FILTROS ELECTROPOSITIVOS Y REACCIÓN DE PCR PARA LA CONCENTRACIÓN Y DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE VIRUS Y BACTERIAS EN AGUAS Víctor Ramírez Angulo Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua, Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Paseo Cuáuhnahuac No. 8532, Jiutepec, Morelos, 62550. México, Tel./fax (1) 19 42 81, e-mail: vramirez@tlaloc.imta.mx. RESUMEN: Entre los problemas que enfrenta la detección confiable de patógenos presentes en agua, resalta por su importancia la carencia un método aplicable para todos ellos. Ademas, su análisis por si mismo es técnicamente difícil y laborioso por la baja concentración de patógenos presentes en la mayoría de las aguas, requiriendo concentrar grandes volúmenes, aunado a la falta de métodos aplicables a la detección en el ambiente acuático. En este trabajo se muestran los resultados preliminares en la concentración simultánea de enterovirus y Vibrio cholerae toxigénico de aguas mediante el uso de filtros electropositivos y la detección por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Con este procedimiento de concentración simultánea se reduce de manera considerable el tiempo de análisis, y la aplicación del método de PCR ademas de ser rápido para análisis de bacterias y virus, da sensibilidad y reproducibilidad para el monitoreo de patógenos microbiológicos presentes en aguas. Con la extrapolación de estos métodos desarrollados en el IMTA hacia otros microorganismos de importancia médica como Giardia, Entamoeba, rotavirus, Criptosporidium y a otros laboratorios, se podría tener un control mas adecuado de las condiciones sanitarias del agua para uso y consumo humano del país. INTRODUCCIÓN A nivel mundial, 25 millones de personas mueren cada año en el mundo a causa de la contaminación del agua, sobre todo en países en vías de desarrollo, y la mitad de las enfermedades se trasmiten a través de ella. Cuando las personas carecen de agua apta para el consumo y saneamiento, peligran prácticamente todos los aspectos relacionados con la salud y el desarrollo. Los patógenos como virus entéricos y bacterias presentes en heces de personas infectadas, pueden eventualmente tener contacto con las fuentes de abastecimiento usadas y ser la causa de brotes epidémicos
(MA, Ju-Fang et al, 1977). Aproximadamente en la mitad de los casos de enfermedades trasmitidas por el agua, no se ha identificado el agente causal por la falta de métodos de detección lo suficientemente sensibles y la enfermedad ha sido descrita como gastroenteritis de origen desconocido. Sin embargo, con el desarrollo y aplicación de técnicas de biología molecular como la transcripción en reversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha encontrado que la mayoría de estas enfermedades fueron causadas por virus entéricos, parásitos y bacterias anteriormente no detectadas con los métodos tradicionales, tales como pruebas bioquímicas, inmunología, inmunomicroscopía electrónica y cultivo de células entre otros. (Yates, 1992). Algunos de los problemas relacionados con la detección confiable de patógenos, encontrados en aguas, son la falta de un método de detección aplicable a todos o la mayoría de los microorganismos. Es necesario hacer adecuaciones a los métodos originalmente diseñados para muestras clínicas ya que en el caso de contaminación de aguas se enfrenta ademas la problemática de una alta dilución, diversidad de microorganismos, contaminantes químicos y la necesidad de implementar métodos eficientes de reconcentración de hasta 10 6 veces el volumen original, Para el análisis de enterovirus en aguas se ha reportado que la combinación de un método de concentración a través de filtros electropositivos y la detección mediante métodos de RT-PCR da muy buenos resultados; por otro lado, para monitorear la presencia de Vibrio cholerae O1 toxigénico en aguas (agente causal de la reciente epidemia de cólera diarreico en el mundo), los métodos validados para su análisis en aguas involucran una serie se pruebas bioquímicas y serológicas que llevan de 5-7 días. Recientemente, en el laboratorio de Calidad del Agua del IMTA se han estandarizado las condiciones de concentración y detección de enterovirus en aguas a través de filtros electropositivos y el método de RT-PCR, respectivamente (Ramírez, V., 1997; Ramírez, V., 1998). En este trabajo se reportan los resultados preliminares de la extrapolación de las condiciones de concentración originalmente estandarizadas para enterovirus en aguas, con ligeras modificaciones para la concentración simultánea de enterovirus y Vibrio cholerae O1 toxigénico y su detección por el método de RT-PCR. MÉTODOS Cepas de enterovirus y Vibrio cholerae O1 toxigénico. Para estandarizar las condiciones del método de concentración de virus, se usaron como control virus atenuados de la vacuna antipoliomelítica trivalente tipo Sabin, donada por el Instituto Nacional de Virología. Para el caso de V. cholerae, se aplicó una cepa donada por el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica (INDRE), propagada en caldo infusión cerebro corazón. Preparación de las muestras. Se prepararon muestras de 8 litros de agua de la llave con 2x10 6 unidades formadoras de placa (UFP) de virus y con aproximadamente 1x10 8 vibriones de V. cholerae O1.
Concentración de enterovirus y bacterias. Para concentrar tanto los virus como las bacterias se hizo pasar la solución conteniendo los microorganismos a través de un cartucho electropositivo con matriz de celulosa y melamina con poro nominal de 5 µm a una presión de 4 libras/pulgada 2. Los microorganismos retenidos por atracción electrostática fueron eluídos con una solución de extracto de carne al 3%-glicina 0.05 M ph 9.5, pasada en sentido inverso al usado para concentrarlos. La solución concentrada obtenida del filtro (aproximadamente 350 ml), fue centrifugada a 3,500 rpm para separar las bacterias de los virus. El precipitado conteniendo las bacterias fue resuspendido en 5 ml de solución salina estéril al 0.85 %. Por otra parte, el sobrenadante conteniendo los virus fue reconcentrado por floculación ácida al bajar el ph con HCl 1 N hasta 3.5 y mezclar por 30 minutos. Se recuperaron los virus de la solución al centrifugar a 11,000 rpm/20 minutos/4 C y resuspender el precipitado en 4 ml de agua libre de ARNasas (tratada con dietilpirocarbonato, DEPC). Con este procedimiento, se reconcentró un promedio de dos mil veces la muestra original, ver esquema en figura 1. Figura 1. Concentración de virus y bacterias de aguas. Extracción del ARNm viral. Los virus concentrados fueron sometidos a extracción del ARNm con una resina específica para este propósito de acuerdo al procedimiento siguiente: a 1 ml del concentrado viral se agregó isotiocianato de guanidina a 1.5 M concentración final y se mantuvo a 4 C por un mínimo de 30 minutos. Posteriormente, se agregaron 10 µl de la resina y se mezcló a intervalos de 5 minutos durante 30 minutos; finalmente, se practicaron tres lavados con una solución de etanol al 50%, cloruro de sodio (NaCl) 0.5 M, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.005M, ácido clorhídrico (HCl) 0.05 M, ph 6.8. El ARN extraído se resuspendió en 25 µl de agua tratada con DEPC y se almacenó a 70 C hasta su uso para síntesis enzimática de ADN complementario. Reacción de transcripción reversa (RT). A un microtubo de 200 µl, se agregaron 11 µl del ARN previamente extraído y 1 µl de fragmentos de ADN iniciador (random primers) para la síntesis de una cadena de ADNc a partir del ARNm. El microtubo conteniendo los componentes mencionados, fue
calentado a 70 C durante 10 minutos y se incubó a 4 C por 1 minuto. A continuación, se adicionó el amortiguador para la síntesis de la primera cadena de ADNc, ditiotreitol (DTT) 0.1M y la mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato (dntps) a 5 mm c/u. Se incubó la reacción a 42 C durante 50 minutos después de agregar 200 unidades de enzima transcriptasa reversa. Pasado este tiempo, se inactivó la enzima al incubar los tubos a 95 C por 2 minutos y bajar a 4 C para realizar la reacción de PCR. Reacción de PCR para virus y bacterias. Con esta reacción altamente específica para amplificar hasta en 10 6 veces una parte del genoma viral y bacteriano es posible evaluar la versatilidad de este sistema de concentración de microorganismos presentes en agua. Para el análisis del genoma bacteriano, se tomaron 500µL de las diferentes muestras (cultivo en caldo BHI, dilución 1/8,000, filtrado y reconcentrado) y se sometió a ebullición por 20 minutos. Pasado este tiempo, se pasaron los tubos a hielo hasta su uso en la reacción de PCR. Asi mismo, para análisis de enterovirus, se uso el ADNc obtenido de la reacción de RT descrito en párrafo anterior. Brevemente: en un microtubo de 200 µl se pusieron 46 µl de la solución de reacción para PCR enumerada en la tabla 1 y 4 µl del ADN viral o bacteriano. Se sometió a amplificación con el método 66 consistente en: 95 C/5 minutos, 32 ciclos de tres temperaturas (94 C/15 segundos, 50 C/15 segundos, 72 C/20 segundos), tres ciclos de tres temperaturas (94 C/30 segundos, 50 C/30 segundos, 72 C/30 segundos), 72 C/5 minutos y 4 C, figura 2 y 3. Electroforesis en gel de agarosa. Para evaluar la efectividad del método de concentración de Vibrio cholerae O1 toxigénico y virus, se analizaron 10 µl de la reacción de PCR por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5 % en una cámara sumergida a un voltaje de 80 mv. Se permitió migrar el color azul del indicador hasta 2/3 partes de largo del gel y se tiñó con bromuro de etidio (0.5 µg/ml concentración final). La observación de los resultados de la reacción de PCR se realizó al exponer el gel teñido a luz ultravioleta. Tabla 1. Reacción de PCR REACTIVOS V.cholerae TOXIGÉNICO. ENTEROVIRUS Amortiguador para PCR, 10X 5 µl 5 µl Solución de dntps, 2 mm c/u 1 µl 1 µl Oligonucleótidos VC11+VC12, 2 µl ------------------------------ 20 pmol c/u Oligonucleótidos AEV1+AEV2 ---------------------------------- 2 µl 20 pmol c/u Taq polimerasa 5 unidades/µl 0.5 µl 0.5 µl Agua destilada estéril 37.5 µl 37.5 µl ADNc 4 µl 4 µl Total de reacción 50 µl 50 µl
TOXINA DEL CÓLERA, SUBUNIDAD A VC11 VC12 TOXINA DEL CÓLERA, SUBUNIDAD B 564 pb TAMAÑO ESPERADO DEL PRODUCTO DE PCR OLIGO VC11: 5 -CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC-3 LOCALIZACIÓN : 73-94 pb OLIGO VC12: 5 -CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G-3 LOCALIZACIÓN 614-636 pb Figura 2. Secuencia y posición de oligonucleótidos para la amplificación del gen de la toxina de Vibrio cholerae. 5 AAAA 3 1kb 2kb 3kb 4kb 5kb 6kb 7kb AEV1 434 pb 5 -CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3 AEV2 5 -TTGTCAACCATAAGCAGCCA-3 LOCALIZACIÓN 162-1182 LOCALIZACIÓN 577-596 Figura 3. Región consenso no codificante y posición de oligos para identificar enterovirus por RT-PCR.
RESULTADOS Concentración de bacterias. En los carriles 1 al 4 de la figura 4 se muestran los resultados de aplicar una suspensión de Vibrio cholerae (aproximadamente 1x10 8 unidades formadoras de colonias, UFC) al proceso de reconcentración mediante un cartucho electropositivo. En el carril 1, se muestra la amplificación positiva del gen ctxa (fragmento de 564 pb) a partir de 0.8 µl de cultivo bacteriano (aproximadamente 80,000 UFC). Para la muestra número 2, se diluyó 1 ml de la suspensión celular en 8 L y se tomaron 0.8 µl (aproximadamente 10 UFC), y no se logró la detección de V.cholerae. En el carril número 3, se aprecia una amplificación abundante y corresponde a 0.8 µl de los 5 ml en los que se resuspendieron las bacterias retenidas en el filtro. En el carril 4, se muestra el resultado del filtrado (el agua que pasó a través del filtro). Concentración de enterovirus. Como se aprecia en el carril 6 de la figura 4, (que corresponde a la muestra reconcentrada), los virus fueron retenidos eficientemente por cargas electrostáticas. Mediante la extracción del ARNm, reacción de transcripción en reversa (RT) y el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se obtuvo una amplificación de un fragmento con tamaño de 434 pb, correspondiente a la región conservada no codificante de enterovirus, ver esquema en figura 3. En el carril 5 de la misma figura donde se pusieron aproximadamente 4 UFP viral, no se aprecia amplificación de dicho gen. En el carril 7 se usaron un promedio de 4,000 UFP de vacuna triple de la polio como control en los métodos de extracción de ARNm, reacciones RT-PCR. Para el carril B y PM se usó un blanco de reacción (solo agua) y 8 µl de un marcador de peso molecular (PM) para productos de PCR de 50 a 1000 pb, respectivamente. 1 2 3 4 5 6 7 B PM 1000 700 525 500 400 300 Figura 4. Electroforesis de los productos de PCR y RT-PCR de Vibrio cholerae O1 toxigénico y enterovirus. Carriles 1 al 4 Vibrio cholerae (pozo 1, 8x10 4 UFC; pozo 2, 10 UFC; pozo 3, 0.8 µl de concentrado final [5 ml] y pozo 4, 0.8 µl del filtrado bacteriano [8 L]; carriles 5 al 7, enterovirus (pozo 5, 4 UFP; pozo 6, muestra reconcentrada y pozo 7, 4,000 UFP de vacuna triple de polio [control positivo]); carril B, blanco y carril PM, marcador de peso molecular 50-1000 pb. 200 100
DISCUSIÓN DE RESULTADOS En la concentración de virus, aplica el principio básico de que la partícula viral se adsorbe al filtro o material adsorbente por medio de interacción electrostática de cargas opuestas. Los virus entéricos a un ph cercano al neutro, tienen una carga neta negativa. Por lo tanto, un filtro de carga neta positiva, es una matriz ideal para la adsorción del virus. En este trabajo, se encontró que no solo los virus son retenidos por su carga neta negativa sino también las bacterias. Como era de esperarse, las muestras Vibrio y enterovirus no sometidas a concentración (carriles 1 y 7 de la figura 4), fueron amplificadas eficientemente debido a la alta concentración de microorganismos (aproximadamente 1x10 8 UFC/mL y 2x10 6 UFP/0.1 ml, respectivamente). En cambio en las muestras tomadas de la dilución (1/2,000,000 del total) tanto de virus como de bacterias, carriles 2 y 5 no se apreció crecimiento de V. cholerae al filtrar 100 ml y sembrar en BHI ni amplificación de Vibrio cholerae y enterovirus por los métodos de PCR y RT-PCR, respectivamente. La falta de detección pudo deberse al bajo nivel de células analizadas (aproximádamente 10 UFC) y al número tan reducido de partículas virales (aproximádamente 4 UFP). Asi mismo, se sembraron 100 ml del filtrado en cajas con BHI para evaluar si el total de las bacterias son retenidas por el filtro y no se detectó crecimiento por el método de filtro de membrana (no mostrado) ni por PCR (carril 4 de figura 4). Lo anterior, nos podría indicar que existe un alto nivel de retención tanto de bacterias como de virus en el filtro, aunque el tamaño de poro del filtro es de 5 micras y los vibriones solo miden 0.5 a 0.8 micras de diámetro. Lo anterior podría deberse a fenómenos de adsorción por la carga neta negativa que presentan las células, proporcionada por la alta densidad de grupos fosfato que forman parte de los ácidos nucleicos dentro de las células. Los resultados preliminares de estos experimentos a partir de muestras de agua inoculadas tanto con Vibrio cholerae como con virus de vacuna de la polio, permiten asumir que este método podría ser recomendable para el monitoreo periódico de patógenos presentes en agua, reduciendo tiempo de análisis y costos de los mismos. REFERENCIAS Ramírez, V., García, J., Cortes, J.E, Sánchez, J., Bravo, L.A. y Millán, M. (1998). Adecuación y desarrollo de alternativas para el análisis de enterovirus y bacterias en aguas. Proyecto interno. Coordinación de Tratamiento y calidad del Agua. IMTA. Informe anual. MA, J. F., Naranjo, J. y Gerba, C. P. (1994). Evaluation of MK filters for recovery of enteroviruses from tap water. Appl. Environ. Microbiol. 60:1974-1977. Ramírez, V. (1998). Detección de enterovirus patógenos en aguas por metodologías de biología molecular. Coordinación de tratamiento y Calidad del Agua, IMTA. Anuario, pp 59-63. Yates, M.V. 1992. Biomonitors of Environmental Contamination. Enciclopedia de Microbiology, vol. I, Academic Press. Pag.321-330.