UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE AGRONOMIA. Trabajo Final para acceder al título de Técnico en Floricultura

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE AGRONOMIA Trabajo Final para acceder al título de Técnico en Floricultura Pasantía en Domesticación y Caracterización de Helechos nativos: el caso de Anemia phyllitidis Alumno: DESPERÉS, María Elina Director: CARDONE, Susana Codirectora: FACCIUTO, Gabriela Cátedra de Genética (FAUBA) Instituto de Floricultura INTA-Castelar Año 2010

2 Pasantía en el Instituto de Floricultura de INTA Castelar y la Cátedra de Genética (FAUBA) Capacitación en Domesticación y Caracterización de Helechos nativos: el caso de Anemia phyllitidis 2

3 Índice Resumen.... Pg. 4 Introducción. Pg. 4 Objetivo general.. Pg. 7 Objetivos específicos... Pg. 7 Justificación... Pg. 7 Materiales y Métodos Pg. 8 Resultados y Discusión... Pg.12 Conclusiones... Bibliografía... Anexo Pruebas estadísticas... Pg.31 Pg.32 Pg.33 3

4 Resumen Los arreglos florales llevan en su composición y diseño ramas de follaje verde como complemento ornamental. Entre ellas, los helechos cobran una importancia cada vez mayor. En la Argentina se han identificado algunos géneros de helechos nativos con pecíolos largos y frondes coriáceos, siendo ambas características adecuadas para este destino. El Instituto de Floricultura INTA estudia en la actualidad la potencialidad del género Anemia, un helecho de la familia de las Schizaeaceae, nativo de Misiones. Durante la pasantía se logró práctica en la caracterización y determinación taxonómica de especies de helechos y capacitación en técnicas de propagación y cultivo de dicho material vegetal. Por otro lado, el logro de los objetivos específicos permitió determinar que A. phyllitidis posee un ciclo de vida largo (7 meses para lograr plantas de 2 cm). Sus esporas podrían germinar y desarrollarse en un amplio rango de condiciones de luz y sustratos, sin embargo el desarrollo de esporofitos requiere luz máxima (2000 lux). Considerando la extensión del ciclo de vida de A. phyllitidis, las técnicas de cruzamiento con especies de crecimiento más rápido representa una perspectiva para futuros trabajo de investigación. Introducción Las plantas silvestres, nativas o autóctonas son las especies vegetales que crecen y se desarrollan sin la ayuda del hombre, en un hábitat natural. Muchas especies nativas presentan características muy valoradas por su floración, follaje y/o rusticidad para uso ornamental. En el caso de las plantas de uso ornamental, es creciente el interés en el desarrollo de técnicas de cultivo de especies que puedan enriquecer la oferta en el mercado y aportar una novedad por las características de su floración y/o follaje. Los follajes que acompañan los ramos florales, aportan estructura, textura, contraste y color a los arreglos. Los complementos aportan un toque de originalidad, atenúan determinados defectos, rellenan huecos o vacíos, añaden vistosos contrastes, mejoran el colorido, lo que se traduce en una mejora de la calidad del ramo de flor (González Benavente, García et al., 1998). Son variadas las especies utilizadas como verdes acompañantes, entre ellas, los Helechos. Los helechos pertenecen al grupo de las Pteridophytas que comprende a las plantas vasculares que se reproducen sólo por esporas ya que carecen de semillas, frutos y flores. El ciclo de vida de las Pteridophyta presenta alternancia de generaciones con fases independientes; una fase diploide llamada esporofítica y una fase haploide llamada gametofítica. En los helechos, el esporofito está más desarrollado que el gametofito y se encuentra diferenciado en raíces, tallos y hojas, con un sistema vascular simple. La fase esporofítica, que es perenne, se caracteriza porque conduce a la producción de esporas por meiosis a partir de células madres diploides. Las esporas se forman en el interior de estructuras denominadas esporangios y se distinguen según su simetría y ubicación en la tétrada. Hay esporas radiadas o triletes, con cicatriz en tres ramas y esporas bilaterales o monoletes con cicatriz única y linear (Cabrera, 1977). La mayor parte de los esporangios se forman a partir de las hojas fértiles y se ubican en el margen o sobre la cara abaxial. Pueden distribuirse por toda la superficie de la lámina o agruparse constituyendo los soros. Los soros son muy variables en su forma, 4

5 protección y posición en la lámina. La fase gametofítica representa la fase haploide de las Pteridófitas. Cuando la espora germina da origen al gametofito o prótalo. Los gametofitos pueden ser tuberosos, filamentosos o laminares, carecen de organización, son autótrofos, verdes y hacen fotosíntesis. La absorción y fijación al sustrato la cumplen los rizoides. En general los gametofitos son efímeros. (Cabrera 1977). El ciclo de vida de un helecho comienza cuando una espora germina y da origen a un gametofito llamado prótalo. Este es generalmente bisexual y está provisto tanto de anteridios (gametangios masculinos) que producen gametos flagelados (anterozoides); como de arquegonios (gametangios femeninos) que producen las gametas femeninas (oosferas). Los anterozoides se movilizan hasta los arquegonios y fecundan a las oosferas dando origen primero a un cigoto y luego a un esporofito (Fig. 1). Fig. 1 Ciclo de Vida de los helechos. a. La espora germina y da origen al gametofito haploide. b. el gametofito contiene las gametas femeninas u oosfera que al ser fecundada por un anterozoide da origen al cigoto 2n. c El cigoto da origen al esporofito 2n. En la actualidad el Helecho Sierra (Rumohra adiantiformis) es la especie que se comercializa en los mercados de Argentina, pero no se cultiva sino que se extrae de la naturaleza lo que puede causar el deterioro o la pérdida del recurso genético. Otros helechos nativos también tienen potencialidad ornamental. Conocer su propagación y su cultivo permite incrementar la variedad en la oferta de follajes verdes a la vez que minimiza el impacto ambiental que causa su extracción. El Grupo de Mejoramiento de plantas nativas, del Instituto de Floricultura de INTA Castelar, se encarga de cultivar especies recolectadas del territorio nacional y evaluar sus características fenotípicas, fenológicas, sus condiciones de cultivo y potencial ornamental y estudia, entre 5

6 otras, la potencialidad del género Anemia. La domesticación de plantas extraídas de su medio natural consiste en su adaptación a hábitats especiales creados por el hombre a los fines de su reproducción. En los helechos, la distinción para la ordenación sistemática entre las familias, se realiza en el esporofito porque los gametofitos o prótalos presentan escasas diferencias por lo que no pueden aprovecharse para este fin. (Strasburger 1997).Una primera división en los grupos está determinada por las características de los esporangios que son las cápsulas que contienen las esporas. Los helechos leptosporangiados caracterizados por esporangios con una pared de una sola capa de células, constituyen el grupo de mayor riqueza entre las Pteridófitas. Este grupo incluye unas diez familias, que son ordenadas según la disposición de los esporangios, agrupados o no en soros, y según la presencia ausencia y características de un anillo transversal que cumple la función de permitir la apertura del esporangio para la liberación de las esporas. El género Anemia de la familia de las Schizaeaceae, pertenece a la subclase de las leptosporangiadas caracterizada porque los esporangios derivan de una sola célula epidérmica (Strasburger, 1997). En la familia de Schizaeaceae los esporangios, marginales y sésiles, se abren por una fisura longitudinal provocada por un anillo transversal situado inmediatamente bajo el ápice. Las frondes tienen láminas en general divididas de acuerdo a un plan pinnado (Fig. 2). El género Anemia tiene amplia distribución en el Cono Sur. En la Argentina se encuentran siete especies en las provincias de Buenos Aires, Catamarca, Córdoba, Jujuy, La Rioja, Misiones, Salta, San Luis y Tucumán. Su hábitat natural corresponde al bosque caducifolio pedemontano y las selvas basales de las Provincias del Noroeste y la selva Misionera en el Nordeste (de la Sota 1969). 6

7 Objetivo general La capacitación se hará en torno a las actividades que se realizan en el Área de Domesticación y Caracterización de especies nativas, con especial énfasis en helechos, para adquirir las aptitudes en el manejo de técnicas de propagación y cultivo de especies que puedan tener interés en el mercado y que contribuyan a enriquecer la oferta de material de valor ornamental. Objetivos específicos 1. Clasificación taxonómica de materiales del género Anemia a partir de claves apropiadas. 2. Caracterización del ciclo de vida de A. phyllitidis. 3. Conocer las condiciones de germinación de esporas de A. phyllitidis y selección de un método de propagación y rustificación apropiado. 4. Ensayo preliminar de postcosecha de las frondes. El alcance de estos objetivos tiene la finalidad de contribuir al conocimiento que se tiene de esta especie y desarrollar técnicas de domesticación para su uso como follaje ornamental. Justificación El mercado de plantas ornamentales requiere una continua incorporación de especies que aporten novedad por las particularidades de su floración o follaje. En este sentido, los helechos tienen un enorme potencial como plantas ornamentales. Algunas especies que se comercializan en los mercados de Argentina, se extraen de la naturaleza lo que causa el deterioro o la pérdida de este recurso genético. Propagar y cultivar las especies nativas con atractivo ornamental permite minimizar el impacto que su extracción causa en los ambientes naturales. Además, la realización de la pasantía permitirá la capacitación de la pasante respecto del ejercicio profesional en los siguientes aspectos: -Práctica en los procedimientos para la propagación y cultivo de helechos en condiciones ambientales controladas. -Adiestramiento en el manejo del instrumental de laboratorio, la recolección de datos y su análisis. - Aprendizaje de tecnologías relativas a la propagación de plantas con la posibilidad de transferirlas al medio productivo. La pasantía en el Instituto de Floricultura conjuntamente con la Cátedra de Genética de la Facultad de Agronomía (UBA) favorece también la interacción entre las dos instituciones que realizan así colaboraciones, con beneficio mutuo, permitiendo que el pasante integre los conocimientos adquiridos en la Facultad con la práctica, desarrollando así nuevas capacidades. Asimismo y conjuntamente con el desarrollo de su trabajo de tesis, la alumna participa de actividades complementarias como seminarios, clases especiales y jornadas demostrativas. 7

8 Materiales y Métodos Se trabajó con dos entradas pertenecientes al género Anemia, materiales colectados en Apóstoles, Provincia de Misiones y en una localidad de la Provincia de Corrientes. Los ejemplares se encuentran en el invernáculo para Helechos del Instituto de Floricultura, INTA Castelar. Cada material está codificado indicando el año, mes, día y lugar de colección, datos que se vuelcan en una base de datos (BG-BASE). Cuando este material se sembró para su estudio, se lo codificó nuevamente asignándole un código de siembra que lo identifica en todo el proceso de cultivo. El material utilizado para esta pasantía tienen los siguientes códigos de colección: 1) G1, Código de siembra Lugar de colección: Parque Provincial de las Sierras. Apóstoles, Provincia de Misiones. Por el sendero de los Saltos, pasando el primer salto (Fig. 3 b) Localización en GPS: 27, Familia: Schizaeaceae Género: Anemia 2) A1, Código de siembra Lugar de colección: RP 212 a 10 km W RN 14, cerca del arroyo Doradito. Provincia de Corrientes (Fig. 3 a) Localización: GPS 26º Familia: Schizaeaceae Género: Anemia a b Fig. 3. a. Material colectado en Corrientes ( A1) b. Material colectado en Misiones ( G1). Frondes pinnadas (flechas) Se encuentran en cultivo en invernáculo adaptado para Helechos del Instituto de Floricultura, INTA Castelar (Fig.4). 8

9 Fig. 4. Invernáculo de Helechos. Instituto de Floricultura. INTA-Castelar - Para la identificación taxonómica del material se recurrió a la descripción propuesta por Strasburger (1997), y las Claves para helechos de Cabrera (1977) y de la Sota (1969). Se realizó la observación del material colectado que se encontraba en cultivo en el invernáculo y se fotografió en detalle una fronde fértil. Se analizó en lupa a 57 aumentos y se registró la morfología de los esporangios, su inserción, la forma del anillo apical, la apertura del esporangio y la liberación de las esporas. Se elaboró un registro fotográfico. - Para la determinación del Ciclo de Vida, a intervalos periódicos se evaluó el desarrollo de los materiales en los distintos tratamientos. Se tomó con aguja una muestra de la caja testigo, se colocó en un portaobjetos con unas gotas de agua destilada para asegurar que la muestra pase de la aguja al porta objetos. Se colocó un cubre objetos de 26 x 60 mm (photo-glass) y se observó en lupa y microscopio el estado de desarrollo de la espora germinada, desarrollo del rizoide, la fase filamentosa y la aparición de cloroplastidios. Se realizó un registro fotográfico. - Para conocer las condiciones de germinación de esporas de Anemia sp se utilizó el material colectado en la Provincia de Misiones, que se encuentra depositado en el Invernáculo 21 del Instituto de Floricultura INTA Castelar. Se cosecharon las frondes y se almacenaron en bolsas de papel a temperatura ambiente hasta la liberación de esporas. Estas se recogieron y pasaron por un tamiz de 53 µm de apertura para eliminar los restos de esporangios. Se pesaron alícuotas de 0,021 gramos en balanza de precisión EXPLORER OHAUS a fin de sembrar la misma cantidad de esporas en las cajas de siembra. La siembra se realizó en cajas plásticas de tapa hermética de 250 cm 3 de capacidad. Se consideraron cuatro tratamientos evaluando dos sustratos y dos condiciones de luz con tres repeticiones para cada tratamiento. T1: Turba y luz (2000 lux) T2: Turba y saram del 50% (1000 lux) T3: Turba y vermiculita 1:1 y luz (2000 lux) T4: Turba y vermiculita 1:1 y saram 50% (1000 lux) 9

10 El sustrato a utilizar se pasó por tamiz ITOH Electromagnetic SIFTER MS-200 de 1 mm y 500 micrones. Se colocaron 200 ml de sustrato tamizado y humedecido con 100 ml de agua destilada en cada recipiente. Realizada la siembra se las llevó a cámara de cultivo con 18 horas de luz y 25 C ±2. Se utilizó Turba Klasman-Deilmann 150L Dynamics y Vermiculita Intersu Mediano clasificado Aislatex S.A. La eficiencia de los distintos tratamientos empleados para la germinación de las esporas se midió, a través de las esporas germinadas, en cada uno a los 7, 14 y 21 días de la siembra. Para este fin se tomaron seis fotografías por cada una de las repeticiones de cada tratamiento (al menos 18 fotografías por tratamiento), con cámara OLYMPUS SZX9, a 40 aumentos. Para una mejor distribución de las fotografías en cada repetición, se utilizó una plantilla cuadriculada para marcar la posición de las mismas. Las imágenes se analizaron con el programa Image Tool. A fin de comparar los distintos tratamientos se realizó un análisis de varianza no paramétrico (Prueba de Kruskal Wallis) con el paquete estadístico Infostat. Las pruebas estadísticas que presentaron valores p<0,05 fueron consideradas como estadísticamente significativas. - Para conocer las condiciones de crecimiento y rustificación de esporofitos, se repicaron en isleta a los 70 días; mediante pinza se tomaron de las cajas de siembra porciones de esporofitos de 2cm x 2cm y se pasaron a cajas similares con un sustrato conformado por una mezcla de turba, pinocha, resaca y corteza de pino compostada, para permitir un mejor desarrollo de los esporofitos (Fig. 5). Se ensayaron dos tratamientos: T1: intensidad de iluminación de 2000 lux. Se colocaron las cajas en cámara de cultivo T2: intensidad de iluminación de 1000 lux. Se colocaron las cajas en cámara de cultivo y se cubrieron con una media sombra del 50% Fig. 5. Repicado de prótalos de Anemia phyllitidis. 10

11 A los 189 días de la siembra los prótalos fecundados desarrollaron los esporofitos, los cuales al alcanzar un tamaño de 2 cm de alto fueron repicados en bandeja alveolada de 135 celdas, utilizando similar sustrato al primer repique. La bandeja fue dividida en 5 partes, permitiendo organizar el material en 3 bandejas de 20 celdas y 2 bandejas de 22 celdas (Fig. 6). Los esporofitos se aclimataron en invernáculo en ambiente humedecido con sistema de Mist (Fig. 7), en bolsas de polietileno transparente cerradas, que se fueron abriendo paulatinamente. Se evaluó la cantidad de esporofitos rustificados por tratamiento. Fig. 6. Repicado de esporofitos para su rustificación. Fig.7. Invernáculo con Mist. 11

12 Resultados y Discusión 1. Determinación de la taxonomía del material En la familia de las Schizaeaceae, los esporangios se ubican en el margen de la hoja, son sésiles y se abren por una fisura longitudinal provocada por un anillo transversal situado bajo el ápice (Fig. 8 y 9). Esta familia comprende los géneros Schizaea con hojas dicotómicas graminoides, Lygodium con hojas volubles y Anemia con hojas pinnadas, con el par inferior de pinnas fértil (Fig. 10) (Strasburger, 1997). Por poseer esporangios que no forman soros, con anillo subapical completo se identificó al material estudiado en este trabajo en la familia de las Schizaeaceae. Fig. 8. Esporangios de Anemia phyllitidis. a. esporangios sésiles. b. anillo transversal subapical (flecha). c. apertura longitudinal del esporangio. d. liberación de esporas. 12

13 a b Fig. 9. Esporangios de Anemia phyllitidis. a. Vista superior del anillo subapical (flechas). b. anillo abierto y liberación de esporas (flecha). Fig. 10. Anemia phyllitidis Fronde pinnada con último par de pinnas basales fértiles. Cabrera (1977) describe al género Anemia, como plantas terrestres, de frondes con láminas pinnadas, donde las pinnas basales fértiles presentan tejido foliar notablemente reducido (Fig. 11). Esporangios en dos hileras (Fig. 12) con esporas triletes o sea, con cicatriz en tres ramas. Las esporas se presentan con crestas angostas y ornamentadas con papilas o espinas (Fig. 11). Por el plan pinnado de sus frondes y presentar el par de pinas basales fértiles con tejido foliar reducido y esporas con ornamento se lo identificó como género Anemia. Este autor distingue las especies con láminas simplemente pinnadas y con esporas con espinas o papilas de aquellas con láminas bipinnadas y esporas sin ornamento. En el primer caso se ubica a A. phyllitidis y en el segundo a A. herzogii. Describe a A. phillitidis como plantas con frondes de hasta 70 cm de largo, en general mayores de 30 cm. Las frondes estériles son siempre menores. Pinnas fértiles aproximadas a las estériles y sobrepasando la longitud de la lámina y esporas con crestas angostas y ornamentadas con papilas. 13

14 a b Fig 11. Anemia phyllitidis a. Detalle pinna fértil y esporangios. b. Detalle de esporangios sésiles y tejido foliar reducido (flecha). Fig. 12. Anemia phyllitidis. Detalle del tejido foliar reducido (flecha) de la pinna fértil que sostiene los esporangios. 14

15 Fig. 13. Espora trilete de Anemia phyllitidis. a. cicatriz en tres ramas. b. ornamento. La clave para especies utilizada por de la Sota (1969) presenta dos grupos, el primero con láminas simplemente pinnadas (Fig. 14), y el segundo con láminas pinnado-pinnatifidas a tripinnadas. El material analizado posee las características del primero. Para el primer grupo las opciones son pinnas con nervadura media bien desarrollada llegando hasta el ápice y pinnas sin una verdadera nervadura media. El material presenta nervadura media bien desarrollada llegando hasta el ápice (Fig. 15). Las plantas con estos caracteres pueden ser mayores a 30 cm o sensiblemente menores (54 a 25 cm). El material tiene una dimensión superior a los 30 cm lo que corresponde a A. phyllitidis. Para dimensiones menores corresponde A. phyllitidis var. tweedieana. Por el tamaño de la planta (mayor a 50 cm) y presentar frondes fértiles con pocas pinnas y nervadura media robusta llegando hasta el ápice, se la identificó como A. phyllitidis. Cabe aclarar que la determinación de la especie es coincidente con las características utilizadas para la clasificación en ambas claves. 15

16 a b Fig. 14. Anemia phyllitidis a. Hojas simplemente pinnadas. b. Vista del par inferior de pinnas fértiles. a b Fig. 15. Fronde estéril de Anemia phyllitidis. a. Pinnas estériles aovado - oblongo - lanceoladas. b. Nervadura media bien desarrollada (flecha). 16

17 2. Caracterización del ciclo de vida de A. phyllitidis. a. Germinación de esporas A los siete días se observó la germinación de las esporas en todas las cajas. Se observó en microscopio la morfología exterior de la espora. Son esporas trilete, de color pardo y presentan ornamento (Fig. 16). Fig. 16. Espora de Anemia phyllitidis Cuando la espora germina da origen al gametofito o prótalo, que representa la fase haploide (Cabrera, 1977). En las primeras fases se observa el alargamiento de una célula rizoidal primaria y de la célula protálica que posee cloroplastos. En las figuras 17 y 18 se observa las etapas de la aparición de las primeras células y el alargamiento de la célula protálica hasta formar un filamento (Fig. 18 d). 17

18 a b c d Fig. 17. Germinación de espora de Anemia phyllitidis. a. Espora con ornamento b. Aparición de primera célula. c. Alargamiento de la primera célula.d. Filamento y rizoide. Se conserva la cubierta de la espora. a c b d Fig. 18. a. Espora trilete. b. Espora germinada con filamento germinativo con cloroplastos. c. Espora germinada con filamento y rizoide. d. Desarrollo del filamento que mantiene la cubierta esporal. 18

19 Fase filamentosa La germinación de la espora forma un filamento germinal de unas cuantas células. A los 21 días se observan diferentes grados de desarrollo del filamento (Figs. 19 y 20). Fig. 19. Desarrollo del filamento de Anemia phyllitidis tomado en microscopio óptico. La célula apical se divide dando origen a una lámina. Fig. 20. Desarrollo de filamentos en esporas germinadas de Anemia phyllitidis tomado in vivo. 19

20 Fase laminar Una vez formado el filamento, la célula apical experimenta divisiones que dan origen a una lámina (Fig. 21) en cuyo borde aparecen pelos unicelulares (Fig. 22). Fig. 21. Desarrollo de lámina y rizoides (flechas) en Anemia phyllitidis. Fig. 22. Pelos unicelulares (flechas) en el borde de la lámina de Anemia phyllitidis. 20

21 A los 112 días se observó el prótalo inmaduro y el desarrollo de una escotadura lateral que crece dando forma acorazonada al prótalo. (Fig. 23). Las células del prótalo poseen gran cantidad de cloroplastos. También se desarrollan numerosos rizoides. Cerca de la escotadura se forman las estructuras reproductivas masculinas y femeninas (anteridios y arquegonios) (Fig. 24). Fig. 23. Prótalo inmaduro de Anemia phyllitidis. Formación de escotadura lateral y su desarrollo (flechas). 21

22 a b Fig. 24. Maduración del prótalo de Anemia phyllitidis. Aparición de estructuras reproductivas. a. anteridios y b. arquegonios. El prótalo, al alcanzar la madurez, presenta forma cordada, con dos alas simétricas y gran cantidad de rizoides (Fig. 25). 22

23 a b c c Fig. 25. Prótalo maduro de Anemia phyllitidis. a. Vista en lupa frente. b. Vista en lupa lateral. Rizoides (flecha). c. Prótalo en forma cordada vista in vivo. A los 133 días se observó el primer esporofito que surge del prótalo. Se produjo la fecundación y el crecimiento de la plántula 2 n (Fig. 26). a b II I c d Fig. 26. Esporofito de Anemia phyllitidis. a y b prótalo y esporofitos (flecha). c. Detalle del brote del esporofito joven (I) en prótalo (II). d. Detalle de pelos en la hoja del esporofilo joven. 23

24 Los esporofitos desarrollan hojas enteras que presentan pelos en su superficie (Fig. 27). a b Fig. 27. Anemia phyllitidis. a. Brote de esporofilo vista lateral. b. hoja expandida. El ciclo precedente se resume en la Figura 28 y se registró en 203 días hasta llegar a plantas de 2 cm de altura. Fig. 28. Ciclo de vida de Anemia phyllitidis. 24

25 3. Conocer las condiciones de germinación de esporas de A. phyllitidis y selección de un método de propagación apropiado. - Germinación de esporas: La eficiencia de los tratamientos para germinación de las esporas se evaluó teniendo en cuenta la cantidad de esporas germinadas en cada uno, en los diferentes estadios. No existieron diferencias significativas entre tratamientos los 7 y a los 21 días (Tablas 1 y 3). Sin embargo se encontraron diferencias significativas entre tratamientos a los 14 días (Tabla 2). Los análisis estadísticos detallados se presentan en el anexo. Tabla 1: Esporas germinadas en los distintos tratamientos a los 7 días Tratamiento Medias Medianas N p = 0, T 100%luz T 50% luz T-V 100% luz 4 T-V 50% luz Tabla 2: Esporas germinadas en los distintos tratamientos a los 14 días p = 0,0004 Tratamiento Medias Medianas N Comparaciones 1 T 100%luz A B 2 T 50% luz C 3 T-V 100% luz A 4 T-V 50% luz B C Tabla 3: Esporas germinadas en los distintos tratamientos a los 21 días Tratamiento Medias Medianas N p = 0, T 100%luz T 50% luz T-V 100% luz T-V 50% luz Letras distintas indican diferencias significativas (p<= 0,05) Es de destacar que a los 14 días las esporas ya habían desarrollado un filamento compuesto por varias células y a los 21 días presentaban un desarrollo laminar. 25

26 En la Figura 29 se muestran conjuntamente las medias de esporas, filamentos y láminas, para los cuatro tratamientos a los 7, 14 y 21 días. Esto permitiría inferir que las esporas podrían germinar y desarrollarse en un amplio rango de condiciones de luz y sustratos durante estos estadios, versatilidad que no se registró durante el período de rustificación, en el cual el número de plantas varió ampliamente en condiciones de 2000 lux (104 plantas) versus 1000 lux (17 plantas). Fig. 29. Promedios de esporas, filamentos y láminas para los cuatro tratamientos a los 7, 14 y 21 días. En las Figuras 30 y 31 se observa la germinación de las esporas y el desarrollo de filamentos y láminas en cada tratamiento. 26

27 a b c d e f Fig. 30. Germinación de esporas y desarrollo de filamentos y láminas de Anemia phyllitidis en condiciones de 2000 lux. a. Esporas germinadas a los 7 días de la siembra, Tratamiento 1. b. Esporas germinadas a los 7 días de la siembra, Tratamiento 3. c. Desarrollo de filamentos a los 14 días de la siembra, Tratamiento 1. d. Desarrollo de filamentos a los 14 días de la siembra, Tratamiento 3. e. Desarrollo de prótalos a los 21 días de la siembra, Tratamiento 1. f. Desarrollo de prótalos a los 21 días de la siembra, Tratamiento 3. 27

28 a b c d e f Fig. 31. Germinación de esporas y desarrollo de filamentos y filamentos de Anemia phyllitidis en condiciones de 1000 lux. a. Esporas germinadas a los 7 días de la siembra, Tratamiento 2. b. Esporas germinadas a los 7 días de la siembra, Tratamiento 4. c. Desarrollo de filamentos a los 14 días de la siembra, Tratamiento 2. d. Desarrollo de filamentos a los 14 días de la siembra, Tratamiento 4. e. Desarrollo de prótalos a los 21 días de la siembra, Tratamiento 2. f. Desarrollo de prótalos a los 21 días de la siembra, Tratamiento 4. 28

29 - Rustificación de esporofitos y selección de método de propagación adecuado: A los 77 días los prótalos sembrados en la mezcla de turba con vermiculita y con 2000 lux presentaron un estadio más avanzado de crecimiento (Fig. 32). a b Fig. 32. Prótalos de Anemia phyllitidis a los 77 días de la siembra en condiciones de 2000 lux, tomado en lupa a 20 aumentos. a. En sustrato 100% turba. b. En sustrato 50% turba +50% vermiculita. Los esporofitos del tratamiento 2000 lux presentaron, a los 189 días de la siembra, un tamaño uniforme de 2 cm de alto. Luego de ser repicados en bandeja alveolada de 135 celdas se obtuvieron de este tratamiento 104 plantas. En cambio, el tratamiento de 1000 lux presentó al mismo período 17 plantas que no habían alcanzado los 2 cm de altura (Fig. 33), por lo que no se realizó repique. Este último tratamiento mostró poca uniformidad en el crecimiento de las plantas, presentando diferencias de desarrollo, lo que no resulta favorable para realizar prácticas de repicado en condiciones de cultivo comercial. 29

30 a b Fig. 33. Crecimiento de esporofitos. a Con 2000 lux. b. Con 1000 lux. a b b Fig. 34. Anemia phyllitidis. Etapa de rustificación a los 7 días de trasplante. a. Plántula. b. Detalle del brote del esporofito. Una repetición del tratamiento con fecha dio resultados similares. La caja con tratamiento luz muestra mayor cantidad de plántulas con mayor tamaño. La caja con tratamiento media sombra posee menos plantas con menor tamaño y poca homogeneidad de tamaño entre plántulas. A los 203 días se retiró de la cámara de crecimiento y se pasó a invernáculo con sistema de Mist para su rustificación. El aspecto de las plántulas se observa en la Figura

31 Fig. 35. Esporofitos de Anemia phyllitidis a los 203 días. 4.- Evaluación preliminar de postcosecha de frondes. Esta etapa del proyecto no pudo concretarse hasta ahora debido al lento crecimiento material que no desarrolló una cantidad suficiente de frondes como para poder realizar este ensayo. Con los resultados de la etapa de rustificación se espera conseguir un lote de plantas que permita, en el futuro, avanzar con esta evaluación. Conclusiones El desarrollo de este trabajo permitió a la pasante: - Obtener práctica en la caracterización y determinación taxonómica de especies de helechos y capacitarse en técnicas de propagación y cultivo de dicho material vegetal, en el ámbito del laboratorio y en las tareas propias del trabajo en invernáculo. - Lograr entrenamiento en el manejo de instrumental de laboratorio como lupas, microscopios, cámara digital, tamizadora y balanza de precisión. - Adquirir habilidades y destrezas para la toma y el análisis de los datos, como también en lo referido a la búsqueda, interpretación y discusión del material bibliográfico. Con el cumplimiento de los objetivos específicos se contribuyó a aumentar el conocimiento sobre el ciclo de vida y las condiciones de cultivo de A. phyllitidis, que se resumen a continuación: A. phyllitidis posee un ciclo de vida largo (7 meses para lograr plantas de 2 cm), característica no favorable para la producción comercial. Sus esporas podrían germinar y desarrollarse en un amplio rango de condiciones de luz y sustratos. Sin embargo la rustificación de esporofitos requiere luz máxima (2000 lux). Al ser un helecho de lento crecimiento no pudo realizarse el ensayo postcosecha con el material obtenido. Perspectivas Con el lote de plantas obtenidas se podrán realizar nuevos ensayos. Considerando la extensión 31

32 del ciclo de vida de A. phyllitidis, las técnicas de cruzamiento con especies de crecimiento más rápido representa una perspectiva para futuros trabajo de investigación. Bibliografía Cabrera, A. L Flora de la Provincia de Jujuy. República Argentina. Parte II, Pteridófitas. Colección Científica de INTA de la Sota, E. R. y Mickel J. T Sinopsis de las Especies Argentinas del Género Anemia (Schizaeaceae). En Revista del Museo de La Plata, Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales del Museo de La Plata. Botánica N 61. Tomo XI. Escamilla-Aquino, A.M. Arreguín Sánchez, M.L. Fernández Nava, R Ciclos Biológicos de Anemia muenchii Christ (Schizaeceaepteridophyta) y Pityrogramma calomelanos (Adiantaceae-Pteridophyta). Polibotánica Gabriel y Galán, J. M. Prada, C. Rolleri, C.H. Germinación de la Espora, Morfología del Gametofito y Expresión Sexual de Polypodium feuillei Bertero (Polypodiaceae). Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense, Madrid, España. González Benavente-García, A.; Bañón Arias, S.; Fernández Hernández, J. A Cultivos ornamentales para complementos del ramo de flor, Ediciones Mundi Prensa. Nester, J.E. y Coolbaugh, R Factors influencing sporegermination and Early Gametophyte Development in Anemia mexicana and Anemia phyllitidis. Plant Physiol. 82, Nester, J.E. y Schedlbauer, M.D Gametophyte Development in Anemia mexicana Klotzsch. Bot.Gaz.. 142(2): Nondorf, Sarah L., Dooley Melissa A., Palmieri, María, and Swatzell Lucinda J The Effects of ph, Temperature, Light Intensity, Light Quality, and Moisture Levels on Spore Germination in Cheilanthes feei of Southeast Missouri. American Fern Journal 93(2): Perez García, B., Mendoza A., Reyes Jaramillo, I. y Riba, R., 2000, Morfogénesis de la fase sexual de seis especies mexicanas del género Dryopteris (Dryopteridaceae). Rev. Biol. Tropical. V. 19, n.1, mar Strasburguer, E En: Tratado de Botánica Editorial Marin. Barcelona. Voeller, B.R. y Weinberg, E.S External Factors Inducing Germination on Fern Spores. Amer. Fern J. 59(4): Zuloaga, F. y Morrone, O Catálogo de las Plantas Vasculares del Cono Sur. Vol. 1. Pteridophytas, Gimnospermeae y Monocotyledoneae. Zuloaga, Morrone y Belgrano Eds. 32

33 Anexo Pruebas Estadísticas Shapiro-Wilks (modificado) para 7 días Variable n Media D.E. W* p (una cola) esporas germinadas ,69 50,99 0,83 <0,0001 Los datos no cumplen con los requisitos para el ANOVA. Se hace entonces un ANOVA no paramétrico. Prueba de Kruskal Wallis para 7 días Variable Tratamiento N Medias D.E. Medianas H p esporas germinadas ,22 61,11 72,00 6,96 0,0731 esporas germinadas ,22 32,49 63,00 esporas germinadas ,33 29,58 58,00 esporas germinadas ,00 63,92 80,00 Los tratamientos no presentan diferencias significativas en cuanto a su capacidad de germinación de esporas a los 7 días. Esporas germinadas en los diferentes tratamientos a los 7 días Número de esporas germinadas 170,47 134,40 98,34 62,27 26, Tratam iento Se marca en el Gráfico el desvío standard 33

34 Shapiro-Wilks (modificado) para 14 días Variable n Media D.E. W* p (una cola) Esporas 14 días 72 68,40 33,20 0,94 0,0061 Idem 14 días Prueba de Kruskal Wallis (14 días) Variable Tratamiento N Medias D.E. Medianas H p Esporas 14 días ,78 23,47 58,50 18,29 0,0004 Esporas 14 días ,44 32,10 99,00 Esporas 14 días ,89 16,61 50,50 Esporas 14 días ,50 38,46 75,50 Trat. Ranks 3 24,03 A 1 29,81 A B 4 40,56 B C 2 51,61 C Letras distintas indican diferencias significativas (p<= 0,05) Estadío de filamento en los diferentes tratamientos a los 14 días Número de esporas germinada s 130,26 104,34 78,42 52,49 26, Tratamiento Se marca en el Gráfico el desvío standard Shapiro-Wilks (modificado) para fase espatular Variable n Media D.E. W* p (una cola) En fase espatular 72 75,42 25,81 0,95 0,0595 Hay normalidad entonces ANOVA 34

35 Análisis de la varianza Variable N R² R² Aj CV En fase espatular 72 0,11 0,07 33,06 Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 5029, ,35 2,70 0,0527 Tratamiento 5029, ,35 2,70 0,0527 Error 42280, ,77 Total 47309,50 71 Esporofitos en fase espatular en los diferentes tratamientos a los 21 días 117,00 Número de esporofitos 97,25 77,51 57,77 38, Trata mien to Se marca en el Gráfico el desvío Standard. 35