6º FORO INTERNACIONAL DE ALIMENTOS SANOS EL USO DEL ANÁLISIS MOLECULAR COMO FORTALEZA EN LA INOCUIDAD AGROALIMENTARIA A NIVEL MUNDIAL

Transcripción

1 6º FORO INTERNACIONAL DE ALIMENTOS SANOS EL USO DEL ANÁLISIS MOLECULAR COMO FORTALEZA EN LA INOCUIDAD AGROALIMENTARIA A NIVEL MUNDIAL DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA SLP, Mayo, 2018

2 Regula los estándares sanitarios y fitosanitarios PRIORIDADES ESTRATÉGICAS SENASICA es un órgano desconcentrado de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación que: Protege contra plagas y enfermedades exóticas Lucha contra plagas y enfermedades presentes en el territorio mexicano Genera confianza en la seguridad y calidad alimentaria Promueve las exportaciones agrícolas, así como la cultura de la sanidad e inocuidad agroalimentaria

3 SENASICA Dirección General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera Dirección de Establecimientos Tipo Inspección Federal Dirección de Inocuidad Agroalimentaria, Operación Orgánica y Plaguicidas de Uso Agrícola Dirección de Bioseguridad para Organismos Genéticamente Modificados Dirección del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos Centro Nacional De Referencia para la Detección de OGM

4 CONCEPTOS BÁSICOS

5 GENOMAS BACTERIANOS Cromosoma único y circular + material extracromosómico Diversos Dinámicos (variación horizontal)

6 MUTACIONES, FUENTE DE VARIACIÓN VERTICAL Secuencia original Mutación puntual

7 QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN DE ADN? Es la determinación del orden de las bases nucleotídicas que conforman el ADN de un organismo. El orden de las notas determina la melodía El orden de las bases nucleotídicas, así como su interacción con el ambiente, determina al organismo La secuenciación representa la tecnología más relevante para el análisis de ADN. Si conocemos la secuencia de ADN de un organismo (genoma), podemos caracterizarlo, conocer toda su historia.

8 CÓMO SE VE UN GENOMA? >CP Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. P-stx-12, complete genome AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCATAACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATATCGCCAG ACATGAACAAGTTTCGGAATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGCGGGCAGATACTTTAA TATAGGAATACAAGACAGACAAATAAAAATGACAGAGTACACAACATCCATGAACCGCATCAGCAC ACCATTACCACCATCACCATTACCACAGGTAACGGTGCGGGCTGACGCGTACAGGAAACACAGAA CCCGCACCTGAACAGTGCGGGCTTTTTTTTCGACCAGAGATCACGAGGTAACAACCATGCGAGTG GTTCGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAACGTTTTCTGCGTGTTGCCGATATTCTGGAAAGCA AGGCAAGGGCAGGTAGCGACCGTACTTTCCGCCCCCGCGAAAATTACCAACCATCTGGTGGCGAT AAAAAACTATCGGCGGCCAGGATGCTTTGCCGAATATCAGCGATGCCGAACGTATTTTTTCTGACC CGCAGGACTTGCCAGCGCGCAGCCGGGATTCCCGCTTGCACGGTTGAAAATGGTTGTCGAACAA GCTCAGATCAAACATGTTTTGCATGGTATCAGCCTGCTGGGTCAGTGCCCGGATAGCATCAACGCC TGATTTGCCGTGGCGAAAAAATGTCGATCGCGATTATGGCGGGACTCCTGGAGGCGCGTGGACAT CACGGTGATCGATCCGGTAGAAAAACTGCTGGCGGTGGGCCATTACCTTGAATCTACCGTCGATAT GAATCGACTCGCCGTATCGCCGCCAGCCAGATCCCGGCCGATCACATGATCCTGATGGCGGGCTTT CCGGTAATGAAAAGGGTGAACTGGTGGTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTG CGCCTGTTTACGCGCTGACTGCTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCC CAGGTGCCGGACGCCAGGCTGTTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAGCTCTCTTACTT

9 CÓMO SE VE UN SNP (Single Nucleotide Polimorfism)? >CP Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. P-stx-12, complete genome AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCAT AACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATA TCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGA ATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAG GCGGGCAGATACTTTAACCAATATAGGAAT ACAAGACAGACAAATAAAAATGACAGAGT ACACAACATCCATGAACCGCATCAGCACC ACCACCATTACCACCATCACCATTACCACA GGTAACGGTGCGGGCTGACGCGTACAGG AAAACAGAAAAAAGCCCGCACCTGAACA GTGCGGGCTTTTTTTTCGACCAGAGATCA CGAGGTAACAACCTGCGAGTGTTGAAGTT CGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAAC GTTTTCTGCGTGTTGCCGATATTCTGGAAA >CP Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. P-stx-12, complete genome AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCAT AACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATA TCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGA ATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAG GCGGGCAGATACTTTAACCAATATAGGAAT ACAAGACAGACAAATAAAAATGACAGAGT ACACAACATCCATGAACCGCATCAGCACC ACCACCATTACCACCATCACCATTACCACA GGTAACGGTGCGGGCTGACGCGTACAGG AAAACAGAAAAAAGCCCGCACCTGAACA GTGCAGGCTTTTTTTTCGACCAGAGATCA CGAGGTAACAACCTGCGAGTGTTGAAGTT CGGCGGTACATCAGTGGCAAATGCAGAAC GTTTTCTGCGTGTTGCCGATATTCTGGAAA

10 Listeria monocytogenes, EJEMPLO DE LA APLICACIÓN DE LOS AVANCES CIENTÍFICOS-TECNOLÓGICOS EN FAVOR DE LA INOCUIDAD ALIMENTARIA CASO USA

11 Listeria monocytogenes Responsable del 19% de las muertes causadas por enfermedades transmitidas por almientos. $2.8 billones de dólares anuales. 1920: Reconocida como patógeno. Década de 1980 Reconocimiento del primer brote de origen alimentario (USA). Dr. Joseph Lister Dr. Everitt Murray Bacterium monocytogenes

12 UNA RELACIÓN DE CONOCIMIENTO MÚTUO Periodo Brotes/año Casos/año Jackson et al., 2016

13 Periodo Brotes/año Casos/año Red Pulsnet: Iniciativa de USA, laboratorios para sub-tipificación molecular. Laboratorios públicos locales, estatales y federales, coordinados por los CDC. Electroforesis en Gel de Campos Pulsados (PFGE)

14 Periodo Brotes/año Casos/año Iniciativa Listeria (a partir de un programa similar en Francia): Entrevistas a todos los pacientes con listeriosis usando un cuestionario estandarizado preguntando por >40 exposiciones a alimentos. Detección de un cluster por tipificación molecular, consulta de los datos de la Iniciativa Listeria para comparar sus exposiciones a alimentos e identificar al posible vehículo.

15 Limitantes de PFGE Periodo Brotes/año Casos/año Mutaciones, insersiones, deleciones, rearreglos, o mutaciones puntuales pueden hacer que: Aislados de Lm genéticamente relacionados tengan distintos patrones de PFGE (falsos negativos) Aislados que no están relacionados puedan parecer indistinguibles (falsos poitivos)

16 2012 RED GENOMETRAKR WGS de Lm y otros patógenos aislados de alimentos y muestras ambientales. Los laboratorios participantes comparten sus secuencias en una base de datos incluyendo metadatos mínimos. Comparación filogenética entre todas las secuencias de la base de datos.

17 2013 PROGRAMA PILOTO WGS (WHOLE GENOME SEQUENCING) CDC, FDA, USDA-FSIS (Food Safety and Inspection Service), NCBI (National Institute for Biotechnology Information). WGS en todos los aislados disponibles de Listeria monocytogenes.

18 RESOLUCIÓN ANTES Y RESPUÉS DE WGS Jackson et al., 2016

19 PFGE vs WGS

20 PUNTOS DE MEJORA DE LA WGS PARA LA INVESTIGACIÓN DE BROTES 1. Delineó brotes con patrones diversos de PFGE 2. Determinación de fuente de cold cases 3. Demostró que ciertos clusters PFGE no consistían en aislados altamente relacionados 4. Redefiniendo las definiciones de casos de brote (número de SNPs) 5. Vinculando casos aparentemente aislados a un alimento contaminado

21 . WGS: DIVERSOS ENFOQUES

22 ENFOQUE GENECÉNTRICO Esquema de tipificación a partir del MLST (7 genes) a wgmlst (4808 genes) Una diferencia de 1 a >100 SNPs se considera una diferencia alélica Software de PulsNet AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCAT AACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATA TCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGA ATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAG GCGGGCAGATACTTTAACCAATATAGGAAT ACAAGACAGACAAATAAAAATGA AGAGATTACGTCTGGTTGCAAGAGATCAT AACAGGGGAAATTGATTGAAAATAAATATA TCGCCAGCAGCACATGAACAAGTTTCGGA ATGTGATCAATTTAAAAATTTATTGACTTAG GCGGGCAGATACTTTAACCTATATAGGAAT ACAAGACAGACAAATAAAAATGA ACAGATTTCGTCTGGTTGCAAGAGACCATA ACAGGGGAAATTGATTGAAAGGAAATATAT CGCCAGCAGCACAAGAACAAGTTTCGGAAT GTGATTAATTTAAAAATTTATTGACTTAGGC GGGCAGATACTTTAACCCATAAAGGAATACA AGACAGACAAATAAAAATGA

23 SNPs Polimorfismos (diferencias) de un solo nucleótido. hqsnps. SNPs de alta calidad. Las filogenias construidas así tienen un gran nivel de detalle. Los análisis pueden ser computacionalmente muy demandantes para aun gran número de aislados. AGAGATTACGTCT GGTTGCAAGAGAT CATAACAGGGGAA ATTGATTGAAAATA AATATATCGCCAGC AGCACATGAACAA GTTTCGGAATGTG ATCAATTTAAAAAT TTATTGACTTAGGC AGAGATTACGTCT GGTTGCAAGAGAT CATAACAGGGGAA ATTCATTGAAAATA AATATATCGCCAGC AGCACATGAACAA GTTTCGGAATGTG ATCAATTTAAAAAT TTATTGACTTAGGC AGAGATTACGTCT GGTTGCAAGAGAT CATAACAGGGGAA ATTCATTGAAAATA AATATATCGCCAGC AGCACATGAACAA GTTTCGGAATGTG ATCAATTTAAAAAT TTATTGACTTAGGC AGAGATTACGTCT GGTTGCAAGAGAT CATAACAGGGGAA ATTTATTGAAAATA AATATATCGCCATT TGCACATGAACAA GTTTCGGAATGTG ATCAATTTAAAAAT TTATTGACTTAGGC

24 LA EXPERIENCIA EN MÉXICO

25 : Creación del Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos Patógenos Implementación de técnicas confirmatorias, pruebas bioquímicas y campos pulsados.

26 2014 MÉXICO FORMA PARTE DE LA RED PULSNET DE LATINOAMÉRICA Y EL CARIBE MISIÓN: Mantener red de laboratorios que utilicen métodos normalizados de genotipificación y compartir información inmediatamente con fin de mejorar vigilancia y alertar prontamente de brotes de enfermedades transmitidos por agua y alimentos.

27 UNIDAD DE SECUENCIACIÓN Y BIOINFORMÁTICA. En 2010 fue establecido el Centro Nacional de Referencia en Detección de Organismos Genéticamente Modificados (CNRDOGM) en Tecámac, Estado de México. Objetivo inicial. Detección, identificación, cuantificación y secuenciación de OGMs. 2013: Comienza el trabajo con bacterias

28 CAPACIDAD ANALÍTICA POR PLATAFORMA DE SECUENCIACIÓN FLX 2012 Ion Torrent 2015 MiSeq 2016 NextSeq a 4 muestras 1 a 8 muestras 20 a 32 muestras 120 a 176 muestras Las mejoras tecnológicas y la automatización han aumentado la capacidad analítica de las plataformas de secuenciación, la cantidad y calidad de los datos generados.

29 La secuenciación de genoma completo (WGS) es un procedimiento de laboratorio que permite determinar el orden de las bases en el genoma completo de un organismo, en un solo proceso.

30 CAPACIDAD ANALÍTICA. SECUENCIACIÓN Se incrementó 70 veces la capacidad analítica entre cepas (LDDOP) cepas (LDDOP, CCAyAC, UNAM) cepas (LDDOP, CCAyAC, UAS, UNAM, GMI) cepas (LDDOP, CCAyAC, GMI, CENAM, DGSA) cepas (LDDOP, CCAyAC, EQAS, GMI ENCB,DGSA)

31 2017 AÑO DE LA PRIMER RESOLUCIÓN DE CONTROVERSIA COMERCIAL EMPLEANDO WGS

32 ANÁLISIS DESARROLLADOS POR LA SSB (ALERTA DE PAPAYAS, 2017) Se analizaron 91 muestras totales de Salmonella relacionadas con el brote de Julio: WGS y Análisis bioinformáticos 28 aislados mexicanos del Programa de seguimiento de atención de alertas sanitarias en materia de inocuidad agroalimentaria Muestras de otras instituciones p. Ej. InDRE. Análisis bioinformático 63 aislados (WGS) proporcionados por CDC entre el 27 de Julio y 9 de Agosto de 2017

33 ESTRATEGIA GENERAL WGS o descarga de secuencias de CDC Filtrado por calidad (secuencias) Serotipificación MLST (SeqSero/SRST2) Construcción de árboles filogenéticos con genoma completo (Realphy) Análisis de hqsnps mediante el Pipeline de los CDC (LyveSet) Interpretación de los resultados, elaboración de informes

34 FILOGENIA, hqsnps Lyve-Set: Pipeline para hq-snps empleado por CDC 39 SNP 1 SNP 2 SNP 3 SNP 31 SNP 47 SNP CDC outbreak Isolates SENASICA outbreak Isolates SENASICA normal surveillance Isolates

35 FILOGENIA, hqsnps CDC outbreak Isolates SENASICA outbreak Isolates

36 2018 AÑO DE LA INCORPORACIÓN DEL SENASICA A LA RED GENOMETRAKR

37

38 PROYECTO DE COLABORACIÓN GENÓMICA Y FILOGEOGRAFÍA DE Salmonella EN MÉXICO

39 GENÓMICA Y FILOGEOGRAFÍA DE SALMONELLA EN MÉXICO 1783 aislados de Salmonella recibidos Año aislados de Salmonella secuenciados

40 75 SEROTIPOS IDENTIFICADOS

41 6260 GENES IDENTIFICADOS 594 CEPAS POTENCIALMENTE MULTIRESISTENTES

42 ANÁLISIS FILOGENÉTICOS. EJ. Salmonella Agona

43 CONCLUSIONES La brecha tecnológica con el mundo es cada vez más estrecha SENASICA : Apuesta a la transparencia Comprende la necesidad de compartir información en tiempo real Trabaja con equipos interdisciplinarios Establece colaboraciones interinstitucionales Tiene instalaciones de punta para el Wet lab Dry Lab Desarrolla Bases de Datos, la información es oro

44 MÉXICO PRÓSPERO PARA TODOS THANKS FOR YOUR ATTENTION senasica.gob.mx