Estudios de Brotes la mirada desde el laboratorio
Qué es un Brote? De acuerdo al Centers for Disease Control and Prevention (CDC), es la ocurrencia de mas casos de una enfermedad de lo que normalmente se espera, en un lugar específico o un grupo de personas, durante un periodo de tiempo determinado.
Cuál es el objetivo de estudiar un brote? Identificar las causas y los factores que determinan su aparición, con el propósito de controlar y prevenir la transmisión o diseminación del agente causal de la enfermedad. Determinar la magnitud del brote Determinar las causas o factores relacionados con su inicio Eventualmente identificar la fuente Conocer las características clínico-epidemiológicas de la enfermedad Implementar medidas de control para reducir su impacto en la población Desarrollar medidas preventivas para evitar brotes futuros
Cómo se estudia un brote? Para confirmar y estudiar un posible brote es necesario diferenciar los aislamientos bajo el nivel taxonómico de especie. Las técnicas convencionales de tipificación basada en fenotipo (biotipado, perfil plasmidial, serotipificación, fagotipificación) en general no son suficientes para discriminar entre cepas que están estrechamente relacionadas. Sin embargo, con el desarrollo de nuevos métodos de tipificación moleculares basados en el ADN esto es posible: GENOTIPIFICACIÓN
La genotipificación es posible sólo si existe variabilidad genética. En las poblaciones bacterianas, cómo se origina esta variabilidad? Mutaciones, adquisición o pérdida de genes, recombinación y transferencia genética horizontal. Las bacterias poseen suficiente diversidad genética como para permitir diferenciar clones o grupos clonales, por debajo del nivel de especie.
Herramientas Moleculares de Genotipificación (HMG) Estructura poblacional (desde la estricta clonalidad à a la panmixis) Escala de tiempo y espacio del estudio Resolución de la herramienta Estabilidad del marcador genético
Criterios al elegir una HMG Tipificabilidad Reproducibilidad Poder de discriminación Estabilidad Repetibilidad Costo Según Índice de Simpson Poder Discriminatorio (PD) Idénticos Altamente relacionados Moderadamente relacionados No relacionados
Herramientas Moleculares de Genotipificación (HMG) * 1) Basadas en patrones de bandas REA / RFLP / PFGE PCR * 2) Basadas en hibridización de ADN Macroarray y microarray 3) Basadas en secuenciación Polimorfismo en ADN * El poder discriminatorio de estas metodologías es especie-dependiente.
1) HMG basadas en patrones de bandas PCR Enzimas de restricción Flujograma de los métodos de genopificación basados en patrones de bandas. Li, et al., 2009. FEMS Microbiol Rev 33:892-916
1) HMG basadas en patrones de bandas 1.1) Basadas en enzimas de restricción Restriction Enyme Analysis (REA) Restriction Fragment Lenght Polimorphism (RFLP) Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
REA Aislado 1 Aislado 2 Extracción ADN genómico 1 2 - Enzima de Restricción Gel de Agarosa +
REA Patrones restricción con Sal I de cepas de Enterococcus sp. Epidemiol Infect. 1992 Aug; 109(1): 69 80.
ADNg + Enzima Restricción RFLP - HIBRIDACIÓN (Botstein, 1980) Southern blot Hibridación
RFLP - RIBOTIPIFICACIÓN Ribotipificación Hibridación con sonda ribosomal de los patrones restricción Sal I de cepas de Enterococcus sp
Complejo Mycobacterium tuberculosis RFLP (IS6110) Gold estándar Microbiology an evolving science (9 Ed) pag. 1107
Ventajas: No requiere equipamiento costoso Repitibilidad Reproducibilidad Poder discriminatorio Existen base de datos Excelente Buena a excelente Moderado a excelente Ribobank (automatizado) Limitaciones: Requiere gran cantidad de ADNg de alta calidad Consume tiempo Es laborioso (Southern blotting) Utiliza marca radioactiva
PFGE Separa moléculas de ADN de alto peso molecular (>20 kb) Utiliza enzimas de restricción de corte infrecuente Gold estándar para muchas bacterias
La elección de la enzima de restricción es importante Se pueden combinar enzimas para la digestión Se puede concatenar resultados con enzimas diferentes
Criterios de Tenover et al., 1995: 0 son idénticas 1-3 estrechamente relacionadas 4-6 posiblemente relacionados >6 cepas no relacionadas Patrones de digestión con Xba I de diferentes cepas de Shigella sonnei (Facultad de Medicina, Universidad de Chile)
Ventajas: Repitibilidad Reproducibilidad Poder discriminatorio Existen base de datos Excelente (prot.estandarizado) Excelente (prot.estandarizado) Excelente Muchas (PulseNET, HPA, FSIS) Limitaciones: Requiere equipamiento Requiere gran cantidad de ADNg de alta calidad Consume tiempo y es laborioso (preparación de los plugs)
1) HMG basadas en patrones de bandas 1.2) PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Polymerase Chain Reaction (PCR RFLP) Ramdom Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) Repetitive extragenic palindromic PCR (REP-PCR) Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC-PCR) Variable number tandem repeat (VNTR, 16 o mas pb) Micobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU)
PCR: Amplificación del ADN 1) Denaturación 2) Hibridación 3) Extensión Protocolo no complejo Método rápido Altamente sensible (pocas células, 10 pg) Muy específico (dependiendo de los partidores)
PCR - RFLP Amplificación de una región del DNA, la cual es tratada con enzimas de restricción de corte frecuente. Sólo es necesario un gel de agarosa. Cepa 1 Cepa 2 1 2 PCR Restricción Gel de Agarosa
Ventajas: Repitibilidad Reproducibilidad Existen base de datos ADN directo desde la muestra Excelente (prot.estandarizado) Excelente (prot.estandarizado) Si Limitaciones: Moderado poder discriminatorio
RAPD (AP-PCR) (Williams, 1990 Welsh, 1990) Partidores aleatorios. No es necesario conocer la secuencia del DNA blanco. Varios amplicones, no son necesarias enzimas de restricción. Cepa 1 Cepa 2 1 2 RAPD Gel de Agarosa
Ventajas: No requiere conocer secuencia Bajo costo Poder discriminatorio Bueno, es escalable Limitaciones: Repitibilidad Moderado Reproducibilidad Moderado Existen base de datos No No puede trabajar con ADN directo desde la muestra
AFLP Ø Polimorfismo basado en la ganancia o pérdida de un sitio de restricción o bases selectivas Ø Demanda demasiada tecnología y alto costo Ø Muchos marcadores, pricipalmente dominantes Ø Más confiable que el RAPD Ø No se necesita conocer secuencia
PCR Regiones repetitivas variables (Versalovic et al, 1991) Amplificación de elementos repetitivos del cromosoide: REP-PCR, ERIC-PCR, VNTR (MLVA, multiple locus VNTR analysis), MIRU, BOX elements. REP-PCR ERIC-PCR (Demri et al, 1992) (Hulton et al, 1991) Repetitive Extragenic Palindromic (35-40 pb) Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (124-127 pb)
PCR Regiones repetitivas variables
ANÁLISIS DE RESULTADOS Comparar genotipos (REA, RFLP PCR-RFLP, RAPD, Cariotipo) entre todas las cepas. Determinar la similitud genética entre dos cepas (S AB ). S AB Coeficiente de Dice A S AB = B S AB = 2*2 / (2 + 3 + 2*2) 2n AB / (a + b + 2n AB ) S AB = 0.44
MATRIZ DE SIMILITUD Coeficiente de Dice Coeficiente de Pearson 2n AB / (a + b + 2n AB ) S AB S AB
DENDROGRAMA Análisis de agrupamiento UPGMA Neighborn Joined
PCR Regiones repetitivas variables VNTR - MVLA Variaciones en el tamaño representa un alelo diferente. A cada alelo único se le asigna un número y a cada única combinación de alelos para cada loci VNTR, se le asigna un número maestro, definido como sequence type (ST).
Minimum spaning tree analysis de Clostridium difficile por multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) Algoritmo: eburst Feil et al., J Bacteriol 2004; 186: 1518 1530. Cada tipo de MLVA se indica como un circulo (nodo o extremo de ramas), conectado por ramas. La longitud de las ramas representa la distancia genética. Se estudiaron 6 loci. Front. Microbiol, 2014 5: 1-8
2) HMG basadas en hibridización Flujograma de los métodos de genopificación basados en hibridización. Li, et al., 2009. FEMS Microbiol Rev 33:892-916
2) HMG basadas hibridización Microarray en Mycobacterium tuberculosis: Spoligotyping
Spoligotyping Repetidos directos Sondas Ventajas: Método estandarizado De amplio uso Existen base de datos Desventajas: Pobre resolución Diferentes patrones pueden excluir link Algunos patrones pueden ser no informativos
3) HMG basadas en secuenciación Flujograma de los métodos de genopificación basados en secuenciación. Li, et al., 2009. FEMS Microbiol Rev 33:892-916
3) HMG basadas en secuenciación 3.1) Multilocus Sequence Typing (MLST à MLSA) Más útil para estudios de largo plazo, por estabilidad de marcadores
3.2) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) analysis Esta herramienta diferencia cepas a través del estudio de substituciones nucleotídicas en loci específicos hipervariables dentro del genoma bacteriano. El cuadro general respecto de las relaciones entre las cepas emana de la observación de múltiples SNPs. También se definen ST. Existen Base de Datos
3.3) Secuenciación de genomas completos Secuenciación genoma completo SNP (wgsnp, cgsnp) MLST in silico (wgmlst o cgmlst)
Ventajas: Repitibilidad Reproducibilidad Poder discriminatorio Existen base de datos Excelente (prot.estandarizado) Excelente (prot.estandarizado) Muy alto Varias (en aumento) Limitaciones: Requiere equipamiento de altísimo valor No se puede realizar «in-house» Análisis bioinformático desafiante, no amigable (va mejorando) Consume tiempo, sin embargo con los equipos de nueva generación se ha acortado a unas cuantas horas No es fácil establecer puntos de corte (cepas hipermutadoras)
Poder discriminatorio métodos de secuenciación de genoma completa (SNP) en Listeria monytogenes
Características de los diferentes métodos de genotipificación
Características de los diferentes métodos de genotipificación
Microbiology. Prescott 9 Ed. Pag. 476
Epidemiología Molecular en Mycobacterium tuberculosis RFLP (IS6110) Spoligotyping MIRUs