OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Transcripción

1 Identificación de Begomovirus y Curtovirus que afectan al cultivo de chile y cultivos adyacentes en el Estado de Zacatecas: bases para la prevención de enfermedades virales mediante el desarrollo de nuevas técnicas moleculares. INTRODUCCIÓN. Entre los factores que limitan la productividad agrícola figuran las enfermedades producidas por microorganismos como bacterias, fitoplasmas, hongos y virus. En los últimos años la Universidad Autónoma de Zacatecas (UAZ) y el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) campus Zacatecas han realizado estudios en su mayoría orientados a obtener información relativa a la incidencia y naturaleza de las enfermedades de origen bacteriano y fúngico que se presentan en sus áreas agrícolas. Sin embargo, poco se ha hecho a la fecha en relación a las enfermedades causadas por virus, que son consideradas a nivel mundial entre las más destructivas y económicamente importantes. De hecho, los datos publicados sobre virus aislados en el estado de Zacatecas son escasos y manejados desde un punto de vista muy general, sin establecer los verdaderos agentes etiológicos para enfermedades que se presumen de origen viral. En el presente proyecto nos proponemos aislar, identificar y clasificar algunos de los agentes virales que causan, con mayor frecuencia, enfermedades en los cultivos de chile presentes en el Estado. Para ello utilizaremos un conjunto de técnicas de biología molecular que se utilizan en los Laboratorios de Fitopatología con tecnología de punta, que son muy efectivas para el diagnóstico y la caracterización de virus de plantas. Estas técnicas presentan múltiples ventajas sobre los métodos tradicionales de identificación de virus, que implican una serie de pruebas biológicas tales como la inoculación o transmisión del patógeno por injertos o insectos vectores, a una serie de huéspedes diferenciales, y la observación de síntomas que aparecen en los mismos, proceso que ocupa por lo general varias semanas. Las técnicas moleculares tienen el potencial de reducir el tiempo requerido para la identificación de un virus a la escala de días o aún de horas, y su precisión suele ser muy alta. La estrategia general que seguiremos en la primera parte del estudio consiste en la inspección periódica de campos agrícolas presentes en municipios del Norte, Centro y Sur del estado de Zacatecas a fin de detectar plantas con síntomas de virosis y campos infestados con insectos transmisores tanto de Begomovirus como Curtovirus (mosquita blanca y chicharritas, respectivamente). Se colectarán muestras de tejido de las plantas de chile y malezas asociadas sintomáticas y no sintomáticas, y se capturarán insectos vectores presentes en los campos, para analizarlos posteriormente por medio de técnicas de amplificación del ADN viral (por ejemplo, Reacción en cadena de la polimerasa y reacción de amplificación isotérmica por círculo rodante). En algunos casos se secuenciará el ADN amplificado a fin de establecer de modo inequívoco la identidad del agente viral. La presencia de plantas infectadas sin síntomas nos indicara algún tipo de resistencia a padecer la enfermedad. Los datos recabados en las diversas áreas agrícolas del Estado serán organizados e integrados para ofrecer un panorama de la problemática

2 asociada a las enfermedades producidas por Begomovirus y Curtovirus, y se relacionarán con la información existente para los Estados vecinos, algunos de ellos mejor estudiados al respecto (v.gr: San Luis Potosí, Jalisco y Nuevo León). El proyecto contempla también el desarrollo de innovaciones a las técnicas de diagnóstico molecular de Begomovirus y Curtovirus, a fin de disminuir el tiempo y los costos del proceso de detección del agente infeccioso. Para ello utilizaremos un conjunto de oligonucleótidos sintéticos que hemos diseñado en la Unidad de Agronomía de la UAZ en colaboración con el Dr. Gerardo Arguello Astorga del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A. C. (IPICYT) y que funcionan como iniciadores en reacciones que permiten amplificar el DNA de geminivirus específicos; Estos iniciadores se han probado en muestras de campo, con éxito. Exploraremos varias estrategias con combinaciones de dos clases de reacciones de amplificación del DNA: la Reacción de Polimerización en Cadena, y la Amplificación Isotérmica por Círculo Rodante, tratando de determinar los esquemas más eficaces y económicos para la identificación de ciertos virus. Finalmente, elaboraremos un sistema de detección e identificación de DNA para virus específicos basado en la técnica de RFLPS (Restriction Fragment Length Polymorphisms) enfocado a la presencia y análisis de polimorfismos dentro de una población de clonas obtenidas a partir del uso de iniciadores idénticos, lo que constituiría un método de extraordinaria rapidez y muy económico para la identificación de virus frecuentemente encontrados en los campos de producción comercial del Estado. OBJETIVO GENERAL. Nuestro propósito es identificar, por métodos de biología molecular, algunos de los Begomovirus y Curtovirus que causan con mayor frecuencia enfermedades a los cultivos chile y cultivos adyacentes en las principales áreas de siembra presentes en el Estado de Zacatecas., a fin de colocar sobre una base sólida el diseño de estrategias para prevenir y controlar las epidemias agrícolas ( epifitías ) de origen viral, a través del diagnóstico oportuno, el control de los insectos vectores, y la reducción de los factores que favorecen la dispersión de los virus. Esto tendría un impacto sobre la productividad de los cultivos, al disminuir de manera muy significativa las pérdidas asociadas a las enfermedades. En paralelo con los estudios de campo y el análisis de las muestras por métodos moleculares convencionales, pretendemos explorar nuevos enfoques para realizar el diagnóstico de enfermedades causadas por Begomovirus y Curtovirus, de manera más rápida, precisa y a menor costo para los productores agrícolas. Esto último implicará el examen experimental de diversos esquemas que combinen técnicas de amplificación de DNA basadas tanto en la PCR como en la tecnología de amplificación isotérmica por círculo rodante (RCA); también refinaremos técnicamente una nueva estrategia que estamos desarrollando para la identificación por PCR de múltiples virus a partir de muestras que incluyen varios insectos individuales, el cual se acopla a una

3 segunda fase en la que se analizan los diferentes productos de amplificación por RFLPs ( Restriction Fragment Length Polymorphisms ) para determinar la existencia de virus diferentes en la muestra compleja. Y así establecer un panorama general de la capacidad virulifera de los vectores. OBJETIVOS ESPECIFICOS. 1.- Aislar y caracterizar molecularmente begomovirus a partir de plantas de Chile y cultivos adyacentes presentes dentro de las principales zonas productoras del Estado de Zacatecas. 2.-Aislar y caracterizar curtovirus presentes en las áreas agrícolas de las Zonas antes mencionadas. 3.- Colectar insectos vectores (chicharritas y mosquitas blancas) de campos específicos, y a partir de extractos de DNA total determinar la diversidad de begomovirus o curtovirus potencialmente transmisibles a los cultivos. 4.- Establecer un mapa preliminar de distribución de los virus identificados en el Estado, y relacionarlo con datos fitopatológicos de los Estados vecinos a fin de definir áreas geográficas con elevada probabilidad de emergencia de enfermedades específicas. 5.- Desarrollar métodos moleculares más sensibles, rápidos, precisos y económicos para la detección de begomovirus y curtovirus, basados en la combinación de dos métodos de amplificación de DNA viral (PCR y RCA) con la técnica de RFLPs y así demostrar de modo experimental su mayor eficiencia respecto a métodos análogos actualmente en boga.

4 RESULTADOS ESPERADOS. Los resultados que se espera obtener en el presente proyecto incluyen los siguientes: 1) Presentar datos detallados y precisos sobre las diversas especies de begomovirus (geminivirus transmitidos por la mosquita blanca, Bemisia tabaci) que se encuentran en las áreas agrícolas del Estado, y su distribución en las principales zonas productoras de chile. 2) Información basada en secuencias de DNA, sobre las especies y variantes de curtovirus (geminivirus transmitidos por la chicharrita Circulifer tenellus) presentes en Zacatecas. Estos virus han sido descubiertos muy recientemente en México, y solo se conocen dos tipos de aislados. Uno de ellos se encontró en cultivos de chile, en Zacatecas, pero no se ha caracterizado todavía a nivel genómico ya que la secuencia viral respectiva no se conoce (Velásquez-Valle, 2008). Otros curtovirus (tres variantes de una misma especie, Beet mild curly top virus-mexico) fueron aislados por el grupo del Dr. Gerardo Arguello de IPICYT, en el 2007 (Mauricio-Castillo, 2011: Tesis Doctoral IPICYT), a partir de plantas de chile en la región agrícola de Villa de Arista, S.L.P. Debido a la similitud en las condiciones climáticas y las variedades cultivadas tanto en el altiplano Potosino como el Zacatecano anticipamos la existencia de varias especies de estos virus en el Estado de Zacatecas. 3) Generación de un banco de datos con las secuencias nucleotídicas de los diversos aislados virales encontrados en este estudio, para su uso por otros especialistas. 4) Un análisis integrado de la diversidad y distribución de los virus identificados, con recomendaciones técnicas útiles para las diversas Asociaciones de Agricultores del Estado, así como para informar y apoyar la toma de decisiones en torno a la problemática del manejo de plantas infectadas. 5) En el rubro de formación de recursos humanos, se espera al término del primer año de vigencia del proyecto, haber graduado a 1 estudiante de licenciatura y capacitar en las técnicas de biología molecular al menos un prestador de servicio social. 6) Generar al menos una publicación en revista indexada de circulación internacional y una publicación en revista perteneciente al padrón del CONACYT, en

5 las que se reporte la caracterización filogenética y/o molecular de nuevas especies o variantes de Begomovirus y/o Curtovirus, diferentes a las reportadas. 7) Elaboración de folletos de información en los que se ofrezcan recomendaciones para la prevención y/o el control de algunas de las enfermedades virales más comunes en los campos o invernaderos, los que estarán dirigidos a los productores agrícolas y al personal técnico encargado de la sanidad de los cultivos. ANTECEDENTES El cultivo de Chile es una de las actividades agrícolas de mayor importancia económica en México, que genera numerosos empleos y hace posible una significativa captación de divisas por la exportación de sus productos. En nuestro país el estado de Zacatecas destaca como el principal productor de chile seco con 57mil toneladas anuales. La producción de chile como en la mayoría de los cultivos está sujeta a diversos factores que pueden limitarla significativamente, entre los que destacan las enfermedades agrícolas causadas por hongos, nemátodos, fitoplasmas, bacterias y virus. Estos últimos han adquirido una importancia mayor a nivel mundial en los últimos 25 años, con la emergencia de enfermedades epidémicas que parecen estar asociadas a varias causas, entre ellas la expansión geográfica de las poblaciones de insectos vectores, la aparición de virus más agresivos derivados de eventos de recombinación genética, el mal manejo de materia vegetal infectada y su libre paso a través de nuestro país, y las condiciones favorables a la dispersión de los patógenos creadas por los extensos monocultivos que son comunes en la agricultura moderna (Rojas et al., 1997,1999; Rojas et al; 2005; Sanz et al., 2000). Los virus fitopatógenos con genomas compuestos de acido desoxirribonucleico (ADN) se dividen en dos grupos: lo que contienen DNA circular de doble cadena, como los caulimovirus y badnavirus, y que replican su genoma utilizando un mecanismo que involucra intermediarios de ARN (Acido ribonucleico) y transcripción reversa para ( para-retrovirus ), y los que contienen ADN circular de cadena sencilla, y que se replican por un mecanismo de circulo rodante, como los nanovirus (Gronenborn et al.,2002) y los geminivirus (Saunders et al.,1991)las enfermedades virales ocasionan pérdidas económicas extraordinarias en todo el orbe. Un ejemplo reciente de epidemia agrícola a gran escala ( pandemia ) es la enfermedad de los cultivos de la yuca o mandioca en el continente africano, causada por un complejo de especies de begomovirus, que ha ocasionado pérdidas estimadas en más

6 de 2,000 millones de dólares anuales a lo largo de casi una década (Harrison et al.,1997ª, Pita et al.,2001)).en nuestro país a pesar de que las mermas causadas en la agricultura por los Begomovirus y Curtovirus son altas no han sido objeto de estudios sistemáticos, de modo que no hay estimados de los daños económicos (Monreal-Vargas, 2005). Las infecciones virales en las plantas se caracterizan por síntomas que incluyen enanismo, hojas con mosaicos, lesiones cloróticas o necróticas, estrías, amarillamiento de las nervaduras, enrollamiento y curvatura foliar, deformación y/o decoloración del fruto, aborto de la flor o el fruto. Estos síntomas conllevan a una reducción de la calidad y rendimiento de los cultivos, y en ocasiones provocan la pérdida total de las cosechas. Las enfermedades virales de las plantas no pueden ser curadas, pues no existen compuestos antivirales capaces de eliminar una infección una vez iniciada (Hull et al., 2001). Por esta razón, es necesario utilizar medidas de control eficientes para reducir o prevenir la ocurrencia de infecciones. El primer paso requerido para el control de las enfermedades virales es la identificación del virus, ya que la estrategia de manejo subsiguiente dependerá de cómo ese virus en particular es transmitido entre las plantas de un mismo cultivo, y de cómo el virus sobrevive en ausencia del mismo. Las medidas preventivas incluyen el uso de órganos vegetativos certificados libres de virus, la eliminación de los posibles reservorios del virus en las malezas asociadas, y la modificación de prácticas de siembra y cosecha. Si el virus tiene un vector de transmisión conocido, el control o exclusión del vector es sumamente importante. Los métodos tradicionales para lograr la identificación de un virus se basan en sus propiedades biológicas, tales como su capacidad para infectar ciertas especies vegetales, y la producción de síntomas distintivos en huéspedes específicos. La transmisibilidad del virus por medios mecánicos o por injertos es también un criterio útil en su identificación, y en el caso de virus que se transmiten por vectores biológicos la identificación de los mismos proporciona información relevante para el diagnóstico. Aunque estos procedimientos son altamente confiables, tienen la grave desventaja de requerir varias semanas para su completa realización. Consecuentemente, se han desarrollado otros métodos de diagnóstico basados en principios diferentes, los cuales producen resultados en períodos de tiempo menores, usualmente de unas pocas horas. Entre tales métodos destacan las técnicas inmunológicas, que se basan en la identificación de un virus a través de la reacción de sus proteínas constituyentes con anticuerpos específicos. El ensayo de inmunoabsorción de enzima ligada, o ELISA ( Enzyme-linked immunoabsorbent assay ) es la técnica inmunológica más utilizada hoy en día para la identificación de virus de plantas (Hull et al., 2001; Carter., 2007).

7 El segundo grupo de métodos diagnósticos rápidos está basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction ) que es una técnica muy sensible y específica para la detección de virus, fundamentada en la presencia de secuencias únicas en el ácido nucleído del genoma de cada virus. La generación de un producto de la PCR del tamaño esperado indica la presencia del virus para el cual los iniciadores de DNA fueron diseñados (Brown et al., 2001; Rojas et al., 1993; Wyatt y Brown et al., 1996). Los estudios sobre enfermedades virales en el Estado de Zacatecas han sido escasos y esporádicos, y por más de 15 años se han realizado casi exclusivamente, con recursos limitados, en los laboratorios de Fitopatología tanto del INIFAP campus Zacatecas como en la Facultad de Agronomía de la UAZ. Utilizando los métodos de identificación de virus basados en pruebas biológicas, se han detectado algunos begomovirus en cultivos de chile y frijol de diversas áreas del Estado. A partir del 2008, utilizando métodos moleculares de diagnóstico se logro amplificar por PCR el genoma de una nueva variante de curtovirus perteneciente a la especie Beet Mild Curly Top Virus (BCTV; Velásquez, 2008). Las técnicas basadas en la PCR son especialmente apropiadas para la identificación de virus con genomas de ADN, como los geminivirus. Estos virus conforman una familia altamente diversificada de patógenos de plantas, que causan enfermedades devastadoras en una amplia gama de cultivos agrícolas en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo (Brown, 1997; Morales y Anderson, 2001). La familia Geminiviridae se subdivide en cuatro géneros, de los cuales 2 se encuentran representados en México. Los Begomovirus se caracterizan por infectar plantas dicotiledóneas y ser transmitidos por la mosquita blanca (Bemisia tabaci Genn.) (Brown, 1997), en tanto que los Curtovirus, que también infectan plantas dicotiledóneas, son transmitidos por otro vector, la chicharrita Circulifer tenellus (Fauquet et al., 2008). En México los begomovirus son abundantes y diversos (cerca de 20 especies descritas) y han emergido como patógenos muy importantes a partir de los 90 s. (Morales, 2006; Fauquet et al., 2008). Entre los begomovirus del continente americano se distinguen dos subgrupos, uno relativamente pequeño pero económicamente importante, denominado linaje del SLCV, y el más extenso y diverso linaje de los begomovirus típicos. Los miembros del primer subgrupo se encuentran distribuidos en Norteamérica y Mesoamérica, y se distinguen por las características atípicas del dominio 1-40 de la proteína iniciadora de la replicación (Rep) y por el numero y arreglo de sus iterones que son secuencias repetidas de 4 a 6 nucleótidos y que constituyen el sitio de unión de la proteína de replicación al ADN viral e iniciar la replicación del mismo.

8 Con respecto a los curtovirus hasta la fecha el ICTV (Comité internacional para la taxonomía de virus, por sus siglas en ingles) reconocen solo 7 especies pertenecientes a este género todas ellas aisladas en el sur de los Estados Unidos, donde infectan a un amplio rango de cultivos de interés económico incluyendo chile. A pesar de la proximidad del área de distribución conocida de los curtovirus con nuestro país, hasta que en el 2008 no se había aislado ningún virus de este grupo en territorio mexicano, hasta que en el 2008 se publico el primer reporte de un curtovirus infectando chile en Zacatecas, México (Velásquez, 2008). Al mismo tiempo, el grupo del doctor Gerardo Arguello de IPICYT en San Luis Potosí logro aislar de plantas de chile en Villa de Arista tres curtovirus que pertenecen a la misma especie, Beet mild curly top virus- Mexico; Con base a lo anterior y a la similitud que existe en cuanto a variedades de chile cultivadas y condiciones climáticas puede anticiparse que existen otras especies de begomovirus y curtovirus en el territorio Zacatecano, pues las poblaciones del insecto vector llegan a ser considerables en ciertas áreas agrícolas. Justificación Los cultivos de chile representan una parte importante de la agricultura en el Estado de Zacatecas. Estos cultivos están expuestos a enfermedades virales muy diversas, las cuales impactan negativamente la productividad de los campos e invernaderos comerciales, y afectan la economía de los productores. Pese a su importancia y a su incidencia relativamente alta en ciertas regiones agrícolas del Estado, a la fecha se conoce muy poco de los virus que comúnmente afectan cultivos como el chile, el tomate, el frijol, y otras hortalizas cultivadas en Zacatecas, provocando pérdidas económicas grandes pero de las que no se tienen ningún estimado al presente. Toda estrategia de control y prevención de infecciones virales depende de conocer la identidad de los virus causantes de una enfermedad específica, pues el modo de transmisión y dispersión del patógeno es un dato clave para implementar las medidas que puedan atenuar o evitar, de manera efectiva, los daños a los cultivos amenazados por la enfermedad. Con este proyecto orientado a la identificación por técnicas moleculares de virus de importancia agrícola, nos proponemos sentar sobre bases sólidas, un programa de investigación a mediano y largo plazo para tener una idea más clara y completa de la diversidad de virus y organismos transmisores de virus de plantas en el territorio estatal, que habrá de servir como fundamento para el diseño de estrategias racionales por parte de las instituciones estatales y federales competentes, a efecto de disminuir la emergencia de epidemias agrícolas o los daños a los cultivos que empiezan a dar señales de estar infectados.

9 Por otra parte, y como añadido importante del proyecto global, nos proponemos utilizar una variedad de técnicas diagnósticas rápidas y basadas en la PCR, a efecto de comparar su sensibilidad y precisión con las usadas tradicionalmente, lo mismo que su costo relativo y requerimiento de equipo especializado. Algunas de las técnicas diagnósticas que usaremos presuponen el uso coordinado de kits comerciales en combinación con las técnicas moleculares diseñadas y probadas con éxito por nuestro grupo de trabajo, como lo atestigua el hecho de que en los últimos tres años se han descrito numerosas especies y variantes nuevas de begomovirus y curtovirus presentes en diversas regiones del territorio mexicano e incluso de EUA (New Mexico, Yucatán, Morelos, Guerrero, Sinaloa, Jalisco, Colima y San Luis Potosí). Los virus en cuestión son, además de los 6 mencionados para el Estado de S.L.P. en la sección de Antecedentes, los siguientes 10 virus: Begomovirus: Okra yellow mosaic Mexico virus (OkYMMV), Rhynchosia mosaic Sinaloa virus (RhMSinV), Sida mosaic Sinaloa virus (SiMSinV), Chino del tomate virus-soybean (CdTV-Soybean), Rhynchosia golden mosaic virus-sinaloa (RhGMV-Sinaloa), Rhynchosia golden mosaic virus- Soybean (RhGMV-Sinaloa), Capraria mosaic virus (CMV), Euphorbia mosaic virus- Jalisco (EuMV-Jal), Jacquemontia mosaic virus (JqMV). Curtovirus: Beet mild curly top virus-mexico (BMCTV-Mex), Beet mild curly top virus-zacatecas y Pepper curly top virus-new Mexico (PepCTV). Pretendemos continuar nuestra exploración de métodos de diagnóstico molecular más eficientes, económicos y menos demandantes de tecnologías sofisticadas, a efecto de hacer más accesible al productor agrícola o al técnico de laboratorio de un campo o invernadero comercial, las pruebas requeridas para un diagnóstico rápido, oportuno, simple y económicamente accesible, lo que eventualmente redundará en una disminución de las pérdidas por enfermedades y, por tanto, una productividad aumentada. Metodología Realizaremos visitas programadas y coordinadas en lo posible con productores agrícolas o especialistas en fitopatología de la UAZ, INIFAP y las oficinas locales de Fitosanidad, a campos agrícolas presentes en las principales regiones productoras de chile en el estado de Zacatecas, a efecto de realizar observaciones in situ y tomar muestras de plantas con síntomas de virosis. Revisaremos también la presencia de insectos vectores, y en cada caso colectaremos una buena cantidad de los mismos para su posterior identificación a nivel de especie por un entomólogo experto (Dr. Jaime Mena Covarruvias) del INIFAP campus Zacatecas, así como para la obtención de extractos de ADN total de esos vectores. Las muestras vegetales serán clasificadas, parte de ellas procesadas inmediatamente para obtener DNA total y después almacenadas a temperaturas inferiores a los-20ºc. Se realizará primero el tamizado para

10 detectar ADN de begomovirus y/o curtovirus y las muestras que resulten negativas serán descartadas. La preparación de los extractos a partir de las plantas colectadas se realizara mediante una versión modificada del método Dellaporta, que hemos utilizado con muy buenos resultados. Se usara 1 µl del extracto para realizar la reacción de amplificación del ADN viral utilizando los iniciadores específicos diseñados para los curtovirus y las dos clases de begomovirus presentes el continente americano: los virus pertenecientes al linaje del Squash leaf curl virus y los incluidos en el linaje Abulition Mosaic Virus - Tomato Golden Mosaic Virus (AbMV / TGMV). Los pares de iniciadores específicos de linaje se utilizarán en reacciones de PCR independientes, lo cual abre la posibilidad de identificar al menos tres tipos de geminivirus (curtovirus, SLCV y AbMV / TGMV). Los productos de PCR se clonarán posteriormente en un vector comercial, pgemteasy (Promega, Inc), y los plásmidos recombinantes obtenidos se analizaran con enzimas de restricción para liberar el inserto. Las clonas que contengan el inserto esperado se enviaran a secuenciar, a fin de identificar inequívocamente la o las especies de begomovirus que infectan a la planta. El procedimiento admite un análisis más refinado, en el cual se analizan las clonas recombinantes por medio de la técnica de RFLP, utilizando las enzimas Hinf1y Msp1 para distinguir, por el patrón de bandas de digestión, a las clonas que contengan productos de PCR de diferente origen (virus distintos). Dado que este procedimiento emplea varios pares alternativos de iniciadores, y los patrones de restricción suelen ser complejos, recomendamos consultar las Tesis de Maestría de Clara Monreal-Vargas (2005) y Armando Mauricio-Castillo (2006) que se encuentran libremente accesibles en la página de Internet del IPICYT ( a fin de conocer en mayor detalle el procedimiento descrito, el cual hace posible detectar begomovirus coinfectantes en una planta (infección mixta) sin importar el numero [se han encontrado hasta 4 especies en una misma planta (Mauricio-Castillo et al., en preparación)]. Finalmente, el análisis de muestras compleja de vectores se llevará a cabo por un procedimiento desarrollado en nuestro laboratorio, en el que preparamos extractos de DNA total a partir de mosquitas blancas colectadas en un mismo campo agrícola, y a partir de ese extracto amplificamos el DNA de begomovirus utilizando algunos de

11 los muchos iniciadores disponibles en el laboratorio. Los productos de PCR se clonan luego en plásmidos especiales, y se identifican los DNAs derivados de diferentes begomovirus presentes en la mezcla del extracto colectivo. De esta manera es posible aislar, en principio, todos los virus diferentes presentes en la población de mosquitas colectadas. Un procedimiento análogo se utilizará con las chicharritas (Circulifer tenellus), lo cual incrementará significativamente la probabilidad de encontrar y aislar especies de curtovirus diferentes a las que se han encontrado hasta ahora en los estados de Zacatecas y San Luís Potosí. Con los datos recopilados implementaremos estrategias para controlar la diseminación del insecto vector y disminuir su capacidad para transmitir geminivirus. Por ultimo diseñaremos un mapa preliminar de distribución de los virus identificados en el Estado, y relacionarlo con datos fitopatológicos de los Estados vecinos a fin de definir áreas geográficas con elevada probabilidad de emergencia de enfermedades específicas. Infraestructura disponible. A pesar de llevar un avance significativo en el monitoreo de los vectores y diseño de las técnicas que serán probadas como parte del proyecto aun requerimos del equipo básico para seguir con el proyecto de ahí la necesidad del apoyo económico por parte de Promep. Con respecto al espacio ya tenemos un espacio designado para colocar el equipo que será adquirido. Incidencia del proyecto en el Programa Integral de Fortalecimiento Institucional. Los alcances del proyecto propuesto son grandes ya que es la base para iniciar con la aplicación de técnicas basadas en la biología molecular para diseñar estrategias de apoyo al contribuyente de tal forma que con el tiempo se pueda establecer un centro de diagnóstico regional que brinde servicio a los productores de una amplia variedad de cultivos de interés económico a precios accesibles favoreciendo el diagnóstico oportuno no solo de enfermedades virales si no tambien de origen bacteriano y fúngico. Como punto adicional se generaran una gran cantidad de recursos humanos los cuales posteriormente pasaran el conocimiento a otras personas y así la capacidad técnica de alto nivel se vera favorecida despertando en las nuevas generaciones la inquietud de inovar e integrarse a la tecnología de punta.