CUARTA UNIDAD MICROPROPAGACIÓN DE VEGETALES

Transcripción

1 CUARTA UNIDAD MICROPROPAGACIÓN DE VEGETALES

2 NICROPROPAGACIÓN CONCEPTO Es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar vegetales asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar vegetales nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener vegetales libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de vegetales que no se propagan eficientemente.

3 PROPAGACIÓN DE VEGETALES POR CULTIVO IN VITRO El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de un vegetal y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo. La asepsia en cultivo in vitro Esta consiste eliminar todos los gérmenes, bacterias o virus en el laboratorio, en otras palabras es el control de todos los factores que afectan el crecimiento.

4 Condiciones de laboratorio Requieren condiciones de laboratorio que reúnan todos los factores ambientales de la planta en la naturaleza que técnicamente es muy complejo. El cultivo in vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante, conviene por tanto, conocer cuáles son los principales factores que deberían ser controladas.

5 La micropropagación o propagación clonal Es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones.

6 Factores que afectan el desarrollo del cultivo in vitro Ambiente químico. Composición medio de cultivo. Ph. Ambiente físico. Temperatura. luz y fotoperíodo. Humedad. del Fases o etapas del proceso de micropropagación 0: Selección y Preparación de la planta madre. 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas. 2: introducción del material seleccionado in vitro. 3: Multiplicación de brotes. 4: Enraizamiento. 5: Aclimatación

7 PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

8 DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL Trabajar en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Introducir en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad. Realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada. Lavar el material biológico con detergente y enjuagar para eliminar polvo, insectos etc. Mantener el material en un ambiente aséptico, donde se sumerge por unos minutos en etanol al 70%. Sumergir el material biológico en el agente desinfectante para eliminar los microorganismos. El tiempo de desinfestación es importante ya que si es prolongado puede dañar el tejido del inóculo y si es corta los microorganismos no serán removidos. Lavar el material biológico con agua destilada estéril para eliminar el agente desinfectante, el inóculo debe mantenerse en agua destilada hasta el momento de la siembra (2010).

9 INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

10 MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

11 ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas.

12 ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante.

13 Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro a) Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas Micropropagación de estaquillas. Organogénesis de callos b) Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas Cultivo de meristemos. Microinjerto in vitro c) Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro. f) Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc. g) Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados. h) Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas: Obtención rápida de homocigotos. Producción de híbridos (frutos puros). d) Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión. e) Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

14 Equipos necesarios para el cultivo in vitro Autoclave Cámara de flujo laminar. Medio de cultivo. Planta. Cámara de cultivo

15 Condiciones del cultivo in vitro En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas. El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre a las medias sustancias contaminantes para la planta. Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo. El ph ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5. Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%. El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento. El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo. En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales. Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta. En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

16 Subcultivos o replicado El medio nutritivo se agota y se seca. El material vegetal ocupa todo el tubo. Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas). El medio se hace líquido.

17 Fases del cultivo de meristemos a) Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm). b) Siembra en el medio del tubo. c) Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos. d) Fase de enraizamiento (cambiar el medio). e) Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc. f) Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero. g) Plantación en el campo.

18 Fases del cultivo de embriones a) Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea. b) Se coge el embrión de la semilla. c) Se inocula en el tubo. d) A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible. e) Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.

19 Micropropagación a) Se parte de una yema, de bráctea o axilar. b) Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo. c) Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas). d) El número de subcultivos depende del material vegetal. Ejemplo de micropropagación de Kiwi: Se parte de un trozo de tallo. Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote. En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes. Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio. Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas. Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

20 Cultivo de callo in vitro Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. El medio puede ser sólido o líquido. Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión. A partir de entonces se desarrolla normalmente.

21 Obtención de plantas haploides Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis. Embriogénesis: se forman células (poliembriones). Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide). No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.

22 Problemas en el cultivo in vitro La contaminación es el problema más grave en los cultivos in vitro, como en otras actividades del hombre y la mujer, de manera particular en la aplicación de la tecnología de micropropagación de las especies vegetales, que el ser humano lo necesita, para seguir alimentándose, industrializando las bondades de del reino vegetal. Vitrificación: es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.

23 III. CULTIVO IN VITRO CASERO Material del laboratorio FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo). Olla a presión. Guantes. Mascarilla de papel. Espátula. Bisturí. Mechero de alcohol. Soporte y rejilla. Varilla de vidrio. Pinzas metálicas. Trapo. Papel de aluminio (o papel film). Gasa estéril. Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas. Reactivos Lejía. Ácido clorhídrico. Hidróxido sódico. Lavajillas. MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1 litro) 100g de plátano maduro hecho puré o licuado. 10 g de agar-agar. 15 g de azúcar. 900 ml de agua destilada. 1,2 g Tiamina * Material biológico Cápsula semillas orquídea u otra semilla propagarse. de especies vegetales a