Maestría en Ciencias Veterinarias. Mecanismo de Acción de los Receptores de Hormonas Esteroides.

Transcripción

1 Laboratorio de Biología Celular y Molecular Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional del Litoral Maestría en Ciencias Veterinarias Biología Celular y Molecular 2012 Mecanismo de Acción de los Receptores de Hormonas Esteroides. Dra. Natalia R. Salvetti

2 Receptores Nucleares Los receptores de hormonas nucleares son miembros de la superfamilia de activadores transcripcionales dependientes de ligando. Regulan la expresión de genes específicos en respuesta a pequeñas moléculas lipofílicas (ligando u hormona) que incluyen: Hormonas Esteroides Hormonas Tiroideas Ácido Retinóico Vitamina D

3 Repaso: transcripción Regiones de control transcripcional: secuencias del ADN que permiten la unión de proteínas que regulan el proceso de transcripción, aquí se incluyen promotores, elementos proximales al promotor y amplificadores. Sitio de Inicio de la trascripción: lugar en donde la ARN POLII inicia la trascripción dando origen a la primera base del exón del ARNm que se esta transcribiendo en sentido 5 a 3. Promotor: secuencia río arriba del inicio de la transcripción donde se une el complejo de transcripción incluyendo la RNA polimerasa. (TATA box) 5 3

4 Repaso: transcripción TATA box o elemento iniciador: secuencia que indica a la ARN POLII en donde ubicarse. TATA box es la más encontrada y generalmente se encuentra a pb del sitio de inicio de la trascripción en dirección 5. Elementos proximales al promotor: regiones de control (dentro del ADN) que se encuentran entre pb en dirección 5 del sitio de inicio de la trascripción. Amplificadores: son elementos de control de la trascripción que amplifican la trascripción. Pueden estar muy alejados del sitio de inicio de la transcripcion, en dirección 5 o 3.

5 TBP ADN Figura 6-16 (parte 1 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

6 Figura 6-16 (parte 2 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

7 Figura 6-16 (parte 3 de 3) Biología molecular de la célula, quinta edición ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

8 Repaso: transcripción

9 Repaso: transcripción Factores de transcripción: proteínas que regulan la expresión génica, se unen a secuencias del DNA río arriba del sitio de inicio de la transcripción o al complejo de transcripción, estimulando o reprimiendo la actividad del complejo.

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12 Receptores Nucleares Existen mas de 60 factores de transcripción dependientes de ligando, entre los que se pueden encontrar: Ligando Estradiol Progesterona Cortisol Aldosterona Testosterona y DHT Vitamina D T3 y T4 Ácidos Retinoicos 9- Cis Ácidos Retinoicos trans Receptor Receptor de Estrógenos (RE) Receptor de Progesterona (RP) Receptor de Glucocorticoides (RG) Receptor de Mineralocorticoides (RM) Receptor de Andrógenos (RA) Receptor de Vit D (VDR) Receptor de hormonas tiroideas (TR) Receptor de ácido retinoico (RAR) Receptor de retinoide X (RXR)

13 La superfamilia de los receptores hormonales nucleares Los genes regulados por los receptores nucleares están relacionados con una gran variedad de procesos incluyendo metabolismo, desarrollo, crecimiento y diferenciación. Los receptores nucleares están constituidos por tres principales dominios funcionales además de dos zonas de activación transcripcional: Dominio de Unión al ADN (DBD): C Dominio de Unión al Ligando (LBD): E Dominio Amino Terminal Dominios de activación transcripcional: AF (AF1 y AF2)

14 Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides Dominio de unión al ADN (DBD): la estructura del DBD consiste en dos dedos de zinc formados por cuatro residuos de cisteínas con un átomo de zinc. La región aminoterminal del dedo de zinc contacta con el surco mayor de la doble hélice de DNA, constituyendo la caja P. La especificidad de la unión del receptor a la secuencia del Elemento de Respuesta a Hormona (ERH) del ADN viene también determinada, en parte por los tres aminoácidos adyacentes al primer dedo de zinc. El segundo dedo de zinc en la región carboxiterminal también es necesario para la unión del DNA, ya que mutaciones en esta región generan un receptor inactivo.

15 Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides N Dominio N DBD H LBD C AF-1 Región Bisagra AF-2

16 Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides Dominio de unión a la hormona (LBD): está localizado en la región carboxiterminal del receptor. Aquí se ubican las proteínas inhibidoras (HSP90) para evitar la activación del receptor. N Dominio N DBD Región H LBD AF-1 Bisagra AF-2 C

17 Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides Dominios de transactivación (AF1 y AF2): son esenciales para la transactivación y actúan independientemente de la posición que ocupen. El AF2 es dependiente del ligando, no así el AF1.

18 Receptores Nucleares Los receptores nucleares han sido clasificados en cuatro clases de acuerdo a: Interacción con HSPs Tendencia a formar homodímeros o heterodímeros Especificidad de unión al ADN

19 Receptores Nucleares Clase I: Tienen largos dominios A/B. Cuando no están unidos al ligando permanecen secuestrados por grandes heterocomplejos 9S (proteasa resistentes) que contienen HSP (HSP70, HSP90, p23,p60), inmunofilinas (CyP40, etc) y otras chaperonas. Luego de la unión del ligando se produce la disociación del heterocomplejo y los receptores pueden dimerizar y unirse al ADN. En ausencia del ligando los receptores se trasladan entre el núcleo y el citoplasma con una cantidad constitutiva citoplasmática dependiendo del tipo de receptor. Ligandos y receptores: Los receptores de esteroides (Receptores de Andrógenos, Estrógenos, Progesterona, Mineralocorticoides, Glucocorticoides).

20 Receptores Nucleares Clase II: Tienen cortos dominios A/B. No se relacionan con Heat Shock Proteins Permanecen unidos a elemento de respuesta del ADN formando homodímeros o monómeros pero de preferencia formando heterodímeros con RXR. Esperan in situ la unión y consiguiente activación por el ligando. Ligandos y receptores: hormona tiroidea (RT), dihidroxivitamina D (VDR), Ácidos retinoicos trans (RXR), y la mayoría de los receptores huérfanos.

21 Receptores Nucleares Clase III: Funcionan primariamente como monómeros aunque pueden dimerizar con RXR. Producen transcripción constitutiva. Ligandos y receptores: Factor esteroidogénico -1 (SF-1). Clase VI: Muestran características similares a los de clase I y II pero se unen al ADN exclusivamente como monómeros en medios sitios con repeticiones directas. Ligandos y receptores: Algunos de los receptores huérfanos tales como el HNF-4 (Factor nuclear de hepatocitos 4)

22 Receptores de Hormonas Esteroides Los receptores de hormonas esteroides se clasifican dentro de los de Clase I. Receptores de Estrógenos (RE) Receptores de Andrógenos (RA) Receptores de Progesterona (RP) Receptores de Mineralocorticoides (RM) Receptores de Glucocorticoides (RG)

23 Receptores de Hormonas Esteroides En los mamíferos, las adrenales, las gónadas y la placenta producen cinco grandes grupos de hormonas esteroides. Estas hormonas regulan numerosos procesos fisiológicos en las células blanco equipadas con los correspondientes receptores hormonales. Estrógenos Progesterona Andrógenos Mineralocorticoides Glucocorticoides

24 Receptores de Hormonas Esteroides Factores de transcripción dependientes de ligando: Hormonas Esteroides. Ligando Estradiol Progesterona Cortisol Aldosterona Testosterona y DHT Receptor Receptor de Estrógenos (RE) Receptor de Progesterona (RP) Receptor de Glucocorticoides (RG) Receptor de Mineralocorticoides (RM) Receptor de Andrógenos (RA)

25 Receptores de Hormonas Esteroides La unión de las hormonas esteroides (HE) a los receptores nucleares de esteroides (RNE) se realiza según un modelo de dos pasos: 1. Unión de la hormona al receptor específico dentro de la célula blanco (puede ser en el citoplasma o en el núcleo, de acuerdo al receptor). 2. Activación del complejo hormona-receptor para inducir la expresión génica en respuesta a hormonas.

26 Receptores de Hormonas Esteroides

27 Homología en las secuencias de los distintos receptores de hormonas esteroides

28 Regulación de la transcripción génica mediada por Receptores de hormonas esteroides Las hormonas esteroides cumplen su función mediante la activación de los receptores hormonales, los cuales van a unirse, luego de la dimerización, al Elemento de Respuesta a Hormonas (ERH) localizado en promotores de los genes blanco. Los receptores GR, MR, AR y PR se unen al mismo ERH originalmente denominado ERG (Elemento de Respuesta a Glucocorticoides). Este está compuesto por mitades invertidas (palindrómicas, IR3= inverted repeat 3) de la secuencia TGTYCT (esta ultima base poco conservada) separadas por tres pares de bases no conservadas NNN. Y= cualquier base pirimídica (C o T) R= cualquier base purínica (G o A)

29 Regulación de la transcripción génica mediada por Receptores de hormonas esteroides Los receptores de estrógenos así como también los receptores relacionados a estrógenos (receptores huérfanos, RRE) interaccionan con elementos de respuesta específicos, ya sea como homodímeros o heterodímeros (cada monómero se une a una mitad). Los receptores ER y los RRE se unen al ERE (Elemento de respuesta a estrógenos). Este está compuesto por mitades invertidas (palindrómicas, IR3= inverted repeat 3) de la secuencia TGRCC separadas por tres pares de bases no conservadas NNN. Y= cualquier base pirimídica (C o T) R= cualquier base purínica (G o A)

30 Regulación de la transcripción génica mediada por Receptores de hormonas esteroides El descubrimiento de los huérfanos RRE α y β (receptores relacionados a estrógenos) llevó a la identificación de un elemento de respuesta exclusivo para estos. Los RRE α y β (receptores relacionados a estrógenos) se unen al ERRE (Elemento de respuesta relacionado a estrógenos) como monómeros o dímeros. Además el REα puede unirse como homodímero a este. El ERRE está compuesto por una mitad del ERE que continúa hacia el extremo 5, separada por 1 par de bases N. Y= cualquier base pirimídica (C o T) R= cualquier base purínica (G o A)

31 Correguladores Los correguladores son proteínas que interactúan con factores de transcripción y modulan su actividad positiva o negativamente, y que desde un punto de vista funcional se clasifican en dos tipos: Coactivadores. Correpresores.

32 Correguladores Los coactivadores, no interactúan directamente con el DNA sino que lo hacen de manera indirecta a través de su asociación con factores de transcripción, entre los que se encuentra el receptor de estrógenos. Se sabe que la unión del ligando al ER genera un cambio conformacional en su LBD, formando una cavidad hidrofóbica que permite la interacción con coactivadores a través de una secuencia o motivo LxxLL (donde L es leucina y x es cualquier aminoácido) llamada caja NR. Esta caja NR está presente en una o varias copias en un gran número de coactivadores.

33 Correguladores Los co-activadores usualmente se presentan en complejos multiprotéicos que interactúan con factores de transcripción y modifican la cromatina para facilitar la transcripción, a través de mecanismos de: Remodelación de cromatina Acetilación y metilación de histonas. Facilitación del reclutamiento de la maquinaria general de la transcripción y la activación de Pol II. Estabilización de los complejos sobre el DNA. Estabilización del ARNm. Regulación del recambio de complejos proteicos sobre los promotores.

34 Correguladores Los correpresores: Cuando los receptores nucleares (RN) actúan como represores transcripcionales, los correpresores tienen un papel importante en esta regulación negativa. Muchos de los RN reprimen la transcripción en ausencia de su ligando o en presencia de ligandos antagonistas, como el tamoxifeno. Esta regulación negativa está mediada en parte por los co-represores. La unión de antiestrógenos causa un cambio conformacional en AF-2 diferente al creado por la unión de ligandos agonistas lo cual bloquea la interacción con coactivadores de AF-2 y permite la entrada de correpresores. Los correpresores se unen a los receptores por medio de una caja CoRNR que tiene una secuencia similar a las cajas RN: LxxxI/ HIxxxI/L.

35 Correguladores Los correpresores forman parte de complejos multiprotéicos y reclutan desacetilasas de histonas (HDAC) que evitan el acceso a factores de transcripción críticos sobre el ADN, y así se ve reprimida la transcripción. El reclutamiento de complejos que contienen HDAC está implicado en la represión por un número de silenciadores en mamíferos. Existen otros represores que inhiben la actividad transcripcional de los receptores nucleares mediante diferentes mecanismos. Estos incluyen: Interrumpir la unión al DNA o la translocación al núcleo del receptor. Inhibir las interacciones entre los receptores y sus coactivadores. Interrumpir el reclutamiento de la maquinaria basal de transcripción.

36 Correguladores

37 Co-activadores A- Remodeladores y modificadores de cromatina: La cromatina juega un papel importante en la regulación de la actividad basal de muchos promotores, y moléculas diseñadas para vencer las coacciones termodinámicas que esto produce, son reclutadas en un punto temprano en el modelo de acción del RE. Quizás el mejor caracterizado entre estas moléculas es el complejo de proteínas SWI/SNF que relajan la cromatina con gasto de ATP.

38 Co-activadores B- Actividad de acetilasa de histonas: Las histonas mantienen un ambiente heterocromático (represivo de transcripción) debido a las cargas electrostáticas conferidas por las cargas positivas de las lisinas de histonas y por las cargas negativas de los grupos fostato del DNA. Miembros de la familia SRC y proteínas de unión a CREB (CBP) y p300, poseen actividad como acetilasas de histonas. Son consideradas las responsables de interrumpir las interacciones que mantienen la región del promotor en un estado cerrado, es decir relajan la cadena del DNA, convirtiendo un ambiente heterocromático en eucromático, promoviendo así el inicio de la transcripción.

39 Co-activadores C- Actividad de metilasa: En regiones silenciosas, donde el DNA está fuertemente empaquetado por la histona H3, los genes están inactivados. Por el contrario, en las regiones activas donde los genes se expresan, existe una variedad levementedistintadelahistonah3,debidoaquelahistonah3tiene metilado el aminoácido lisina de la posición 9 en regiones cerradas, mientras en las regiones activas o abiertas tiene metilado la lisina 4.

40 Co-activadores C- Actividad de metilasa: Además de las marcas sobre las lisinas, también puede existir metilación sobre las argininas, como es el caso del coactivador metiltransferasa arginina 1 (PRMT1) que metila la arginina 3 de la histona 4, que es una marca de cromatina abierta. Otro ejemplo es la metil-transferasa arginina 2 (PRMT2), que interacciona con ERα, activando la transcripción de genes blanco de E2 y el CARM1 (coactivator associated arginine (R) methyltransferase).

41 Co-activadores D- Adaptadores de Maquinaria basal de la Transcripción (MBT): Los co-activadores pueden estabilizar la unión o ayudar a reclutar factores de transcripción basal, ya que presentan interacción directa con complejos iniciadores como es el caso de las proteínas asociadas al receptor de hormonas tiroides (TRAPs) y las proteínas que interactúan con la vitamina D (DRIP). Algunos estudios han demostrado que complejos que contienen TRAP/DRIP son capaces de mejorar la actividad transcripcional de varios tipos de receptores.

42 Co-activadores E- Actividad de Ubiquitina ligasa: Algunos co-activadores pueden reclutar a enzimas con actividad de ligasas de ubiquitina, como es el caso de E6-AP que estimula la transcripción por medio de ERα de manera dependiente al ligando. Este corregulador está involucrado en marcar un sustrato para ser procesado por el sistema de degradación ubiquitinaproteasoma y así renovar el ciclo transcripcional de los genes blanco. Este proceso asegura el recambio de los complejos de la transcripción unidos a los promotores blanco.

43 Co-activadores F- Adaptadores de splicing: Aun no está bien dilucidado este mecanismo; sin embargo, se ha sugerido que proteínas como la helicasa p72 o el coactivador PGC-1, puedan estar involucradas en este tipo de procesamiento del mrna en algunos genes blanco para estrógenos.

44 Heterodímeros de RXR-VDR

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46 Co-activadores

47 Coactivadores de la familia p160 (SRC) Estas proteínas se unen de manera hormonodependiente a un amplio rango de receptores hormonales, en la zona AF2 (zona de activación de la transcripción dependiente de ligando) para intensificar la trascripción. Los componentes de esta familia son denominados Coactivadores de Receptores Esteroides (SRC), y esta compuesta por tres miembros estrechamente relacionados: SRC-1 (interacciona principalmente con RP) SRC-2 (GRIP-1 y TIF-2, interaccionan con el RG) SRC-3 (relacionado con REα en SNC)

48 Coactivadores de la familia p160 (SRC) Los SRC son proteínas que presentan solo un 40% de homología entre los componentes de la familia pero presentan dominios altamente conservados en cuanto a las funciones que cumplen.

49 Coactivadores de la familia p160 (SRC) Región N-terminal (bhlh/pas): es indispensable para la unión al receptor Dominio de interacción con los receptores nucleares (NID): contiene 3 porciones LXXLL denominadas NR boxes que interactúan con el LBD del RN en AF-2 para mejorar la transcripción (el motivo NR boxes de cada miembro de SRC tiene afinidad por distintos receptores). Dominios de activación de la transcripción autónoma: AD1 y AD2. Estos interactúan con otros coactivadores (AD1: CBP, p300; AD2:CARM1)

50 Coactivadores de la familia p160 (SRC) SRC-1 y SRC-3 tienen actividad enzimática de acetiltransferasa de histonas. CARM1 es un coactivador secundario que trabaja asociado a p160 para aumentar la transcripción por medio de reacciones de metilación de Histona 3. Si bien la acción principal de los componentes de la familia p160 es a través de AF-2, existe algo de activación a través de AF-1, sobretodo el RA que utiliza este factor de transcripción como el principal en la interacción con SRC, siendo el AF2 menos eficiente.

51 Coactivadores de la familia p160 (SRC)

52 Coactivadores de la familia p160 (SRC) Mecanismo de Acción de los coactivadores p160: Los coactivadores actúan en una secuencia de dos pasos: 1- Primero promueven el remodelamiento de la estructura de la cromatina y habilitan el acceso al ADN de los factores generales de transcripción. 2- Reclutan y estabilizan los factores asociados a la maquinaria de transcripción basal de la ARN polimerasa II mediante interacciones proteína-proteína directas o indirectas.

53 Coactivadores de la familia p160 (SRC) Mecanismo de Acción de los coactivadores p160

54 Coactivadores que actúan a través de AF-1 p68 ARN helicasa: interactúa con AF-1 del REα selectivamente (con ningún otro). SRA (steroid receptor RNA coactivator): interactúa con AF-1 de Receptores Esteroides pero no con los de otras clases de receptores nucleares, lo hace a través de su unión con SRC-1.

55 Co-represores A- Remodelación de cromatina: Mecanismo por el cual se mantiene una heterocromatina (cromatina cerrada), evitando así la transcripción de genes susceptibles a E2. Para ello la cromatina sufre tanto cambios estructurales como bioquímicos. Actividades de HDAC (desacetilasas de histonas) o metilación de histonas y/o DNA, evitan la entrada de los complejos transcripcionales sobre el promotor cerrado. NCoR (Correpresor nuclear), SMRT, RIP140, etc son algunos de los correpresores que poseen actividad desacetilasa.

56 Co-represores B- Regulación de la maquinaria basal de la transcripción: Uno de los mecanismos involucrados en la actividad represora de los RN es mediada por el efecto que los co-represores ejercen sobre la maquinaria basal transcripcional, por ejemplo, NCoR interactúa con factores de transcripción basal, impidiendo que las uniones entre estos factores sean estables. Adicionalmente, BRCA-1 se ha encontrado presente en el complejo de la RNA Pol II. SAFBI se une al dominio C-terminal de la RNA pol II. Estas interacciones hacen suponer que los correpresores inhiben la acción de la maquinaria basal de la transcripción, y así evitan la transcripción de genes blancos ER-dependientes.

57 Co-represores C- Competencia con proteínas co-activadoras: Los correpresores compiten con los coactivadores por los sitios de unión en los RN. Ejemplos claros de competencia directa son REA y SHP que compiten con los coactivadores SRC-1 y TIF-2, respectivamente. RIP140 y TIF2 han mostrado competencia por la unión a c-jun y a ERα, para modular la actividad transcripcional E 2 -dependiente por medio de AP-1. Otro ejemplo es el del correpresor erbb2, que se expresa en ausencia de estrógenos o en presencia de antiestrógenos, el cual secuestra a SRC-1

58 Co-represores D- Procesamiento de RNA: Se ha demostrado que las hormonas esteroides pueden afectar el procesamiento del RNA y que los coreguladores pueden estar íntimamente relacionados en estos procesos. Aún cuando no se conoce mucho sobre este mecanismo, se ha demostrado en diferentes correpresores la presencia de motivos de unión a RNA (RRM), tal es el caso de SHARP, RTA y SAFB1/2. E- Secuestro del RN en el citoplasma: Una medida para evitar que RN actúe sobre su gen blanco, es evitar la entrada de este al núcleo, tal es el caso del corregulador MTA1s, que secuestra al ERα antes de su translocación al núcleo.

59 Co-represores F- Bloqueo de la dimerización de ER y su unión al DNA: Como ya se mencionó, es necesario que el ER forme dímeros o heterodímeros para poder ser activado y unirse a los promotores blancos. Correguladores como TR2 y SHP, inhiben la dimerización de ERα yotros como SHP, TR2 o p53, evitan la unión del ERα al DNA. G- Otros mecanismos: También existen otros tipos de mecanismos por los cuales los correpresores podrían influir sobre la actividad de RN. BRCA-1 y NEDD8, desestabilizan al ERα o simplemente actúan como proteínas de andamiaje para reclutar complejos multiproteicos inhibidores como es el caso del correpresor SHARP.

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62 Receptores de Estrógenos Se conocen dos subtipos: REα y β. Provienen de diferentes genes y a su vez expresan isoformas mediante splicing alternativo. Se encuentran en el núcleo y en el citoplasma, hasta que se produce la unión con el ligando. Una vez unido el ligando se produce la dimerización (hetero u homodimerización)

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64 Receptores de Estrógenos

65 Interacciones Receptor de Estrógenos-ADN Mecanismo Clásico (el más estudiado): El complejo E 2 -RE se une directamente al EREs en los promotores génicos. ER ER ERE Mecanismo de Unión Indirecto al ADN : Acción Genómica independiente del ERE. Interacciones proteína-proteína con otros factores de transcripción (SP1). TF ER X Acción Genómica independiente de ligando Ciertos factores de crecimiento activan la cascada de la protein-quinasa llevando a la fosforilación del RE al ERE. P P ER ER Mecanismo No Genómico: Acciones mediadas por los RE asociados a la membrana. TF P

66 Receptores de Estrógenos

67 Receptores de Estrógenos Unión Directa con ERE como homo o heterodímeros Asociación con otros factores de transcripción

68 Receptores de Estrógenos

69 ERα ERα ERβ ERα

70 Muchas Gracias!