PROGRAMA COMPUTACIONAL INTERACTIVO PARA LA ENSEÑANZA DE LAS BASES FISIOLÓGICAS DEL POTENCIAL DE MEMBRANA EN REPOSO *

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1 PROGRAMA COMPUTACIONAL INTERACTIVO PARA LA ENSEÑANZA DE LAS BASES FISIOLÓGICAS DEL POTENCIAL DE MEMBRANA EN REPOSO * EMILIO SALCEDA Y ENRIQUE SOTO UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA INSTITUTO DE FISIOLOGÍA Apartado Postal 406, Puebla, Pue., México. Resumen Se presenta un programa computacional interactivo que simula las condiciones bajo las cuales se genera el potencial de membrana en reposo. El programa permite al usuario cambiar las concentraciones intra y extracelulares de los iones sodio, potasio y cloro, así como los coeficientes de permeabilidad para esos iones y la temperatura a la cual se realiza el experimento; calcula el potencial de membrana en reposo de la célula y los potenciales de equilibrio para cada ion. Adicionalmente, permite fijar el voltaje de la célula, y realizar experimentos de variación contínua de alguno de los iones, presentando las curvas concentración-potencial de membrana y concentración-potencial de equilibrio resultantes. Introducción Ha sido generalmente aceptado que las simulaciones computacionales pueden hacer una contribución particularmente valiosa a la educación científica en los siguientes casos: 1) Situaciones en las que realizar un experimento convencional es extremadamente difícil o imposible; 2) Situaciones en las que los aparatos necesarios para llevar a cabo el experimento no se encuentran disponibles fácilmente, o son demasiado caros o complicados para su uso general.; 3) Situaciones en las que el trabajo experimental es peligroso o puede causar daños innecesarios, 4) Situaciones en las que un experimento convencional tardaría un tiempo inaceptablemente largo [1, 2] y 5) Situaciones en las que los beneficios esperados difícilmente justifican el sacrificio de un animal. El potencial de membrana en reposo es uno de los fenómenos básicos de la fisiología celular y su demostración experimental cumple con, al menos, tres de las condiciones citadas. Más aún, la comprensión de los fenómenos fisiológicos involucrados en la formación de una diferencia de potencial entre el interior y el exterior de las células en reposo es fundamental para entender los mecanismos electrofisiológicos responsables de la excitabilidad de neuronas y axones [3]. Es por ello que, hace algunos años, uno de nosotros presentó una simulación computacional * Un diskette con el programa se encuentra disponible para quien lo solicite a: Dr. Enrique Soto, Instituto de Fisiología, BUAP, 14 Sur 6301, CU. Fax: (2) o por esoto@siu.buap.mx

2 orientada a la enseñanza y el aprendizaje de los mecanismos de generación del potencial de membrana [4]. De entonces a la fecha, la computadora personal ha sido perfeccionada a tal grado que, en la actualidad, permite desarrollar programas con los que el usuario interactúa en forma más intuitiva a través de las llamadas Interfases Gráficas de Usuario. Estas nuevas capacidades de la computadora personal, aunadas al desarrollo de poderosas herramientas de programación, potencian el valor educativo de los programas de enseñanza, en general, y de las simulaciones, en particular, dotándolos de recursos como animación, voz, sonido y video, en un ambiente operativo amigable y fácil de aprender. Este artículo presenta un programa computacional interactivo que simula las condiciones bajo las cuales se genera el potencial de membrana en reposo. Como su predecesor, ha sido diseñado para usarse en cursos de fisiología como un complemento del estudio teórico y experimental de las bases iónicas del potencial de membrana. El programa permite al estudiante variar las concentraciones intra y extracelulares de los iones sodio, potasio y cloro, así como los coeficientes de permeabilidad para esos iones y la temperatura a la cual se realiza el experimento; calcula el potencial de membrana en reposo de la célula y los potenciales de equilibrio para cada ion. Adicionalmente, el usuario puede imponer un potencial de membrana a la célula (voltage clamp), y estudiar las fuerzas electroquímicas impulsoras resultantes, las cuales determinan los movimientos iónicos a través de la membrana bajo condiciones de fijación de voltaje (hemos decidido mantener este enfoque debido a que la información que proporciona se refiere más a los mecanismos básicos del equilibrio iónico a nivel celular que a la dinámica compleja de los canales y corrientes iónicas). Finalmente, el estudiante puede realizar experimentos de variación de la concentración de alguno de los iones y analizar las curvas concentración-potencial de membrana y concentración-potencial de equilibrio resultantes. Descripción del Programa El programa fue desarrollado en Visual Basic y requiere una computadora compatible con IBM, con procesador o superior, corriendo Microsoft Windows versión 3.1 o superior, 2 MB o más de memoria disponible, una unidad de discos de alta densidad, 700 KB de espacio disponible en el disco duro, monitor a color con resolución VGA o mayor y un ratón. Bases Fisiológicas Cuando se tienen dos soluciones con diferentes concentraciones de un ion, separadas por una membrana permeable a ese ion, éste tenderá a moverse siguiendo su gradiente de concentración. Sin embargo, el movimiento iónico establecerá una diferencia eléctrica entre las dos soluciones. El voltaje así instalado afectará también al movimiento del ion. La diferencia de potencial a través de la membrana, que es necesaria para contrarrestar la tendencia del ion a moverse siguiendo su gradiente de concentración constituye el llamado potencial de equilibrio para ese ion [3, 5, 6, 7] y puede ser calculada con la ecuación derivada en 1888 por el físico químico alemán Walter Nernst:

3 Figura 1. Bajo las condiciones especificadas en el panel superior derecho, se muestran, en los paneles inferior derecho y central, en forma numérica y gráfica, respectivamente, los potenciales de equilibrio para cada ion y el potencial de membrana resultante. En el panel inferior izquierdo, se muestra el esquema de una célula y tres vectores que representan las fuerzas impulsoras netas para el K +, Na + y Cl -. V eq?? RT ZF [X] ln [X] o i donde R es la constante general del estado gaseoso, T es la temperatura absoluta, Z es el número y polaridad de las cargas del ion, F es la constante de Faraday, [X] o es la concentración iónica extracelular y [X] i la concentración iónica intracelular. De acuerdo con esta ecuación, el potencial de equilibrio varía linealmente con la temperatura y logarítmicamente con la relación de concentraciones iónicas. Cuando el potencial de membrana alcanza el valor dado por la ecuación de Nernst para determinado ion, el flujo neto de éste a través de la membrana se hace igual a cero [5, 8]. Si la membrana es permeable a más de un ion, su potencial de reposo será determinado por la permeabilidad de la membrana para cada ion y por las concentraciones de los iones en solución. En estas condiciones, si conocemos las permeabilidades relativas de los iones, podemos calcular el potencial de membrana en reposo mediante la llamada ecuación de campo constante de Goldman, Hodgkin y Katz:

4 V m? RT ZF PNa[Na ] o + PK[K ] o + PCl[Cl ] i ln PNa[Na ] + PK[K ] + PCl[Cl ] i i o donde Px es la permeabilidad de la membrana para una especie iónica dada. Esta ecuación establece que entre mayores sean la concentración o la permeabilidad de una especie iónica particular, mayor será su papel en la determinación del potencial de membrana [6]. Éste valor de voltaje es aquel en el cual el flujo iónico en una dirección es contrarrestado por el que ocurre en dirección opuesta y, por tanto, no es generada ninguna corriente neta a través de la membrana [5, 8]. Operación del programa Con el objetivo de mantener el interés del estudiante, el programa hace un uso extenso de las capacidades gráficas de Windows, integrando en una interfase intuitiva y fácil de operar todos los elementos necesarios para el diseño de experimentos simulados de medición de Figura 2. Un aumento de 1000 veces en la permeabilidad para el Na + mueve el potencial de membrana de 80 a 6, alejándose del potencial de equilibrio para el K + y el Cl -. Estos iones tienden a atravesar la membrana celular en el sentido que marcan los vectores, en tanto que la tendencia del Na + a entrar en la célula disminuye, debido a que el potencial de membrana se ha aproximado al potencial de equilibrio para el Na +. Nótese que los potenciales de equilibrio no se modifican por los cambios en los coeficientes de permeabilidad. Comparar esta figura con la figura 1.

5 potenciales de membrana con microelectrodos. La simulación ha sido concebida como un ejercicio de laboratorio en que el estudiante puede manipular las condiciones bajo las cuales se realiza el experimento y analizar el resultado de tales manipulaciones en términos de su influencia sobre el potencial de membrana en reposo de una célula. Así, luego de empalar la célula por defecto, o de elegir una preparación de entre las tres suministradas por el programa (incluyendo la clásica del axón gigante de calamar), el usuario puede cambiar las concentraciones intra y extracelulares de Cl, Na + y K +, los coeficientes de permeabilidad de la membrana y la temperatura. Los resultados son presentados en la misma pantalla en forma gráfica y numérica (Figs. 1 y 2), e incluyen: 1) El potencial de membrana en reposo, 2) El potencial de equilibrio para cada ion y 3) Las tendencias a moverse de cada ion, representadas como vectores. Eligiendo de la barra de comandos la opción fijación de voltaje, el usuario puede imponer un potencial de membrana a la célula y estudiar las fuerzas electroquímicas impulsoras que determinan los movimientos iónicos a través de la membrana bajo las condiciones impuestas [9] (Fig. 3). Finalmente, eligiendo de la barra de comandos la opción variación contínua, el estudiante puede, dentro de los límites fijados por él mismo, incrementar o decrementar contínuamente la concentración de sólo un ión, con el objeto de graficar el potencial de membrana y el potencial de Figura 3. Experimento de fijación de voltaje. Las condiciones iniciales son las de la figura 1. La membrana ha sido fijada en 10mv, es decir, el potencial de membrana ha cambiado. Bajo estas condiciones, el Cl tiende a entrar, el K + a salir de la célula y la fuerza impulsora neta para el Na + se reduce. equilibrio contra la concentración de la especie iónica en estudio. El programa realiza

6 automáticamente todos los experimentos necesarios, construye la gráfica (estándar o semilogarítmica) y presenta una tabla con los datos generados de esta manera (Fig. 4). Opciones adicionales incluyen las posibilidades de guardar y recuperar experimentos en/de el disco y de consultar una lista de lecturas recomendadas. Una rutina de impresión permite tener acceso a la impresora en cualquier momento de la operación del programa. Resultados A continuación se ofrecen algunos ejemplos de los experimentos que pueden simularse con el programa. Las membranas celulares son normalmente muy permeables al K +, su permeabilidad al Cl es variable y su permeabilidad al sodio es generalmente muy baja. Por eso, el potencial de membrana calculado con la ecuación de Goldman suele tener un valor cercano al potencial de equilibrio para el potasio y muy lejano al del sodio. La figura 1 muestra una situación similar a la descrita, en la que el potencial de membrana es cercano a 80 mv. En vista de que este valor es muy cercano a los potenciales de equilibrio para el K + y el Cl, estos iones se encuentran casi en equilibrio. En cambio, el Na + tiende a entrar a la célula debido a la diferencia entre su potencial de equilibrio y el potencial de membrana celular. Si el coeficiente de permeabilidad para el sodio se incrementa 1000 veces, como se muestra en la figura 2, el potencial de membrana se mueve de 80 a 6, alejándose del potencial de equilibrio para el K + y el Cl. Por lo tanto, estos iones tienden a atravesar la membrana celular en el sentido que marcan los vectores. Como el potencial de membrana se ha aproximado al potencial de equilibrio para el Na +, la tendencia de este ion a entrar en la célula disminuye. Nótese que los potenciales de equilibrio no se modifican por los cambios en los coeficientes de permeabilidad. La figura 3 muestra el resultado de un experimento de fijación de voltaje. La condición inicial es la misma de la figura 1. La membrana ha sido fijada en 10 mv. Debido al cambio en el voltaje de la membrana, el K + y el Cl se alejan de su condición de equilibrio y se encuentran sujetos a grandes fuerzas que tienden a moverlos en el sentido que marcan los vectores. En contraste, las fuerzas a que se halla sujeto el Na + han disminuido. En la realidad, procedimientos experimentales de este tipo generan un flujo de iones a través de canales iónicos sensibles al voltaje; el flujo neto de cada especie iónica depende de las fuerzas a que está sujeta y de las permeabilidades de sus respectivos canales de membrana. [8, 9, 10] La figura 4 ilustra el resultado de variar la concentración extracelular de K +, de 1 a 500 mm. Como puede observarse, el potencial de membrana muestra una clara dependencia logarítmica de la concentración extracelular de K + [11, 12]. En la misma gráfica se muestra la relación del potencial de equilibrio del K + con la concentración extracelular del ion. Como puede observarse, esta relación exhibe un comportamiento lineal.

7 Figura 4. Experimento de variación contínua del K + extracelular. Se muestra, en escala semilogarítmica, el resultado de variar la concentración extracelular del K + de 1 a 500 mm, demostrándose un claro efecto despolarizante. En la gráfica se observan los resultados de computar tanto la ecuación de Goldman, Hodgkin y Katz, como la de Nernst. Esta última exhibe un comportamiento lineal. A la derecha, parte de los datos obtenidos de esta manera. Durante la ejecución del programa es posible consultar la totalidad de los datos. Conclusiones El entendimiento de la influencia que diversas condiciones iónicas y de permeabilidad de la membrana ejercen sobre la conducta eléctrica de una célula puede ser mejorado sustancialmente simplificando al máximo el número de factores que intervienen en la generación del fenómeno estudiado. Para ello, la simulación computacional es una herramienta que permite discernir con claridad aquellos parámetros que tienen un estricto significado fisiológico, de aquellos que pueden dificultar o, incluso, oscurecer la comprensión de fenómenos celulares básicos sujetos a la influencia de múltiples variables. Más aún, no siempre es posible lograr esta simplificación utilizando los métodos experimentales clásicos. Bajo estas condiciones, los programas de simulación constituyen cada vez más un instrumento pedagógico indispensable para la enseñanza de la fisiología celular.

8 El comportamiento electro-químico de las células y las bases fisiológicas que lo determinan son algo más complicados de lo que hemos considerado en nuestra simulación. En ella no hemos tomado en cuenta algunas variables que influyen sobre el potencial de membrana, como los mecanismos de transporte activo, los coeficientes de actividad de los iones intra y extracelulares, la influencia de otros iones, como el Ca 2+, etc. Creemos, sin embargo, que esta forma simplificada de modelar un fenómeno, permite al estudiante entender sus implicaciones básicas y lo prepara para abordar a profundidad sus complejidades. La simulación ha sido diseñada para concentrar la atención del estudiante en el fenómeno que se estudia, más que en la operación del programa. Ello se logra mediante una interfase de usuario que: 1) Permite un rápido aprendizaje del software y un manejo posterior sencillo, 2) Admite interrumpir funciones activadas y cancelar decisiones fácilmente y 3) Suministra un esquema bien estructurado basado en gráficas [13]. Por tanto, para operar este programa.no se requiere ningún conocimiento previo de computación Como su predecesor, este programa ha sido utilizado en cursos de fisiología de pregrado y posgrado y ha demostrado ser útil como complemento, e incluso como sustituto de los experimentos convencionales realizados en el laboratorio. Referencias 1 Ellington HI, Adinall E and Percival F: Games & Simulations in Science Education, Kogan Page Limited / Nichols Publishing, Co., New York, Lehman JD: Microcomputers simulations for the biology classroom, The Journal of Computers in Mathematics and Science Teaching, 4 (1983) Huguenard J and McCormick DA: Electrophysiology of the neuron: an interactive tutorial, Oxford University Press, New York, Soto E: Computer simulation for teaching membrane potential fundamentals, Int J Biomed Comput, 24 (1989) DeVoe RD and Maloney PC: Principles of cell homeostasis. In Medical Physiology (Ed: VB Mountcastle), CV Mosby Co., St. Louis, 1980, pp Koester J: Membrane potential. In Principles of Neural Science (Eds: ER Kandel, JH Schwartz and TM Jessell), Elsevier, New York, Shepherd GM: Neurobiology, Oxford University Press, New York, MacGregor RJ and Lewis ER: Neural Modeling, Plenum Press, New York, 1977.

9 9 Hille B: Ionic Channels of Excitable Membranes, Sinauer Associates Inc., Sunderland Massachusetts, Levitan IB and Kaczmarek LK: The Neuron: Cell and Molecular Biology, Oxford University Press, New York, Adrian RH: The effect of internal and external potassium concentration on the membrane potential of frog muscle, J Physiol. 133 (1956) Hodgkin AL and Horowicz P:The influence of potassium and chloride ions on the membrane potential of single muscle fibers, J Physiol. 148 (1959) Bödy R and Kaulich TW: Intuitive user interfaces (IUI): a CASE starting point for design and programming, Computer Methods and Programs in Biomedicine, 37 (1992)