Guía de actividades. Trabajo colaborativo 2

Transcripción

1 1. Objetivo Guía de actividades Trabajo colaborativo 2 Familiarizar al estudiante con las herramientas bioinformáticas a través del desarrollo de ejercicios prácticos. 2. Actividades Investigadores que trabajan en interacción planta patógeno con enfermedades causados por el género Colletotrichum, han identificado al gen CgDN3 en Colletotrichum gloeosporioides como uno de los genes involucrados en patogenicidad. Teniendo en cuenta que a través del modelo de interacción planta patógeno Colletotrichum higginsianum- Arabidopsis thaliana, ha sido posible identificar posibles genes involucrados en el mismo fenómeno, los investigadores están interesados en saber si existe algún gen homologo en C. higginsianum. Tome como referencia el ejercicio realizado en la guía elaborada por Andrés M. Pinzón V., del Centro de Bioinformática del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, que se encuentra en la siguiente dirección: Recuperación de secuencias y alineamiento 1. Ingrese al NCBI haga la búsqueda del gen CgDN3, mencione que tipo de información hay disponible para este gen.

2 2. Obtenga la secuencia de nucleótidos del gen, en el formato FASTA, recuerde que necesitamos la secuencia codificante CDS.

3 3. Obtenga la secuencia de proteínas para la cual codifica este gen en formato FASTA (debe seleccionar protein y realizar el mismo procedimiento) 4. Con la secuencia de proteínas en formato FASTA realice una búsqueda a través de BLAST: para encontrar secuencias homólogas.

4

5 5. Mencione los tres primeros registros de genes homólogos encontrados y obtenga sus secuencias de nucleótidos y de proteínas. 6. Usando el programa clustal w, el cual encontrará en: realice un alineamiento, usando las secuencias de proteínas y nucleótidos que corresponden a los tres primeros registros de genes homólogos. Seleccione con que tipo de datos va a trabajar nucleótidos o proteínas. Copie cada de las secuencias en el espacio creado para este fin, recuerde que las secuencias deben estar en formato fasta. Use los parámetros que viene por default en el programa, para realizar el alineamiento. Imagen página de incio de clustalw para realizar el alineamiento

6 Seleccione DNA(para alineamiento de nucleótidos) Proteína (para alineamiento de proteínas) Copie cada una de las secuencias de nucleótidos o de proteínas en formato fasta Una vez haya ingresado las secuencias de click en submit para que el programa empiece a realizar el alineamiento 7. Por favor complete el siguiente cuadro para la realización de la práctica. Información disponible en NCBI de CgDN3 Secuencias de nucleótidos formato FASTA Secuencia de proteínas formato FASTA Imagen de la búsqueda realizada en BLAST Nombre los tres primeros registros con los que tiene homología CgDN3 Secuencias de nucleótidos de los tres primeros homólogos Secuencias de proteínas de los tres primeros homólogos

7 Alineamiento entre la secuencia CgDN3 y los tres primeros registros homólogos por clustal w Responda por favor estas preguntas: 8. Encuentra homólogos del gen CgDN3 de C. gloesporioides en C. higginsianum? Si es así menciónelo. 9. Al realizar un alineamiento (de proteínas) entre CgDN3 de C. gloesporioides en C. higginsianum, encuentra aminoácidos conservados, pegue la imagen del alineamiento y señale los aminoácidos conservados. 10. Si Usted encuentra un gen homologo de un a especie en otra, que podría asumir? 11. Que significado tiene el E-value? Diseño de primers. >Secuencia ejercicio GGGTGGGGTTGGTAAAACCACTCTTGCCCCACCTGTATTCAATGACCCAAGGATGGATAAGACTAAATTAG ATGTCAAAGCTTGGATTTGTGTTTCAGATGAATTTGATGTTTTCAAGGTATCAAGAGCAATTATTGAGCATG TTACTACAGCTACTAATGACAGAAGAGATACATAGATGGCTCACAAAAGATTGAAAGAAAAATTGATAGGA AAAAGTTTCTTCTTATTTTGGACGATGTTTGGAACGAAACCCAATTTAAACGGGAAGAAGTGCAGAAGCCCC TTGTTTTCGGAGTCCAAGGGAGTAGGATTCTTGTGACTACACACAGTCAGGAAGTTGTGTCTACCATGTGGT CAGAGGAACATTCCCTAAAGAAATTACAAGATGACTGTTGGAAGTTGTTTGCTAAACACACATTCTGAGATG ATAATACTTCACCAAATCAAGAGTGCAAGGAGATTGGCATGAAGATTGTTAAAAAATGTAAAGGACTACCT CTCTCCTTAAAAACAATGGGAAGTCAGTTATATAACAAATCATCTGTTTCAGAATGGCAAACCGTGTTCCAA AGAAAATAGAGTTGTAATATTATTCCCGCTTTAGCGCTTTAGCATTGAGCTATATCCACCTTCCTTCCCATAT GAAGGTATGTTTTACCAATCCCACCCATAAGGGCGAATTCGTTTAAACCTGCAGGACAAGTCCCTTTAGTGA GGGTAA 12. Identifique a que organismo pertenece esta secuencia de nucleótidos a través del NCBI y obtenga la secuencia de proteínas correspondiente. Teniendo en cuenta la conservación en la composición nucleotídica de los genes de resistencia de plantas a las enfermedades, los investigadores se encuentran interesados en hallar genes de resistencia en otras especies de plantas. Para esto deben amplificar a través de PCR el gen de interés, entonces inicialmente se requiere el diseño de primers que permitan amplificar esta región en otras especies. 13. Obtenga los primers que permitan alcanzar este objetivo a través de primer3, usando los parámetros que por default tiene esta herramienta. Usted podrá acceder a primer3 en la

8 siguiente dirección: Copie la secuencia en formato FASTA, asegúrese que product size range esté en blanco y de click en pick primers para enviar su solicitud. Copie la secuencia en formato FASTA Click para enviar solicitud product size range en blanco 14. Escriba los primers sugeridos por primer3 en dirección 5-3, ya que así es como se ordenan a las casas comerciales. Y describa cuantos nucleótidos tiene cada uno de los primers forward y reverse, y la temperatura de annealing (Tm) la cual será de utilidad para establecer las condiciones de PCR. Arbol filogenético Entre los genes de resistencia a enfermedades en plantas se encuentran los genes tipo NBS los cuales se pueden clasificar en TIR o NO TIR según sus dominios. Las siguientes son accesiones de seis diferentes genes de resistencia, obtenga las secuencias de nucleótidos y obtenga un árbol filogenético, usando un programa llamado MAFFT el cual puede encontrar online en la dirección: Las accesiones son : TIR: RPS4 (AJ243468), L6 (LUU27081), RPP1 (AF098962). NO TIR: Rp1 (AF107293), Xa1 (AB002266), I2 (AF004878).

9 Copie las secuencias en formato FASTA Click para enviar solicitud El programa inicialmente realizará un alineamiento y luego en la opción phylogenetic tree, obtendrá el árbol filogenético correspondiente a las secuencias de trabajo. Árbol filogenético (asegúrese de tener JAVA actualizado) 15. Completa la siguiente tabla con la información requerida Secuencias de nucleótidos formato FASTA Secuencia de proteínas formato FASTA Imagen del árbol filogenético

10 16. Que es una árbol filogenético? 17. Describa el árbol filogenético obtenido. 3. Recomendaciones Recuerde seguir las instrucciones dadas y revisar la rúbrica de evaluación para que pueda desarrollar exitosamente esta actividad. 4. Evaluación El trabajo debe cumplir con los requerimientos planteados en la guía de actividades y en la rúbrica.