilo + Creatina (Rojo) α -naphtol en etanol absoluto KOH 40%

18 Rojo de metilo Rojo de metilo (MR) Para identificar bacterias que producen fermentación mixta de la glucosa y liberan ácidos estables. Este medio de cultivo incluye, peptona, glucosa, y buffer fosfato. El indicador de ph rojo de metilo se adiciona i a un cultivo crecido 48 hs. Por debajo de 4.4, 4 el indicador d cambia a rojo (positivo).amarillo con ph por encima de 6.0 (negativo)

19 Citrato Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato como única fuente de carbono. Citrato permeasa Citrato de Sodio Acido piruvico i + Acido oxalacetico + CO 2 Citrasa Exceso de Sodio + CO 2 + H 2 O Na 2 CO 3 (liberado luego de usar el citrato) (Alcalino --> ph)

20 Citrato Agar Citrato de Simmon: Es un medio definido que contiene Citrato de Sodio como única fuente carbonada y amonio como única fuente de nitrógeno. Un MO que utiliza citrato como fte de C también utiliza las sales de amonio como su única fte de N dando como resultado amoníaco que alcalinizan el medio. El indicador de ph, azul de bromofenol, cambia de verde a ph neutro (6.9) a azul a ph mayores que 7.6.

21 Tree Sugar Iron Agar (TSI) Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o sacarosa, y para producir sulfuro de Hidrogeno. Se usa para distinguir entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Que además son capaces de fermentar glucosa y producir ácidos como producto final. Azúcar Productos ácidos ph (Amarillo) Peptonas Amoniaco (NH 3 ) ph (Rojo) Fermentación (medio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH 2 (gas) SH 2 + iones férricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

22 Triple Sugar Iron Agar (TSI) Fermentación Utilización de Las peptonas p Producción de gas Producción de SH 2

23 Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación Rojo/Amarillo Amarillo/Amarillo Rojo/Rojo Rojo/sin cambio Amarillo/Amarillo con disrupción del agar Rojo/Amarillo con disrupción del agar Rojo/Amarillo con disrupción del agar y PP negro Rojo/Amarillo y PP negro Amarillo/Amarillo y PP negro K/A A/A K/K K/NC A/A,G K/A,G K/A,G, H2S K/A, H2S A/A, H2S Solo fermenta la Glucosa, y luego utiliza las peptonas Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa No hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas No hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas aeróbicamente Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con producción de gas Solo fermenta la Glucosa, con producción de gas Solo fermenta la glucosa con producción de gas y H 2 S Solo fermenta la glucosa y produce H 2 S Fermentación de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con producción de H 2 S Sin cambio/ Sin cambio NC/NC No hay crecimiento

24 Fermentación de carbohidratos (Caldo - rojo fenol) Se adiciona un azúcar al medio: Lactosa, sacarosa, glucosa, etc. Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares y producción de gases. Se usa para identificar bacterias entéricas Gram negativas.

25 1- Control sin inocular 2- Amarillo: Utilizaciónió del azúcar, producción de ácido sin gas. 3- Amarillo y producción de gas. 4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del medio de cultivo producto de utilización de peptonas y liberación de amonio. Fermentación de sacarosa Fermentación de glucosa Fermentación de lactosa organismos resultados 1..Control o Negative 2. S. aureus Acid 3. P. vulgaris Acid, Gas 4P 4. P. aeruginosa Negative 5. E. coli Negative orgamismos 1. Control resultados Negative 2. S. aureus Acid 3. P. vulgaris Acid, Gas 4. P. aeruginosa Negative 5. E. coli Acid, Gas organismos resultados 1. Control Negative 2. S. aureus Acid 3. P. vulgaris Negative 4. P. aeruginosa Negative 5. E. coli Acid, Gas

26 Reducción de nitrato Muestralacapacidaddeunm.odereducirnitrato(NO 3 )a nitrito(no 2 )uotros componentes del nitrógeno como (N 2 ), usando la enzima nitrato Reductasa. NO H + 2e- NO 2 + H 2 O nitrato reductasa Nitrato (NO 3 ) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiración anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como sustrato. NO 2 NH 3 N 2

27 Reducción de nitrato (Reactivo A) (Reactivo B) Acido Sulfanilico + NN dimetil-1-naftalenamina + inoes nitrato Sulfobenzeno azo-nn dimelethylen-1-naptalenamino (rojo) Si luego de agregar los reactivos A y B no aparece coloración se agrega Zn. El Zn es capaz de formar un complejo coloreado con el Nitrato. Por lo tanto si no aparece coloración este fue utilizado y entonces el MO es capaz de reducir el Nitrato - +

28 Prueba de decarboxilación de aminoácidos Muestra la capacidad de un microorganismo para decarboxilar un aminoácido para formar una amina, con al consiguiente alcalinidad. Indicador de ph: púrpura de bromocresol. Se coloca aceite mineral para crear un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentación. Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. Aceite mineral Arginina Ornitina Lisina Control ( - ) ( + ) ( + )

29 Prueba de fenilalanina-desaminasa Se utiliza para identificar acción delaenzimaphenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (Positivos) de otros grupos como Enterobacteriaceae (negativos). El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH 2 )y libera amonio (NH 3 ). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la adición ió de unagente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%). Un cambio de color al verde indica una reacción positiva. Negativo Positivo

30 Prueba de ureasa Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa ureasa Urea + 2 H 2 O CO 2 + H 2 O + 2 NH 3 (NH 4 ) CO 3 1. No inoculado 2. Proteus vulgaris: Positivo 3. Escherichia coli: Negativo

31 Prueba de hidrólisis de caseina Determinar la capacidad d de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla caseína E. Coli (-) S. aureus (-) Bacillus subtillis (+)

32 Prueba de licuefacción de Gelatina Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preotelítico (gelatinasas) que licuan gelatina Proteína + H 2 O Polipéptidos Gelatinasas Polipéptidos + H 2 O Aminoácidos individuales - +

33 Prueba de hidrólisis de Almidón Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón mediante enzimas del tipo amilasas α-amilasa Almidón dextrinas + maltosa + glucosa H 2 O polisacáridos disacárido monosacárido Lugol (-) (+)

34 Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo Selección de esporas Calentamiento Enriquecimiento Agotamiento por estrías Mossel Identificación y caracterización Catalasa Fermentación de azúcares Hemólisis Detección de genes de virulencia (toxinas-pcr hbla, B, C, D.) Cultivo puro Colonias aisladas Man (-), Lecitinasa (+) Tinciones Repique

35 Tests Multipruebas

36 API 50 CH Se utiliza para Bacterias del ácido láctico Patrón de fermentación de 49 fuentes de carbono

37 API 20 E Contiene 20 pruebas para la identificación de bacterias Entéricas

38 API Staph Para Staphilococcus API 20NE Para bacterias gram - no entéricas

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