MICROPROPAGACIÓN A PARTIR DE EMBRIONES CIGÓTICOS DE LA PAPAYA (Carica papaya L.) var. 'MARADOL ROJA'

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1 MICROPROPAGACIÓN A PARTIR DE EMBRIONES CIGÓTICOS DE LA PAPAYA (Carica papaya L.) var. 'MARADOL ROJA' Víctor R. Medero Vega*, Yanelis Bravo Corrales, Milagros Basail Pérez, Aymé Rayas Cabrera, Jorge López Torres, Arletys Santos Pino, Sergio Rodríguez Morales, Marlenys Torres Delgado, Carmen Pons Pérez, Wilfredo Caballero Álvarez y Jesús García Ruiz. Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT). *Autor para la correspondencia: vmedero@inivit.cu INTRODUCCIÓN En Cuba, los frutales constituyen cultivos de gran importancia y dentro de estos la papaya (Carica papaya L.) es una de las especies de gran interés para la alimentación humana, motivado por su alto contenido de proteínas y vitaminas en el fruto (Lima, 1991). Según Roque y Ardisana (2006), en este cultivo existe una necesidad de un suministro constante de semillas certificadas para mantener las plantaciones activas en condiciones de campo, pero la poca homogeneidad de las plantas en cuanto a la producción de los frutos elongata para la extracción de la semilla constituye el principal problema. Por lo que se hace necesario buscar nuevas alternativas para la multiplicación de este cultivo que posibilite la obtención de un método de propagación masiva in vitro para garantizar la multiplicación de plantas plus hermafrodita. Al respecto, el uso del cultivo de tejidos posibilita no sólo la propagación masiva de plantas a partir de meristemos, sino que permite el rescate de los embriones cigóticos, lo cual constituye una alternativa para la multiplicación de plantas hermafroditas elongatas y su propagación masiva para la extracción de semillas y la comercialización. Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó el presente trabajo con el objetivo de desarrollar un protocolo para la propagación in vitro a partir de embriones cigóticos de la variedad de papaya Maradol Roja de frutos de tipo elongata de plantas plus. MATERIALES Y MÉTODOS La presente investigación se realizó con la variedad de papaya Maradol Roja. Como material vegetal se emplearon embriones cigóticos inmaduros procedentes de frutos elongata de plantas plus sembradas en las áreas experimentales del INIVIT. Efecto del hipoclorito de sodio en la desinfección de los frutos Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 y 2,5%) durante 10 minutos. Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 20 tubos de cultivo. A los 20 días de la implantación se cuantificó el porcentaje de supervivencia. Establecimiento in vitro de los embriones cigóticos Para lograr el establecimiento in vitro se estudió el efecto de las concentraciones de las sales del medio de cultivo MS (100 y 50%), así como la concentración del yoduro de potasio (KI) (200 y 100%), según resultados obtenidos por Roque (2006), lo cual generó cuatro variantes de medios de cultivo. Además, para determinar el tipo de explante, se estudió la influencia de la forma en que se siembra el embrión cigótico en el medio de cultivo, donde se utilizaron siete variantes (semilla entera sin sarcotesta, endospermo entero, endospermo cortado por detrás, endospermo cortado por delante, embrión con cotiledones, embrión sin cotiledones y semilla entera sin sarcotesta). Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A los 30 días del subcultivo se evaluó el porcentaje de germinación en cada tratamiento.

2 Influencia de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la multiplicación Se utilizó el medio de cultivo MS y se estudió el efecto de diferentes concentraciones de las hormonas 6-Bencilaminopurina (6-BAP) (0,22 mg.l -1 ), Ácido Naftalen Acético (ANA) (0,05 mg.l - 1 ), Ácido Giberélico (AG 3 ) (0,5 y 1,0 mg.l -1 ) y sus combinaciones. Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 24 tubos de cultivo. A los 30 días del subcultivo se cuantificaron la presencia de callos basal, diámetro del callo, longitud de la plántula, número de tallos y de explantes finales. Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la elongación Teniendo en cuenta los resultados del experimento anterior, se estudió el efecto de otras concentraciones de 6-BAP (0,1 mg.l -1 ), ANA (0,1 mg.l -1 ) y del AG 3 (1,0 mg.l -1 ) y sus combinaciones. Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A los 30 días del subcultivo se evaluaron las variables siguientes: diámetro del callo y número de explantes de más de 2 cm de longitud. Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo sobre el enraizamiento Con el objetivo de lograr el enraizamiento de las plantas producidas in vitro de papaya como etapa esencial antes de la aclimatización ex vitro, se estudió el efecto de la concentración de las sales MS (100, 75 y 50%) y 2,0 mg.l -1 de Ácido Indol Butírico (AIB). Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A los 30 días del subcultivo se evaluó el porcentaje de formación de raíces. Respuesta de las plantas obtenidas en la fase de aclimatización En esta etapa se realizaron estudios sobre diferentes factores que influyen en la supervivencia de las plantas producidas in vitro, se experimentó el empleo de cobertores durante los primeros 15 días de aclimatización, para esto se utilizó un cobertor forrado con nylon transparente que permitió cubrir las bandejas recién plantadas. También se analizó el tamaño de las plantas producidas in vitro, donde se establecieron tres categorías: inferior a 2,5 cm, entre 2,5 y 3,9 cm e iguales o superiores a 4 cm. Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 70 plantas producidas in vitro. A los 15 días de cultivo se evaluó el porcentaje de supervivencia. Respuesta en campo de las plantas obtenidas in vitro Las plantas aclimatizadas fueron identificadas con un número en las bolsas para su monitoreo en campo y conocer su correspondencia con la copia dejada en el laboratorio. Las plántulas que alcanzaron una altura entre 15 y 20 cm fueron plantadas sobre un suelo Pardo mullido carbonatado (Hernández et al., 1999). Se le aplicaron las atenciones culturales recomendadas por el Instructivo técnico de la papaya (MINAG, 2011) y a los 60 días de la plantación se evaluó el número de plantas hermafroditas, teniendo en cuenta el tipo de flor. Análisis estadístico Se utilizó el paquete SPSS, versión Para los modelos paramétricos se realizó un análisis de varianza de clasificación simple y la comparación múltiple de medias según las dócimas de Tukey o Dunnett C. En los no paramétricos se empleó Kruskall-Wallis y Mann-Whitney para la comparación de medias de rango. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto del hipoclorito de sodio en la desinfección de los frutos Con el empleo de concentraciones de hipoclorito de sodio al 1% se alcanzaron los mayores porcentajes de supervivencia de las semillas cigóticas extraídas, sin diferencias estadísticas entre las concentraciones que variaron desde 1% hasta el 2,5%.

3 En este cultivo varios autores han empleado el hipoclorito de sodio para la desinfección de los brotes o yemas de plántulas en invernadero o de plantas de campo, con porcentajes diferentes en su utilización (Reuveni et al., 1990; Kataoka e Inove, 1991). Establecimiento in vitro de los embriones cigóticos Se encontraron diferencias altamente significativas entre las combinaciones estudiadas (tipo de explante-medio de cultivo) en cuanto al porcentaje de germinación donde la mejor respuesta (100% de germinación de los embriones cigóticos) se alcanzó con la variante (Embrión con cotiledones - Medio de cultivo formado por el 50% de las sales y el doble de la concentración de KI), así como la mejor respuesta cualitativa en cuanto al desarrollo de los embriones. Resulta importante definir el medio de cultivo y su suplemento para las diferentes fases del protocolo que permita la diferenciación de los meristemos (Alvarado, 1992 y Baca, 2002), quienes emplearon el medio de cultivo basal Murashige y Skoog (1962) con diferentes concentraciones de BAP, ANA, AIA, AG 3 y adenina. Influencia de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la multiplicación Un problema para la multiplicación in vitro de este cultivo lo constituye la formación de callos basales y su diámetro. El mejor resultado se alcanzó con el medio MS suplementado con 0,22 mg.l -1 de 6-BAP y 0,5 mg.l -1, al presentar el menor diámetro basal del callo (0,42 cm 2 ). Además, al evaluar otras variables se encontró que el mayor valor (5,6 explantes por explante inicial) se alcanzó con este mismo tratamiento (tabla 1). Los resultados alcanzados desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo coincidieron con la misma combinación de reguladores del crecimiento para la multiplicación in vitro de esta variedad. En otros trabajos realizados se plantea que con el suplemento de la riboflavina en los medios de cultivo a concentraciones entre 1,1 y 1,3 mg.l -1 se logra evitar la formación de callos en la base de las plantas in vitro (Gallardo et al., 2004). Tabla 1. Efecto de las combinaciones de reguladores del crecimiento sobre la longitud de la planta, número de tallos y número de explantes finales. Variables Tratamientos Longitud de la Explantes No. de tallos planta finales 6-BAP (0,22 mg.l -1 ), ANA (0,05 m g.l -1 ) 1,42 c 4,40 ab 4,40 b 6-BAP (0,22 mg.l -1 ) 1,68 bc 5,20 a 4,10 bc ANA (0,05 mg.l -1 ) 1,50 c 1,80 c 1,20 d 6-BAP (0,22 mg.l -1 ), AG 3 (0,5 mg.l -1 ), 1,53 c 5,00 ab 5,60 a 6-BAP (0,22 mg.l -1 ), AG 3 (1,0 mg.l -1 ) 2,17 ab 3,60 b 4,90 ab AG 3 (1,0 mg.l -1 ) 2,30 a 1,60 c 3,10 c ES ± 0,13* 0,37* 0,28* CV (%) 14,10 12,98 12,90 s con letras desiguales dentro de columna difieren para p < 0,05, según dócima de Dunnett C. Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la elongación La papaya se multiplica bien in vitro y con coeficientes aceptables, pero con tallos pequeños y de entrenudos cortos por lo que se requiere de una etapa o fase de elongación para incrementar su longitud como antesala al enraizamiento y salida para la fase de aclimatización. El diámetro de callo fue más alto (0,84 cm) en el tratamiento (T2) y con diferencias significativas respecto a la media más baja (0 cm) para el tratamiento (T4), que no formó callos (tabla 2). Además, el número de explantes de más de 2 cm de longitud fue mayor en los tratamientos (T3) y (T4) sin diferencias estadísticas y sí respecto a los tratamientos (T1) y (T2) donde ningún explante alcanzó más de 2,0 cm de longitud.

4 Tabla 2. Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre el diámetro de callo y número de explantes de más de 2 cm de longitud. No. de Explantes Diámetro del callo (cm) con más de 2 cm de Tratamientos longitud transformada transformada T1: 6-BAP (0,1 mg.l -1 ), ANA (0,1 mg.l -1 ) 0,68 1,06 ab 0,00 0,71 b T2: 6-BAP (0,1 mg.l -1 ) 0,84 1,15 a 0,00 0,71 b T3: 6-BAP (0,1 mg.l -1 ), AG 3 (1,0 mg.l -1 ) 0,14 0,78 bc 0,70 1,04 a T4: AG 3 (1,0 mg.l -1 ) 0,00 0,71 c 0,50 0,95 ab ES ± 0,04* 0,07* CV (%) 15,37 16,80 s con letras desiguales dentro de columna difieren para p < 0,05, según dócima de Dunnett C. En la Fig. 1 se puede observar la elongación de las vitroplantas y el poco callo basal formado. Otros autores, han alcanzado la elongación de las plantas in vitro con el suplemento al medio de cultivo de ácido giberélico (AG 3 ) en concentraciones entre 1,0 5,0 mg.l -1 durante 15 días de cultivo (Banerjee, 2002). También, se han obtenido plantas con un 92% de brotes alongados y altura entre los 3,0 a 3,8 cm (Posada, 2005). Figura 1. Elongación de las plantas producidas in vitro de papaya a los 30 días de cultivo. Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo sobre el enraizamiento En la tabla 3, se pueden apreciar los bajos porcentajes de enraizamiento que se obtienen con las tres variantes de medios de cultivo estudiadas. Las variantes con el 100 y 75% de las sales MS alcanzaron la mejor respuesta en el porcentaje de formación de raíces sin diferencias estadísticas entre ellos, pero sí con el resultado obtenido con 50% de las sales MS. Tabla 3. Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo de enraizamiento sobre el porcentaje de formación de raíces. Tratamientos Formación de raíces (%) de rangos Sales MS (100%) 15,32 9,63 a Sales MS (75%) 13,15 7,00 ab Sales MS (50%) 11,00 2,88 b KW = 7,17*

5 Otros autores, han encontrado que una concentración de 2,0 mg.l -1 de AIB induce las mejores respuestas in vitro para la formación de raíces tanto en medios de cultivo en estado líquido o gelificado (Roque et al., 2001; Posada et al., 2007). Respuesta de las plantas obtenidas en la fase de aclimatización Obtener un alto porcentaje de supervivencia es importante para reducir el costo de la producción de las plantas producidas in vitro (Vento et al., 1996) y garantizar el éxito en la aplicación del protocolo. Al respecto, con el empleo del cobertor (cámara húmeda) se incrementan los porcentajes de supervivencia hasta el 42,2% con relación a un 7,1% cuando no se aplicó el cobertor y con diferencias estadísticas significativas (tabla 4). Por lo tanto, en papaya resulta fundamental mantener una alta humedad relativa durante los primeros siete a diez días después del trasplante para lograr mayor éxito en la aclimatización. Tabla 4. Influencia del cobertor en la supervivencia de las plantas producidas in vitro. Tratamientos Supervivencia (%) de rangos Con cobertor 42,20 14,00 a Sin cobertor 7,10 5,00 b U de Mann-Whitney = 0,00** Para la respuesta combinada de calibre de las plantas producidas in vitro y el empleo del cobertor (tabla 5), el resultado fue significativamente superior para todas las variantes con cobertor y se logró hasta un 58,5% de supervivencia. Tabla 5. Efecto de la combinación cobertor-calibre en la supervivencia de las plantas producidas in vitro, en la fase de aclimatización. Tratamientos Supervivencia (%) de rangos Con cobertor- Calibre (1,5-2,4 cm) 24,70 11,00 a Con cobertor- Calibre (2,5-3,9 cm) 58,50 17,00 a Con cobertor- Calibre (Más de 4,0 cm) 43,30 14,00 a Sin cobertor- Calibre (1,5-2,4 cm) 4,70 2,83 b Sin cobertor- Calibre (2,5-3,9 cm) 10,43 8,00 b Sin cobertor- Calibre (Más de 4,0 cm) 6,16 4,17 b KW = 16,23** Posada et al., (2007) obtuvieron resultados similares, cuando transfirieron a la fase de aclimatización plantas con 3,0 cm de longitud, a los 60 días habían alcanzado una altura de cm y emitieron de 5-7 hojas, por lo que estaban listas para el transplante a condiciones de campo. La longitud de la plantas producidas in vitro es particularmente importante cuando se transfieren a la fase de aclimatización, ya que esta fase es considerada como la etapa más crítica en el proceso de propagación in vitro de especies como Carica papaya. Respuesta en campo de las plantas obtenidas in vitro El 61% de las plantas micropropagadas presentaron flores hermafroditas y en los tres lotes evaluados osciló este tipo de planta entre 56 y 68%. Esta respuesta coincide con la descrita para esta variedad (Rodríguez y Rodríguez, 2000), ya que al caracterizar la variedad 'Maradol Roja' desde el punto de vista sexual se plantea que debe presentar un 66,6% de plantas hermafroditas, 33,4% de femeninas y que en una plantación procedente de semillas básicas no deben aparecer plantas masculinas. Estos resultados son de vital importancia porque permiten definir en condiciones de campo las plantas que pueden producir los frutos aptos para la extracción de semillas y por lo tanto poder tomar la decisión de que líneas de plantas in vitro se van a multiplicar de forma masiva para producir un material de alta calidad fisiológica y fitosanitario porque estará libre de virus ya que el mismo no se trasmite por semilla.

6 REFERENCIAS Alvarado, M. Propagación vegetativa in vitro del papayo (Carica papaya L.). Tesis para optar por el Grado de Licenciado en Biología. Univ. Nac. Agraria La Molina. Lima, Perú. 60 p Baca, A. Optimización de la micropropagación in vitro de Carica papaya L. Tesis para optar por el Grado de Ingeniero Agrónomo. Univ. Nac. Agraria La Molina. Lima, Perú. 107 p Banerjee, J. Tissue culture and transformation studies in Indian cultivars of papaya (Carica papaya L.). Tesis para optar por el Grado de Doctor en Fisiología botánica. Universidad de Pune. India Gallardo, J.; Kosky, R.; Tejeda, M.; Posada, L.; Herrera, I.; Reyes, M.; García, L. y M. Freire. Empleo de secciones de tallo de plantas in vitro de papaya (híbrido IBP 42-99) para obtener callos con estructuras embriogénicas. Biotecnología Vegetal 4(4): , Hernández, A.; Pérez, J. M. y I. D. Bosch. Nueva versión de la clasificación genética de los suelos de Cuba. Instituto de Suelos. AGROINFOR, Ciudad de la Habana. 64p Kataoka, I. y H. Inove. Rooting of tissue cultured papaya shoots under ex vitro conditions. Japanese Journal of Tropical Agriculture. 35 (2): , Lima, H. Resultados obtenidos en las investigaciones de la Estación Nacional de frutales. Laboratorio de Cultivo in vitro y diagnóstico del Instituto de Investigaciones de cítricos y otros frutales. Laboratorio. Informe para presentar al Ministerio de la Agricultura. La Habana. pp , MINAG. Instructivo técnico del cultivo de la papaya (Carica papaya Lin), Murashige, T. y F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15: , Posada, L. Aplicaciones de la Biotecnología en la propagación de la papaya (Carica papaya Lin). Biotecnología Vegetal 5 (2): 67 79, Posada, P.; Kosky, G. y M. Reyes. Embriogénesis somática en Carica papaya L. var. Maradol rojo. Biotecnología Vegetal 7(3): , Reuveni, O. D.; Flinn, B.; Webb, D.; Webster, F. y B. Sutton. In vitro clonal propagation of dioecious Carica papaya L. Plan Cell Tissue and Organ Culture. 20(1): 41-46, Rodríguez, N. A. y Rodríguez A. El papayo Maradol: Un aporte cubano a la fruticultura tropical. Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical (INIFAT), Santiago de las Vegas. pp , Roque, A. L.; Herrera, E. A.; Vento, H. D. y L. P. Godoy. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y kinetina en el establecimiento in vitro de segmentos nodales de papaya (Carica papaya Lin.), cv. Maradol Rojo. Revista Scientia et Técnica. 17: , Roque, A. Y. Obtención de posturas de papaya (Carica papaya L.) cv. Maradol Roja por cultivo in vitro de segmentos nodales de plantas jóvenes. Disponible en Internet: Roque, A. Y. y E. H. Ardisana. Propagación in vitro de papaya (Carica papaya L.) cv. Maradol Roja: una alternativa para el desarrollo local de las provincias Habaneras. Memorias del I Encuentro Internacional de Desarrollo Agrario y Rural ISBN: , Vento, H. D.; Hernández, J. C. y B. Díaz. Cultivo de células, tejidos y órganos in vitro. Conferencia en la Universidad de Verano, Facultad de Agronomía, ISCAH. pp. 1-4, 1996.