Detección de Trichinellosis con Diferentes Metodologías

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1 Detección de Trichinellosis con Diferentes Metodologías Malandrini, Jorge; Molina, Viviana; Soria, Claudia; Pizarro, Carmen Facultad de Ciencias de la Salud. UNCa - Maestro Quiroga s/n - K4700 Catamarca - brunomalandrini@yahoo.com.ar Trichinellosis Detection with Different Methodogies Abstract Trichinellosis is a parasitary zoonotic disease which is spread exclusively by alimentary transmission and is a serious problem for the public health. In Catamarca province it was diagnosed by first time in 1998 and the sanitary actions implemented since the first outbreak allowed to act in the successive outbreaks and also identified positives animals. The activity is done in small corral and in bad conditions of hygiene. The present paper aim s was to compare the results obtained with ELISA technique use and reached applying the Fast Artificial Digestion during the last decade in Catamarca Province. There were analyzed porcine animals samples of different breeds, sex, ages and places using artificial digestion technique for direct diagnostic and the enzyme inmuno assay (ELISA) as indirect technique. The studied total sample was of pigs. The results showed significant differences (p>0,05) between both techniques. To reach the diagnostic in two 50 pork s groups, there were sacrificed 587 animals in cold-storage plant and 493 with sanitary riffle, without obtained the individual identification of the positive cases. With the ELISA technique implementation there were analyzed 460 samples obtaining nine positive pigs, confirmed by Western blot. It was practiced euthanasia to six and it was realized digestion with positive result. The high sensitivity which ELISA test gives, allows to prevent unnecessary swine s slaughter of small producers and avoid important economical losses, social impacts and it improves the public health. Key work: Trichinellosis; detection; methodogie; ELISA; Fast Artificial Digestion. Resumen Trichinellosis es una enfermedad zoonótica parasitaria que se contagia exclusivamente por transmisión alimentaria, convirtiéndose en un problema serio para la salud pública. En la provincia de Catamarca se diagnosticó por primera vez en 1998 y las acciones sanitarias implementadas a partir del primer brote permitieron actuar en los que se fueron sucediendo, además de identificar animales positivos. La actividad Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 25

2 pecuaria es llevada a cabo en pequeños chiqueros y en malas condiciones de higiene y sanidad. El objetivo del presente trabajo fue comparar los resultados obtenidos con el uso de la técnica de ELISA y los alcanzados con la aplicación de Digestión Artificial Rápida (DAR) durante la última década en la provincia de Catamarca. Se analizaron muestras de animales porcinos de diferentes razas, sexo, edades y localidades utilizando la técnica de digestión artificial para el diagnóstico directo y la de enzimo-inmuno-ensayo (ELISA) como técnica indirecta. La población total estudiada fue de cerdos. Los resultados arrojaron diferencias significativas entre ambas técnicas. Para lograr el diagnóstico en dos grupos de 50 porcinos cada uno, se sacrificaron 587 animales en frigoríficos y 493 con rifle sanitario, sin alcanzar la identificación individual de los positivos. A partir de la implementación de la técnica de ELISA se analizaron 460 muestras serológicas obteniendo nueve porcinos positivos, confirmados por Western blot, se practicó eutanasia a seis y se realizó digestión con resultado positivo. La alta sensibilidad que da la prueba de ELISA logra impedir matanzas innecesarias de los cerdos de pequeños productores; evita importantes pérdidas económicas, impactos sociales y mejora la salud pública. Palabras clave: Trichinellosis; Detección; Métodos; Digestión Artificial; ELISA Introducción La prueba de digestión artificial rápida (4) es la más frecuentemente utilizada para detectar larvas de Trichinella spiralis. La capacidad infectiva también puede ser evaluada en observación directa. Comparaciones entre métodos de DAR y trichinoscopía en carne de cerdo demuestran que existen diferencias significativas (p < 0.01) entre ambos (3,9). El examen parasitológico directo puede ser positivo luego de dos semanas post-infección. En el examen de rutina de canales de cerdos en los que se emplea la digestión artificial - pool de varias muestras-, se recomienda procesar como mínimo un gramo y de preferencia cinco gramos de tejido para la prevención de la enfermedad (5). Las muestras deben estar claramente identificadas con el cerdo del cual provienen. La implementación de una técnica con mayor sensibilidad para el diagnóstico de la triquinellosis en los cerdos, significa para el propietario, la posibilidad de sanear su piara, con el beneficio económico que ello representa. El uso de la Digestión Artificial Rápida tiene un fuerte impacto en la comercialización de sus productos. En el aspecto sanitario, la implementación de medidas de Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 26

3 control brinda a la población seguridad y confiabilidad en el consumo de carnes porcinas (13). La Trichinellosis porcina constituye un problema de salud pública, ya que el cerdo es el principal transmisor al ser humano causándole la enfermedad. Se ha logrado un gran avance en el diagnóstico con la aplicación de estudios serológicos para detectar anticuerpos anti T. spiralis (9). A través del tiempo han sido numerosas las pruebas que se consideraron como gold standart para el diagnóstico de la Trichinellosis. La respuesta humoral está desarrollada por la aparición en la circulación de anticuerpos específicos de varias clases de inmunoglobulinas principalmente del tipo de IgG y también IgM, IgA e IgE. El diagnóstico inmunológico comenzó con el empleo de la fijación de complemento, test de precipitación, intradermorreacciones, hasta llegar a inmunofluorescencia indirecta (IFI), al ensayo inmunoenzimatico (ELISA) y la inmunotransferencia (Western blot). Actualmente la mayoría de los ensayos utilizan antígenos obtenidos de larvas musculares dada la fácil recuperación de las mismas. El ELISA es altamente sensible. Tiene como principales ventajas el bajo costo, la capacidad de estandarización del método y de los reactivos, además de la posibilidad de evaluar gran cantidad de muestras. El Western blot es usado generalmente como método confirmatorio y para validar resultados obtenidos por ELISA. Es un método sensible y específico si se utilizan productos de excresión-secreción como antígeno, ya que permite claramente la visualización del pattern de bandas en sueros reactivos (1). Estas pruebas son costosas, laboriosas y requieren una mayor tecnología; por lo tanto, su aplicación está limitada a laboratorios de determinada complejidad. Una combinación de por lo menos dos métodos (ELISA-Western blot) aumenta la sensibilidad y especificidad del inmunodiagnóstico. La consideración del período de ventana inmunológico y la posibilidad de detectar infecciones anteriores en una zona donde la enfermedad es endémica, hacen necesario contar con muestras seriadas a fin de evaluar la movilidad de los niveles de anticuerpos circulantes (8). Aplicando el sistema de diagnóstico ELISA/Western blot a tres muestras seriadas de sangre, se revela la relación del parásito con las células musculares del hospedero a través del conocimiento del nivel de producción de los antígenos metabólicos. Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 27

4 Se admita o no, hasta los mejores test diagnóstico están ensombrecidos por la incertidumbre, ya que muy pocos pueden diagnosticar con un 100% de eficacia por lo qué en ensayos serológicos, al menos, no hay Gold Estándar de la cual se pueda afirmar que a partir de un único resultado se logre un ansiado discernimiento. Por otra parte, Ribicich et al (2000) en estudios realizados, demuestra que la sensibilidad y valor predictivo positivo del test de ELISA utilizando antígeno ES para el diagnóstico de T. spiralis, en condiciones de campo, se reporta entre el 93.1 y el 99.2%. Ambas técnicas, Digestión Artificial y test de ELISA, poseen limitaciones: la sensibilidad de la técnica de ELISA esta en 0,01 lpg., sin embargo la posibilidad de falsos negativos, la hace inadecuada para su utilización en la faena. El objetivo del presente trabajo fue comparar los resultados obtenidos con el uso de la técnica de ELISA y los alcanzados con la aplicación de Digestión Artificial Rápida durante la última década en la provincia de Catamarca. Desarrollo Antecedentes Desde el primer brote acaecido en la ciudad de Recreo (1998) donde enfermaron 12 personas, se sucedieron uno al año siguiente comprometiendo cuatro humanos -San Antonio-, y otro con tres personas enfermas en Aimogasta. En junio de 2006, en Chumbicha, departamento Capayán, se vieron involucrados cinco integrantes de una familia y se detectó una persona en San Antonio. En 2007 se diagnosticaron ocho personas más. A partir del aislamiento de larvas de Trichinella spiralis (7) se confirma la presencia de la enfermedad y se realiza la denuncia correspondiente a las autoridades sanitarias, lo que provocó medidas tendientes a resolver la situación. El 31 de agosto de 1998 se declara al Departamento La Paz, infectado por trichinellosis porcina y en estado de emergencia (14). Con el apoyo de Gendarmería Nacional se interdictaron los cerdos presentes en la Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 28

5 ciudad de Recreo y se dispuso la faena sanitaria de todos los animales y la aplicación de la Ley 3959 de Policía Sanitaria de los Animales. Se procedió a la faena de 587 porcinos en un establecimiento frigorífico de la provincia de Córdoba. Se realizaron las digestiones agrupando las muestras en grupos de 50 animales cada uno (6). Para dar cumplimiento con la Resolución 225/95 se aplicó rifle sanitario a 65 cerdos el 25/06/99 y el 29/06/99 a 20 en Fray Mamerto Esquiú, Piedra Blanca. El 01/09/99 a 188 en las localidades de Los Perea y Huaycama, Valle Viejo; y el 29/09/99, 220 animales en La Sala, Valle Viejo. Se sacrificaron 493 animales (12), alcanzando un total de 1080 cerdos. Prueba de digestión artificial Se realiza un procedimiento de digestión con grupos de veinte (20) muestras a la vez. Se tritura en una máquina de picar carne 20 muestras de cinco gramos. Se lleva la carne picada a un vaso de precipitado de dos litros y se espolvorea con 15 gramos de pepsina, se introduce agua destilada a una temperatura de 44º C a 46º C y se agrega 15 mililitros de ácido clorhídrico. Se recuperan los restos de carne del recipiente de la picadora y de la cuchilla y se los introduce en el vaso de precipitado. Se mide el ph. Se agita hasta la digestión completa. Se deja reposar el líquido de digestión en la ampolla cónica de decantación durante no menos de 30 minutos, se toma una muestra de 50 mililitros del líquido de digestión en una probeta graduada y se deja reposar durante 15 minutos. Luego se aspira de la superficie muy lentamente, 40 mililitros de líquido sobrenadante dejando así un volumen de 10 mililitros. La muestra de 10 mililitros del sedimento se vierte en una placa de Petri o en una cubeta para el recuento de larvas. Enzimo-inmuno-ensayo (ELISA) El diagnóstico se basa en un sistema en paralelo conformado por un enzimoinmuno-ensayo de base sólida (ELISA) que mide anticuerpos circulantes contra antígenos de excreción-secreción como método de cribaje. El diagnóstico se considera positivo cuando ELISA es mayor a la densidad óptica media de sueros negativos más tres desvíos standart (d). Se consideró Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 29

6 sospechoso de ser portador de larvas a todo cerdo con valores de densidad óptica (DO) mayor o igual a Western blot El ensayo de Western blot se utiliza como método de confirmación. Los sueros positivos por ELISA (o indeterminados mayores de de D.O) se examinan con la técnica de Western blot (100% de especificidad) y cuando las bandas de precipitación entre 39 y 67 Kd (y cuando al incubarse con las proteínas de excreción-secreción unidas a la membrana de nitrocelulosa deja visualizar el pattern de bandas correspondientes a 45, 49 y 53 Kd -Laboratorio de Parasitología, Instituto Carlos Malbrán ), se emite el diagnóstico positivo. Resultados Los resultados arrojaron diferencias significativas entre ambas técnicas. Para lograr aislar larvas en dos grupos de 50 porcinos cada uno, se sacrificaron 587 animales en frigoríficos y 493 con rifle sanitario, sin alcanzar la identificación individual de los cerdos positivos. A partir de la implementación de la técnica de ELISA se analizaron 493 muestras serológicas obteniendo nueve porcinos positivos, confirmados por Western blot, se practicó eutanasia a seis y se realizó digestión con recuperación de las larvas de T. spiralis. Discusión Trichinellosis se caracteriza por una problemática muy compleja. Tiene un fuerte impacto en la economía de las familias propietarias de cerdos en la provincia de Catamarca. La política sanitaria aprobada y aplicada (15) no logró brindar seguridad y confiabilidad, ya que se continúan realizando faenas caseras sin control. Es escasa la información de los costos económicos y sociales generados a partir de esta enfermedad. A partir de este contexto, el SENASA intentó la aplicación de las normas vigentes en el país: el Registro Nacional de Médicos Veterinarios Privados para Enfermedades de los Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 30

7 Porcinos y un Registro de Productores. Sin embargo, la situación no ha mejorado. La confiabilidad del método de análisis para Trichinella requiere del uso de un programa adecuado que asegure la calidad del mismo (10). El método empleado debe llevarse a cabo siempre bajo condiciones definidas por analistas competentes y los resultados deben ser reproducibles y confiables. La técnica recomendada por el Servicio Nacional en las condiciones de producción y control sanitario de la provincia no garantiza mejoras. El diagnóstico preventivo en piaras de la zona de riesgo no persiguió el resultado individual si no la ubicación de la situación epidemiológica de los criaderos familiares en cuestión La comparación de nuevas metodologías que no hayan sido validadas previamente no debe aceptarse como superiores ante los métodos existentes (2). La implementación de técnicas inmunológicas indirectas ha resultado favorable para la detección de T. spiralis en humanos, y en los modelos experimentales rata, ratón y conejo, y la utilización de éstas en el diagnóstico en cerdos vivos en la infección natural, es también factible. A diferencia de lo comunicado por Moreno García et al (2003), la prueba confirmatoria de elección dado su bajo costo, rapidez, sensibilidad y accesibilidad contribuye en el diagnóstico del relevamiento epidemiológico. La exposición de los cerdos con T. spiralis está limitada a pocos factores de riesgo, los cuales incluyen: la alimentación con desperdicios contaminados, exposición y consumo de tejido muscular de roedores o de algún animal de vida silvestre infectado (3). No obstante, el veterinario tiene una función primordial para limitar el brote, determinar la fuente de infección y realizar el seguimiento epidemiológico. Sin embargo, su rol más preponderante se encuentra en la etapa de prevención, en establecimientos con porcinos y en las faenas. Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 31

8 Conclusiones Los resultados obtenidos demuestran que con un adecuado plan sanitario, se logró identificar los animales positivos, aislarlos, repetir las pruebas, sacrificarlos con autorización del propietario y aislar larvas con la prueba parasitológica directa de digestión artificial. Catamarca constituye una provincia de alto riesgo endémico para la enfermedad. Los métodos diagnósticos que se llevan a cabo en cerdos, para detectar T. spiralis, tienen el inconveniente de que se realizan sólo post mortem. Los resultados confirman que los métodos serológicos, en particular, la prueba de ELISA, constituye en una herramienta sumamente útil para la vigilancia epidemiológica al proveer oportunidades para la detección rápida de la infección por Trichinella en cerdos vivos. La implementación del test de Elisa (Sistema ELISA-Western Blot) permite realizar este trabajo en los porcinos para ofrecer un saneamiento de los positivos. La situación socio-económica por la que atraviesan los grupos de riesgo es alarmante. Los resultados confirman que el test de ELISA (Sistema ELISA- Western Blot) utilizando antígeno excretor-secretor en cerdos es una herramienta fundamental para descartar tempranamente los animales positivos de las piaras. Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 32

9 Bibliografia 1. Aguilar Figueroa BR, Bautista G, Rojas J, De Nova ME, Ixta G, Martínez F. Experimental swine Trichinellosis: Use of Dot-ELISA and Western blot with excretion/secretion antigens (ES) from infective Larvae to detect antitrichinella spiralis antibodis. Rev. Latinoam. Microbiol. 2000; 42: Andiva S, Year H, Haeghebaert S, Tourte Schaefer C, Magnaval JF, Dupouy- Camet J. Comparative evaluation of a latex agglutination test, two ELISA test and a Western blot test for the serodiagnosis of human trichinellosis. Ann Biol Clin, 2002; 60 (1): Cháves Guajardo EG, Saldivar Elías S, Muñoz Escobedo JJ, Moreno García. Tichinellosis una zoonosis vigente. Rev. Elect. Vet. 2006; Vol. VII 5, ISSN Gamble RH. Detection of Trichinellosis on Pigs by Artificial Digestion and Enzyme Immunoassay. Journal of Food Protection, 1996, Vol. 59 (3): Gamble RH, Bessonov K, Cuperlovic AA, Gajadhar F, Van Knapen K, Noecker H, Zhu X. International Commission on Trichinellosis. Recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals Intended for human consumption. Veterinary Parasitology. 2000; Vol. 93 (3, 4): Gobierno de Catamarca. Subsecretaría de Asuntos Rurales. Informe de FOSEGA; Malandrini JB, López R, Pizarro MC, Soria CC. Confirmación por Diagnóstico Enzimático de un Brote de Trichinellosis en el Departamento La Paz, Provincia de Catamarca. Congreso UNCa Molina V, Guarnera EA. Diagnóstico Inmunoserológico de la Trichinellosis humana. FAO-Red de Helmintología para América Latina y el Caribe, 2005; p Moreno García MA, Muñoz Escobedo JJ, Reveles Hernández G, Saldivar Elías S, Vació de la Torre M. Utilidad de técnicas directas e indirectas en el diagnóstico de trichinellosis en el cerdo. Rev Mexicana Parasitol. 2003; 3 (1) Ribicich M, Rosa A, Molina V. et al. Comparación entre la Digestión Artificial y la Triquinoscopía para la detección de Trichinella spiralis en carne porcina. Investigación Veterinaria. Buenos Aires, Argentina. 2000; 2: Ribicich M, Gamble HR, Santillan G, Miguez M, Molina V, Guarnera E, Basso N, Franco A. Evaluation of ELISA test for the diagnosis of porcine trichinellosis. The pig Journal. 2000; Vol. 46: Ruiz HM, Soria CC Situación actual de Trichinellosis en la Provincia de Catamarca, agosto 98/99. Programa de Fortalecimiento del sector Ganadero. Ministerio de Producción. Gobierno de Catamarca. 13. Servicio Nacional de Sanidad Animal. Resolución 225/95. Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 33

10 14. Servicio Nacional de Sanidad Animal. Resolución 1072/ Servicio Nacional de Sanidad Animal. Resolución 740/99. Ciencia, Vol. 5, Nº 14, Abril Página 34