ESTUDIOS DE BIOPROSPECCION DEL CORAL BLANDO Pseudopterogorgia elisabethae COMO FUENTE DE SUSTANCIAS ANTIINFLAMATORIAS, ANALGÉSICAS Y CITOTÓXICAS HEBELIN CORREA VELANDIA Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de Magíster en Ciencias- Química. Directora Dra. Carmenza Duque Beltrán Profesora Emérita Departamento de Química. Universidad Nacional de Colombia. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO EN QUÍMICA 2007
RESUMEN A partir del extracto CH 2 Cl 2 /MeOH (1:1) de Pseudopterogorgia elisabethae de las Islas de Providencia (quimiotipo 1) y de San Andrés (quimiotipo 2) se logró el aislamiento por métodos cromatográficos y la identificación por métodos espectroscópicos y de transformación química por primera vez en el quimiotipo 1 de los compuestos conocidos 3-O-acetil-pseudopterosina U (1), amfilectosina A (2) y B (3) y del compuesto nuevo la seco-pseudopterosina K (4); además se aislaron las pseudopterosinas G, K, P, Q, S, T y U anteriormente identificadas en trabajos de nuestro grupo de investigación. En el quimiotipo 2 se encontraron otros dos nuevos compuestos en la naturaleza a los cuales denominamos elisabetatrienol (5) y amfilecta-8(13),11,14-trieno-9,10-diona (6), junto con la mezcla en equilibrio de los dos diterpenos 10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14- tetraeno y 9-acetoxi-10-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno, aislada también en trabajos previos de nuestro grupo. El elisabetatrienol puede ser considerado como un intermediario biosintetico de las pseudopterosinas En el proceso de evaluación de la actividad antiinflamatoria in vivo por el ensayo de edema auricular inducido por TPA, se observó que las fracciones del quimiotipo 1, la enriquecida en las PsG, K, P y T, las seco-psj y K y las amfilectosinas A y B, y la enriquecida en las PsQ,S y U presentaron una mayor actividad que la fracción del quimiotipo 2 que contenía la mezcla en equilibrio de los dos diterpenos monoacetilados 10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno y 9-acetoxi-10-hidroxi-amfilecta- 8,10,12,14-tetraeno. En contraste en el ensayo in vitro de inhibición de liberación de MPO, se encontró que la fracción mencionada del quimiotipo 2 fue la más activa lo cual sugiere para los componentes de esta fracción una potente actividad en la inhibición de la desgranulación leucocitaria. Adicionalmente, en este mismo ensayo con compuestos puros, se observó que las pseudopterosinas con el azúcar acetilado PsQ, S y U fueron más potentes en comparación a las pseudopterosinas con el azúcar no acetilado (PsG, K, P y T) y que la seco-pseudopterosina K. En el ensayo de inhibición de la liberación de NO in vitro, la fracción enriquecida en las PsG, K, P y T, las seco-psj y K y las amfilectosinas A y B, y la enriquecida en las PsQ,S y
U, provenientes del quimiotipo 1 presentaron mayor actividad que la fracción que contenía los dos diterpenos monoacetilados 10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno y 9- acetoxi-10-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno, proveniente del quimiotipo 2, sin embargo, al aumentar las dosis de las fracciones provenientes del quimiotipo 1, estas fueron citotóxicas. De igual forma, se determinó que las PsT y P fueron las más potentes en este ensayo seguidas de las pseudopterosinas con el azúcar acetilada PsQ, S y U, y por último las de menor potencia PsG y K; logrando establecer mediante el ensayo de captación de NO que la actividad de las PsG y P, se debe posiblemente a la supresión directa o indirecta en la expresión o desactivación de la inos más no por acción captadora, en comparación con las pseudopterosinas con el azúcar acetilada PsQ, S y U, las cuales si presentaron una buena capacidad de captación de radicales libres. Por último, se determinó la actividad citotóxica contra cinco líneas tumorales: HEp-2 (carcinoma de laringe), MKN-45 (carcinoma de estomago), HT-29 (adenocarcinoma de colon), MCF-7 (adenocarcinoma de mama) y HeLa (carcinoma de cervix) y dos cultivos de fibroblastos normales Fib 04 (epitelio bucal humano) y Fib 05 (tejido de cordón umbilical humano), encontrando para todos los extractos, fracciones y compuestos de los dos quimiotipos de P. elisabethae ensayados, una actividad citotóxica promisoria. La mayor actividad citotóxica la presentaron la PsQ y Py la seco-psk seguidas de las PsK y U, sin embargo, fue la seco-psk el compuesto más activo. Además se encontró que para las PsP, Q y U y la seco-psk una mayor selectividad hacia las células tumorales. Los resultados obtenidos permitieron relacionar estructura vs. actividad, así, los compuestos glicosidados exhibieron una mayor actividad citotóxica, siendo más potentes los glicosidados con fucosa, además la presencia de grupos acetilo en la posición C-4 en la unidad de azúcar causa un incremento en la actividad.
4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Se logró el aislamiento por primera vez por técnicas cromatográficas y la identificación por métodos espectroscópicos (UV, EM y RMN 1 H y 13 C mono-y bidimensional) de especímenes de Pseudopterogorgia elisabethae de la Isla de Providencia (quimiotipo 1) de los compuestos conocidos 3-O-acetil-pseudopterosina U (1), amfilectosina A (2) y B (3) y del nuevo compuesto la seco-pseudopterosina K (4). También fueron aislados e identificados los compuestos conocidos pseudopterosinas G, K, P, Q, S, T y U. Se logró el aislamiento por primera vez por técnicas cromatográficos, y la identificación mediante métodos espectroscópicos (UV, EM y RMN 1 H y 13 C mono-y bidimensional) y métodos de transformación química de especímenes de Pseudopterogorgia elisabethae de la Isla de San Andrés (quimiotipo 2) de los compuestos nuevos elisabetatrienol (5) el cual podría ser considerado como un intermediario biosintetico de las pseudopterosinas y amfilecta-8(13),11,14-trieno-9,10-diona (6). También fue asilada e identificada la mezcla en equilibrio de 10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno y 9-acetoxi-10-hidroxiamfilecta-8,10,12,14-tetraeno. La determinación de la actividad antiinflamatoria in vivo de los extractos y fracciones provenientes de los dos quimiotipos de P.elisabethae, empleando el ensayo de edema auricular inducido por TPA mostró para la fracción enriquecida con las PsQ,S y U y la enriquecida en las PsG, K, P y T, las seco-psj y K y las amfilectosinas A y B, del quimiotipo 1, una inhibición significativa de la inflamación (mayor al 60%), y para la mezcla en equilibrio de los dos diterpenos monoacetilados del quimiotipo 2 una inhibición de la inflamación del 40%, lo cual dio paso al inicio de investigaciones más a especificas de actividad antiinflamatoria de los compuestos presentes en estas fracciones. La determinación de la actividad antiinflamatoria en el modelo in vitro sobre neutrófilos humanos activados con el ionóforo de calcio A23187 permite concluir que el extracto y mezcla B2 (10-acetoxi-9-hidroxi-amfilecta-8,10,12,14-tetraeno y 9-acetoxi-10-hidroxiamfilecta-8,10,12,14-tetraeno) del quimiotipo 2 presentan una potente inhibición del proceso de desgranulación leucocitaria debido a que fueron capaces de inhibir considerablemente (alrededor del 90%) los niveles de MPO en comparación con las
fracciones del quimiotipo 1 (alrededor del 45%). También se puede concluir de acuerdo a los resultados obtenidos en el modelo in vitro sobre neutrófilos humanos activados y en el modelo in vivo (determinación de MPO en exudados de las orejas) que uno de los mecanismos involucrados en la actividad antiinflamatoria de las pseudopterosinas y seco-pseudopterosinas es controlando el proceso de desgranulación leucocitaria. En este proceso los compuestos con mayor actividad fueron las pseudopterosinas T, U, Q y S. Los resultados de la evaluación antiinflamatoria en el modelo in vitro sobre neutrófilos humanos activados, permiten concluir una relación directa estructura actividad, encontrándose que las pseudopterosinas glicosidadas con fucosa acetilada presentan mayor actividad, encontrandose que es mayor la actividad cuando se acetilada en el C-4. A partir de los resultados del ensayo in vitro de liberación de NO se puede concluir que dentro del grupo de las pseudopterosinas, las PsT y P fueron las más activas seguidas de las pseudopterosinas con el azúcar acetilado PsQ, S y U, y por último las PsG y K. También se pudo concluir mediante el ensayo de captación de NO que la actividad de las PsG y P, se debe en principio a la supresión directa o indirecta en la expresión o desactivación de la inos más no por acción captadora, en contraste las pseudopterosinas con el azúcar acetilado PsQ, S y U, si presentaron una buena capacidad de captación de radicales libres, sugiriendo un posible efecto antioxidante por parte de estas.. Con el estudio de la actividad antiinflamatoria realizado en este trabajo se dio inicio a la comprensión de los posibles mecanismos de acción de las pseudopterosinas, secopseudopterosinas y diterpenos no glicosidados en la respuesta inflamatoria, por esta razón se recomienda evaluar otros mecanismos de acción antiinflamatorios, para llegar a comprender de manera más general, cual o cuales son los mecanismos de acción que estos compuestos emplean en la respuesta antiinflamatoria que producen y su grado de especificidad. En la evaluación de la actividad analgésica de placa caliente la fracción enriquecida en las PsQ, S y U y la enriquecida en las PsG, K, P y T, las seco-psj y K y las amfilectosinas A y B, del quimiotipo 1 no presentaron actividad considerable, sin embargo, no se puede
descartar que estos compuestos pueden tener un efecto analgésico por otra vía más propia del sistema nervioso autónomo. En el estudio de citotoxicidad en líneas tumorales (HEp-2, MKN-45, HT-29, MCF-7 y HeLa), se encontró que la PsQ y P y la seco-psk fueron los compuestos que mayor actividad citotóxica presentaron, seguidos de las PsK y U, sin embargo, fue la seco-psk el compuesto de mayor potencia debido a que indujo un la muerte celular a una concentración de 0.5 μg/ml (1.0 μm). Se encontró que las PsP, Q y U y la seco-psk tienen mayor selectividad hacia las células tumorales (HEp-2, MKN-45, HT-29, MCF-7 y HeLa), razón por la cual consideran dentro del grupo de compuestos estudiados los de actividad citotóxica más promisoria por ser potentes y además selectivos entre células normales y tumorales. Los resultados de la evaluación citotóxica también permite concluir una relación directa estructura actividad, encontrándose que los compuestos glicosidados tienen una mayor actividad citotóxica, siendo más potentes los glicosidados con fucosa. Adicionalmente se encontró que la presencia de grupos acetilos en el C-4 de la unidad de azúcar causa un incremento en la actividad. Con el fin de continuar con el estudio de la actividad de estos compuestos se sugiere realizar valoraciones complementarias para acercarnos al entendimiento del mecanismo de acción de estos compuestos como agentes antitumorales. Se recomienda también evaluar otros mediadores químicos de inflamación como TNF-α o algunas enzimas por ejemplo COX-2 y LPO-5 para los cuales se ha encontrado una relación directa con procesos de tumorogénesis. En conclusión, este trabajo mostró que el gorgónido Pseudopterogorgia elisabethae del archipiélago de San Andrés y Providencia es un recurso altamente promisorio como fuente de nuevos compuestos químicos con actividad antiinflamatoria y citotóxica, por lo cual se recomienda desarrollar métodos alternativos para la obtención de estos compuestos y de esta manera obtener cantidades considerables que nos permitan suplir los requerimientos para complementar los estudios de actividad biológica, y posteriormente la demanda de la industria farmacéutica y cosmética.