La Respiración ovocitaria / embrionaria como método de selección embrionaria. Estado Actual
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- Ana Núñez Alvarado
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1 La Respiración ovocitaria / embrionaria como método de selección embrionaria. Estado Actual Dr. Joaquín Moreno Jefe Laboratorio Unidad de Reproducción Asistida Hospital Clínico Universitario de Valencia Director Laboratorio Embriología FIVV Valencia 5 de Mayo de 2011
2 Introducción La FIV proporciona el 2-4 % nacimientos mundiales La FIV tiene una baja eficiencia, menos 4 % de los ovocitos obtenidosy del 20 % de los embriones transferidos se traducen en embarazo Objetivo laboratorio de FIV mejorar TE Estratégia: transferir más de un embrión Problema: aumento tasa embarazos múltiples Solución: SET Single Embryo Transfer Realizar SET de forma rutinaria sin disminuir TE
3 Introducción Realizar Cultivo Embrionario hasta Blastocisto Principal dificultad: No obtener Blastocistos Buscar marcadores tempranos de la calidad embrionaria Últimos años desarrollo de nuevas técnicas para evaluar y seleccionar embriones más eficazmente. La clave para estos nuevos procedimientos debe ser la no invasividad de la técnica, la obtención de información objetiva, cuantificable y rápida.
4 Introducción La Clasificación embrionaria actual que se basa en la evaluación morfológica es el método de rutina para seleccionar los embriones a transferir en FIV. Es una técnica bastante específica, sensible e inócua sin demasiadas complicaciones técnicas ni logísticas. Se basa en unos criterios consensuados plasmados en clasificaciones embrionarias basadas en observaciones puntuales de las caracteristicas morfológicas durante el desarrollo embrionario. Limitaciones: subjetividad asociada al criterio del observador y del própio sistema de evaluación, que concibe el desarrollo embrionario como algo estático y rígido.
5 Calidad ovocitaria / embrionaria El ovocito suele jugar un papel menor por la falta de marcadores morfológicos fiables. Se han planteado marcadores como morfología de CP, apariencia, grosor, y birrefringencia de la ZP,posición o forma del uso, pero el valor predictivo de todos ellos aún no está claro y parece limitado. Algunos dismorfismos ovocitarios han sido correlacionados con carácteríaticas concretas citogenéticas, bioquímicas y metabolómicas. En contraste con esta carencia de marcadores, la viabilidad de los gametos, y sobre todo del ovocito,es el que determina en gran parte el posterior desarrollo embrionario y el éxito reproductivo del ciclo.
6 Calidad ovocitaria / embrionaria El consumo de Oxígeno está considerado como uno de los métodos no invasivos más representativos del metabolismo embrionario, pues está directamente relacionado con la producción de ATP por las mitocondrias durante el desarrollo embrionario. No existen antecedentes descritos en la literatura de su uso clínico.
7 Consumo de Oxígeno Calidad ovocitaria / embrionaria La experimentación animal ha demostrado que las mediciones específicas de varios aspectos de la actividad metabólica de los ovocitos puede predecir el potencial de desarrollo embrionario. La medida del consumo de Oxígeno ó Respiración metabólica se presenta como un buen indicador ya que se encuentra directamente relacionado con la producción de ATP durante el desarrollo embrionario. Se encuentra directamente relacionado con la capacidad del ovocito de producir ATP (aumento nº mitocondrias). Buen indicador de la actividad metabólica global. Podría ser un parámetro válido para evaluar también la calidad embrionaria.
8 Consumo de Oxígeno Calidad ovocitaria / embrionaria Propuesta: Medir en ovocitos aislados un aspecto de la función mitocondrial, la Respiración (fosforilización oxidativa), puede indicar tanto la carga como la activación de la función mitocondrial (ATP). Podría ser un procedimiento válido para seleccionar los ovocitos con el mayor potencial de desarrollo. (Scott et al.,2008) 1ª aproximación mediciones tasas de respiración en ovocitos que no tuvieron una fecundación normal y en embriones donados para investigación. Encontraron diferencias en las tasas de respiración durante la maduración ovocitaria, fecundación y desarrollo embrionario temprano.
9 Aplicación de la tecnología del Embryoscope para la cuantificación de la calidad ovocitaria y embrionaria mediante el análisis de los patrones de respiración Javier Herrero, Alberto Tejera, María Cruz, Marcos Meseguer IVI Valencia Rev. ASEBIR Diciembre 2011, vol. 16 nº 2
10 Objetivo Evaluar la capacidad de diagnóstico del Consumo de oxígeno ovocitario y embrionario como marcador de calidad mediante el uso de la tecnologia EmbryoScope, correlacionanándolo las tasas de respiración con parámetros de estimulación y resultados reproductivos.
11 Material y Métodos El sistema empleado ( Embryoscope,Vers. C, Unisense Fertilitech, Aarhus,Dinamarca ) es un incubador tri-gas con un microscópio y un microsensor de oxígeno incorporado que hace mediciones automáticamente en cada ovocito / embrión de manera individualizada. El tiempo entre dos mediciones consecutivas es de 20 minutos
12 Material y Métodos La morfologia embrionaria se evaluó en día +2 / +3 basándose en: -número, simetria y granulosidad de las blastómeras, -tipo y % de fragmentación, -presencia de blastómeras multinucleadas y grado de compactación ( Alikani et al. 2000)
13 Respiración Ovocitaria Evaluar la influencia de diferentes protocolos de estimulación sobre el consumo de oxígeno de los ovocitos y analizar posibles relaciones entre la respiración ovocitaria y morfologia ovocitaria, tasas de fecundación e implantación embrionarias n=395 ovocitos de 56 ciclos de donación ovocitos (Sept 2009 y Enero 2010) Se obtuvieron 349 ovocitos MII que fueron ICSI.
14 Respiración Ovocitaria Los ciclos fueron seleccionados aletoriamente para medir la tasa media de respiración de los ovocitos en fmol/seg Criterios de exclusión para las receptoras: hidrosalpinx, ICM>30, patologias uterinas,abortos de repetición, edad > 45 años o factor masculino severo Las donantes fueron asignadas a uno de los tres regímenes diferentes de estimulación: 1- (n=14) 225 UI de rfsh(gonal-f, Serono) 2- (n=28) 225 UI HP-hMG(Menopur, Ferring) 3- (n=14) 150 UI de rfsh(gonal.f) + 75 UI de HP-hMG Inducción de la ovulación Ovitrelle (Serono).
15 Respiración Ovocitaria El consumo de oxígeno fue registrado 3 horas después de la punción, durante una hora, de forma previa a la microinyección De cada ovocito analizado se obtuvieron 3 mediciones De los n=395 embriones embriones estudiados se seleccionaron 54 de los transferidos en los que teníamos un resultado de implantación conocida: n=12 (100% implantación) nº sacos gestacionales coincidia nº embriones tranferidos n=42 ( 0 % implantación ) no se consiguió embarazo..
16 Respiración Ovocitaria:Resultados Ligera correlación negativa entre el consumo de Oxígeno de los ovocitos con la dosis total de gonadotropinas administradas en el ciclo y niveles de Estradiol el día de la administración de la hcg.
17 Respiración Ovocitaria:Resultados Fig 2. Diferencias significativas en las tasas de respiración media ovocitaria entre los grupos con diferentes protocolos de estimulación. Los ovocitos provenientes de ciclos en los que sólo se administró rfsh (n=86) obtuvieron una mayor tasa de consumo de Oxígeno.
18 Respiración Ovocitaria:Resultados Fig 3. Diferencias significativas en las tasas de respiración media ovocitaria entre los ovocitos que fecundaron y los que no. El consumo medio de Oxígeno fue aproximadamente un 10 % mayor para los ovocitos que fecundaron respecto a los que no dentro de la misma cohorte.
19 Respiración Ovocitaria:Resultados Fig 4. El consumo medio de Oxígeno fue significativamente mayor en los ovocitos que implantaron.
20 Respiración Ovocitaria:Resultados Fig 5. No se encontraron diferencias significativas entre La Tasa Media de consumo de Oxígeno entre ovocitos que dieron lugar a embriones de buena y mala calidad tanto en día +2 como +3. Aunque los ovocitos que dieron lugar a embriones de buena calidad tuvieron un mayor promedio de consumo de Oxígeno en ambos días.
21 Respiración Embrionaria Correlacionar la Tasa Media de consumo de Oxígeno embrionaria con la Tasa de Implantación y embarazo. n= 575 embriones de 56 pacientes receptoras de 1er.ciclo. Transferencia en día +3 (72 h cultivo en Embryoscope) después del ICSI. Criterios de Exclusión los mismos. Selección: n=57 embriones transferidos basándose en la certeza de implantación: grupo 1-100% implantación (n= 9) grupo 2-0 % implantación (n=48) El número de Embarazos obtenidos fue n=28 (50 %).
22 Respiración Embrionaria: Resultados Se encontraron diferentes niveles de respiración embrionaria entre los embriones que implantaron respecto a los que no, siendo mayor en los embriones que implantaron (p<0,0001). Se encontraron las mayores diferencias a partir de las 52 horas post-icsi, activación genoma embrionario. Usando el promedio de respiración embrionaria como herramienta de clasificación para determinar la capacidad de implantación se determinó un valor de corte >5,89 mol/seg (Sensibilidad 55,6 %, Especificidad 87,5 %). La tasa de respiración embrionaria tambien fue mayor en los embriones que consiguieron embarazo evolutivo respecto a los que no (p<0,047).
23 Respiración ovocitaria / embrionaria: Discusión Para los autores es la 1ª información acerca de las tasas de respiración en ovocitos y embriones humanos viables en clínica dentro del marco de las TRA. (Scott et al. 2008).Misma tecnología pero en ovocitos no viables. (Magnunson et al. 1986). Empleó microespectrofotometria. Inconveniente: técnica invasiva.se realizó en ovocitos y blastocistos humanos maduros sobrantes de ciclos naturales. Sin transferencia ni posibilidad de correlacionarlo con resultados clínicos..
24 Respiración ovocitaria / embrionaria: Discusión El consumo de oxígeno puede ser relacionado con la carga y actividad mitocondrial presente en el ovocito (Dumollard et al. 2007). El metabolismo mitocondrial es importante para la maduración durante la foliculogénesis, desde el estadio de VG en el folículo primordial hasta en estadio de Metafase II en el folículo de Graaf (Krisher,2004). Pero, además, el consumo de Oxígeno y la consiguiente carga mitocondrial podría ser importante en la organización cromosómica así como durante todo el desarrollo embrionario( Shoubrigde and Wai, 2007)..
25 Respiración ovocitaria / embrionaria: Discusión Por lo tanto, si el consumo de oxígeno está relacionado con la actividad mitocondrial, esto está directamente relacionado con la producción de ATP que puede comprometer la Fecundación y el Desarrollo Embrionario (Van Blerkom, 2000). Finalmente, como el desarrollo embrionario está directamente relacionado con la salud de los Gametos (Meseguer et al, 2010), un potencial marcador de calidad ovocitaria como la Respiración ovocitaria podría usarse como indicador de la futura calidad embrionaria..
26 Respiración ovocitaria / embrionaria: Conclusiones 1- El régimen de estimulación ovárica empleado parece tener efecto sobre la tasa de respiración ovocitaria. El uso de rfsh está asociado a una respiración más activa. 2- La respiración ovocitaria no se asocia con la morfología embrionaria e día +2 / La respiración ovocitaria se muestra como una herramienta válida y útil para la selección de ovocitos antes de la fecundación, especialmente en paises con leyes restrictivas. 4- los resultados indican que seria posible construir un perfil ovocitario de respiración que se asocie con una correcta fecundación y posterior implantación.
27 Respiración ovocitaria / embrionaria: Conclusiones 5- La medición del consumo de Oxígeno se plantea como un marcador objetivo de la calidad embrionaria pudiendo emplearse como criterio de selección temprano. 6- Por otro lado, la respiración embrionaria en torno al día +3 de desarrollo se correlaciona más fuertemente con el potencial de implantación del embrión. 7- Hará falta realizar estudios prospectivos que corroboren la utilidad de este parámetro como una buena herramienta de selección embrionaria.
28 Respiración ovocitaria / embrionaria: Futuro Realizar un perfil ovocitario de respiración que se asocie con una correcta fecundación y posterior implantación. Demostrar y establecer un umbral de consumo de Oxígeno para seleccionar ovocitos con la mayor competencia reproductiva. Realizar estudios prospectivos y randomizados En el potencial implantatorio de un embrión influyen múltiples factores, pero la búsqueda de marcadores fiables, no invasivos, que impliquen una tecnología rápida y sencilla, sobre todo objetiva, marca claramente el camino a seguir.
29 Respiración ovocitaria / embrionaria: Futuro La combinación de las tasas de respiración con el análisis de la morfocinética embrionaria obtenida mediante un Time-lapse, más objetivo y veraz que la simple evaluación de la morfología convencional, aporta una información única a la hora de seleccionar embriones con el mayor potencial de implantación.
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